方法論記事

サイズとパターンの柔軟性を備えた標準的な 6 ウェルプレートにおける血管透過性をモデル化するためのハイスループットバイオプリンティング法

DOI：

10.3791/66676

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2024年8月16日

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1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、Vessels-on-a-Plate(VOP)と呼ばれる3Dバイオプリンティング技術を使用して、標準的な6ウェルプレート上で柔軟なサイズと目的のパターンを持つ血管チャネルのハイスループット生産のためのプロトコルを提示します。このプラットフォームは、内皮の障害に関連する疾患の治療法の開発を進める可能性を秘めています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管透過性は、冠動脈の内皮機能障害や血液脳関門の機能障害など、内皮の障害に関連する疾患の治療法を開発する上で重要な要素です。既存の製造技術では、人体の血管網の幾何学的変化を適切に再現しておらず、これが疾患の進行に大きく影響します。さらに、これらの手法には、薬理学的試験に必要なハイスループット生産を妨げる多段階の製造プロセスが含まれることがよくあります。この論文では、標準的な6ウェルプレート上で直接、目的のパターンとサイズの複数の血管組織を作成するためのバイオプリンティングプロトコルを提示し、バイオプリンティング技術における既存の分解能と生産性の課題を克服します。ハイドロゲル内に6つの中空の灌流チャネルを構築するための簡略化された製造アプローチが確立され、その後、ヒトの臍帯静脈内皮細胞で裏打ちされて、機能的で成熟した内皮が形成されました。3Dバイオプリンティングのコンピュータ制御の性質により、高い再現性が保証され、従来の方法よりも手作業による製造ステップが少なくて済みます。これは、血管透過性をモデル化し、創薬を前進させるための効率的なハイスループットプラットフォームとしてのVOPの可能性を浮き彫りにしています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人体全体の血管ネットワークは、血液と周囲の組織との間の分子や細胞の交換を動的に制御することにより、重要な輸送障壁として機能します。この調節は、組織の浮腫を予防し、選択的な栄養素と細胞の交換を可能にするために不可欠であり、したがって組織の代謝と恒常性をサポートします1。多くの健康状態の要因である内皮透過性の変化は、疾患の重症度と治療効果の両方に影響を与えます2。血管内皮は選択的なバリアとして機能し、血管、組織、臓器間の移動を促進します。この調節には、溶質や低分子の基本的なろ過、血管関門の意図的な破壊、プロスタグランジンや成長因子などの分子の透過性レベルへの影響など、いくつかのメカニズムが関与しています3。

この調節の主な要因には、内皮細胞の結合、白血球の遊走、および血液脳関門の機能が含まれます4。その複雑さを考えると、プロセスはさまざまな環境によって異なり、さまざまな血管タイプが関与し、異なる解剖学的経路を利用します。血管透過性の生物学的基盤を理解することは、異常な血管透過性に関連する状態を治療するための治療アプローチを考案するために重要です。血管透過性を維持することは、血管系と周辺組織の健康にとって非常に重要です。その結果、この機能の障害は内皮機能障害、つまり内皮が正常な機能を失う状態につながります。

内皮機能障害は、高血圧、冠動脈疾患、糖尿病、癌など、いくつかの一般的なヒト疾患の前兆です5,6,7。この状態は、血管拡張の減少、血管透過性の増加、炎症誘発性状態への傾向など、いくつかの方法で現れる可能性があります。この病理学的状態は、冠状動脈疾患、脳卒中、末梢動脈疾患8など、いくつかの重大な心血管疾患の最も初期の段階であり、これらは引き続き米国における主要な死亡原因1である。内皮機能障害は、血液脳関門(BBB)だけでなく、心血管の健康にも影響を及ぼし、さまざまな神経疾患の進行に大きな役割を果たしています。機能障害はBBBの透過性を増加させ、毒素、病原体、免疫細胞が中枢神経系に侵入することを可能にし、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳感染症などの神経障害の一因となります9。

糖尿病における内皮機能障害は、内皮が血管緊張を調節し、一酸化窒素などの血管拡張メディエーターを産生する能力が損なわれることを特徴とし、血管拡張の障害につながります10。この状態は、プロテインキナーゼCの活性化や酸化ストレスなどの高血糖誘発経路によって悪化し、糖尿病性血管疾患の進行に大きく寄与します11。さらに、炎症環境は腫瘍細胞の脳微小血管内皮細胞への接着を促進することがわかっていますが、漏出性内皮は癌転移の主要な要因であると報告されています12,13。血管の形状は、脳腫瘍の転移に直接影響を与えることがわかっています。腫瘍細胞は、血管の湾曲が大きい領域に優先的に付着します7。この知見は、がん転移における血管形状の重要性を強調している。さらに重要なことに、線維症や癌などの状態では、内皮バリア機能の破壊が疾患の発症に関与するだけでなく、適切な薬物送達を妨げることにより治療効果も妨げます14。血管透過性に関する研究は、心血管疾患の治療を進歩させ、血管機能の低下を伴う他の疾患の管理に関する洞察を提供するために重要です。

血管透過性が健康と疾患に重要な役割を果たすことを考えると、従来の2Dおよび3Dのin vitro試験プラットフォームと並行して、動物モデルを使用して治療開発のための内皮バリアの選択的な性質を調べることに多くの研究が焦点を当ててきました。ただし、動物モデルには、種固有の違いと倫理的問題、および高コストのために制限があります15,16。例えば、ファイザーは2004年に、過去10年間で、動物モデルで有望な効果を示した医薬品開発に20億ドル以上を費やしたが、最終的には高度なヒト試験ステージ17で失敗したと述べました。さらに、従来の2Dモデルは、3次元(3D)アーキテクチャや血管チャネルの複雑な幾何学的構造を正確に模倣していません。

バイオファブリケーション技術の進歩に伴い、3Dアーキテクチャを再現しながら血管チャネルを作製する取り組みが盛んに行われています。マイクロスケールの血管チャネルは、ソフトリソグラフィーを使用してマイクロ流体チップ内で効果的に作製できるため、リアルタイム分析の利点を提供します18,19。ヒドロゲル鋳造または細胞シートを型またはマンドレルの周りに巻き付けるなどの代替方法を使用して、所望の直径20,21を有する自立した管状構造を作成することができる。ただし、これらの方法には制限があります。例えば、マイクロ流体チップはマイクロチャネル構成に制限されており、金型の周りのハイドロゲル鋳造では、複数の形状を効果的に再現することはできません。

3Dバイオプリンティング技術の出現により22、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)ベースのハイドロゲル材料23,24を正確に堆積することにより、複雑な形状を複製することが可能になりました。同心円状に配置されたノズルを使用する方法、例えば、同軸および三軸25,26を使用する方法など、一部のバイオプリンティング方法では、二股チューブを作成できません。しかし、複雑な構造は、犠牲的なパターニング法27で達成することができる。これらのバイオプリンティング法はいずれも、創薬における薬理学的研究の重要な要件であるハイスループットのin vitroモデリングを可能にすることが実証されていません。ここでは、内皮化された血管チャネルを効率的に作製し、寸法を効率的に制御する方法を提示する。

私たちは、市販の6ウェルプレートと、バイオプリンターがECMハイドロゲル内で目的のサイズとパターンの血管チャネルを作製する犠牲的パターニング法を組み合わせて、簡単なアプローチを確立しました。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を播種して、これらのチャネルを内皮化し、透過性アッセイを通じて内皮の機能を評価しました。この設計では、チャネルの両側にメディアリザーバーを作成することでポンプレス灌流が可能になり、一般的に使用される2Dロッカーの助けを借りて重力駆動の流れを使用して動的培養を模倣します。このアプローチにより、チューブポンプが不要になり、ハイスループットアプリケーション向けのこのプラットフォームのスケーラビリティが容易になります。また、3Dバイオプリンティング技術のコンピュータ制御の性質により、製造プロセスが合理化され、製造中のエラーの可能性が減少します。VOPモデルは、創薬における薬理学的試験のための貴重なツールとして有望視されています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. バイオプリンターのGコードの生成

  1. 印刷パスを生成して視覚化するには、オンラインのGコードシミュレーションツール(NCviewerなど)にアクセスします。
  2. インターフェイスの [新しいファイル ]アイコンをクリックして、新しいGコードファイルを作成します。
  3. 犠牲チャネルとシリコンチャンバーのGコードコマンドを手動で記述して、印刷パスを生成します。標準の 6 ウェルプレートの寸法を、ジオメトリを作成するための参照として使用します。
    注意: ここで使用されているGコードは、コンピューター数値制御(CNC)コードに基づいています。各コマンドの機能は、 補足表 S1 に示されています。6ウェルプレートフォーマットは、市販のマイクロプレートリーダーや顕微鏡セットアップとの互換性があり、内皮の成熟をサポートするのに十分な量の培地を収容できるため、頻繁な培地交換の必要性を最小限に抑えることができるため、6ウェルプレートフォーマットが選択されました。この作製プロトコルは、他の標準ウェルプレートと併用するためにも適合させることができます。
  4. Gコードが完了したら、インターフェイスの[ ファイルを保存 ]アイコンをクリックして、拡張子が.ncのファイルをダウンロードします。
    注:他の利用可能なGコード生成アルゴリズムを使用して、印刷パスを生成できます。血管チャネルの形状は、このGコードで操作できます。

2. 犠牲インクおよびシリコンチャンバーインクの調製

注:このプロトコルで使用されるすべての材料の供給源は、 材料の表に記載されています。

  1. SE1700とポリジメチルシロキサン(PDMS)の2種類のシリコーンポリマーを10:2の比率で組み合わせます。各ポリマーの硬化剤を10:1の割合で添加し、ポリマーと硬化剤を添加します。
  2. プラネタリーミキサーを使用して、ポリマー混合物を2,000rpmで完全に混合し、脱気します。
  3. へらで、混合したシリコーンポリマーを10mLの使い捨てシリンジに移します。装填したシリンジを400 × g 、5°Cで3分間遠心分離し、均一な一貫性を確保し、印刷中の気泡を防ぎます。
    注:チャンバーインクは、最適な印刷品質を確保するために、硬化剤の添加後2時間以内に使用する必要があります。印刷の準備をしている間、シリンジは5°Cで保管してください。このプロセスは、インクの硬化を遅らせるのに役立ち、そうしないと印刷パラメータが変わる可能性があります。
  4. プルロニックF-127(PF127)を計量して、蒸留水にPF127の40%(w / v)ストック溶液を調製します。
  5. PF127溶液をプラネタリーミキサーで400 × g で3分間混合し、均質性を確保します。均質化された混合物を4°Cに保ち、PF127を完全に溶解します。
  6. 1,000 units/mL のトロンビン原液を Dulbecco リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) に調製します。
    注:トロンビンストック溶液は、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、100 μLアリコートで保存してください。アリコートは-20°Cで6か月以内に保管する必要があります。
  7. 印刷する前に、トロンビンをPF127と1:10希釈して、PF127の最終使用濃度36%(w / v)、トロンビンの100ユニット/ mLまで混合して、犠牲インクを準備します。1 mLの犠牲インクを調製するには、100 μLのトロンビン原液と900 μLのPF127原液を混合します。
    注:1枚のプレートを印刷するための犠牲インクを準備する場合、合計容量は1mLで十分です。

3. 製作工程

  1. 製造プロセスを開始する前に、6ウェルプレートを酸素(O2)プラズマで100ワットの強度で1分間処理します。
  2. セクション2で概説した手順に従って、犠牲インクとシリコンインクの両方を準備し、インクに気泡がなく、均一に混合されて一貫した印刷が可能であることを確認します。バイオプリンターのプリントヘッドにインクを慎重にロードします。バイオプリンターのヘッドの温度を、犠牲インクの場合は37°C、シリコンインクの場合は5°Cに設定します。
  3. 22 Gの両ねじねじテーパーノズルをシリコンシリンジに取り付けます。犠牲インクの場合、希望のチャネル直径に応じてノズルサイズを選択します。
    注:ここでは、18 G、20 G、22 Gの3つのサイズのノズルを示しました。印刷圧力やプリントヘッド速度などの最適な印刷パラメータを 表1に示します。
  4. 目的のGコードをロードし、バイオプリンターのソフトウェアインターフェースの サーボレディ 機能を3秒間押します。プレートをステージ上のGコードの開始点に配置し、[ 開始 ]をクリックして印刷プロセスを開始します。
    注:通常、6つのチャンバーを含む1つのプレートの製造には、約1時間10分かかります。Gコードのロードと実行を含むステップ3.4は、使用する特定のバイオプリンターによって異なります。バイオプリンターの使用中は、汚染を避けるために無菌状態が維持されていることを確認してください。
  5. プレートに蓋をし、プレートを加湿したCO2 インキュベーターに37°Cで72時間移して、シリコンチャンバーを硬化させます。
    注:シリコン硬化はインキュベーター内でゆっくりとした速度で発生する可能性がありますが、プレートをドライオーブン内に置かないでください。

4. ハイドロゲルの調製とチャネル埋め込み

  1. 20 mLの1x PBSを含む50 mLのコニカルチューブを準備します。0.01 gのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を円錐管に入れて、0.05%(w / v)LAP溶液を作ります。粉末が完全に溶解するまでボルテックスします。
    注意: 光にさらされないように、円錐形のチューブをホイルで包みます。LAPストック溶液は4°Cで保存します。
  2. 20 mLのLAP溶液に3 gのゼラチンメタクリレート(GelMA)と0.2 gのフィブリノーゲンを加えて、最終濃度15%のGelMAと1%のフィブリノーゲン(GelFibと呼ばれる)を達成します。混合物を37°Cのウォーターバスに入れ、溶液が完全に溶解するまで定期的にボルテックスミックスします。
  3. セクション3で概説したように作製した後、予熱したGelFibを各ヒドロゲルチャンバーに300 μL加えて、犠牲パターンを埋め込みます。GelMAを波長405nm、強度85mW/cm2 の紫外線(UV)光と120秒間迅速に架橋します。他のすべてのウェルに対してこの手順を繰り返します。
    注:フィブリノーゲンは、トロンビンを含む犠牲パターンと接触すると急速に架橋します。室温でのGelMAの不要なゲル化を避けるために、ハイドロゲルを添加し、ウェルごとに個別にUV架橋を行うことをお勧めします。さらに、UV硬化プロセス中の汚染を防ぐために、無菌状態を維持する必要があります。
  4. 各ウェルの血管チャネルの両側に 1 mL の DPBS を添加し、プレートを 4 °C で 15 分間保持して PF127 を液化します。
  5. 15分後、DPBSを吸引し、手順4.5を3回繰り返してPF127を完全に洗浄します。
  6. 細胞をチャネルに導入する前に、1%マトリゲルを含むDMEM F12をチャネルを通じて30分間灌流し、細胞の接着を促進します。

5. HUVECの文化

  1. 温めた内皮細胞増殖培地(ECGM)を37°Cの水浴中で30分間。
  2. その間、凍結保存されたHUVECのバイアルを窒素タンクから取り出し、バイアルのキャップをそっと緩めてから、再度締めて糸から窒素を放出します。バイアルを37°Cのウォーターバスに2分間浸して細胞を解凍し、バイアル内に少量の氷が残るようにします。バイアルを70%エタノールですすいで、汚染を防ぎます。
    注:窒素タンクから細胞を回収するときは、安全ゴーグルを着用してください。このプロセス中は、バイアルのキャップを水位より上に保つ必要があります。
  3. 5 mLの予熱済みECGMを含む15 mLのコニカルチューブを準備します。マイクロピペットを使用して、解凍した細胞をバイアルから円錐形のチューブに慎重に移します。細胞が残らないようにするには、1 mLの新鮮な予熱培地をクライオバイアルに加え、内部をすすぎ、残りの細胞を円錐管に移します。
  4. コニカルチューブを200 × g で3分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。上清を捨て、細胞を10 mLの新鮮な培地に再懸濁し、細胞をT75フラスコに移し、フラスコを37°C加湿CO2 インキュベーター内に置きます。
    注:このステップは、遠心分離によってクライオバイアル内の凍結媒体中に存在するジメチルスルホキシドを除去するために重要です。
  5. 細胞が80〜90%のコンフルエントに達するまで、隔日で培地をリフレッシュします。

6. チャネルの内皮化

  1. 温めたECGM、DPBS、トリプシン中和溶液、およびトリプシンエチレンジアミン四酢酸(TE)を37°Cの水浴中で30分間。
  2. 90%の密度で、T75フラスコで細胞を10 mLのDPBSですすぎ、0.25% TEを1 mLフラスコに加え、3分間インキュベートします。
  3. フラスコの側面を軽くたたいて、5 mLのトリプシン中和溶液を加えてTEを中和します。細胞を15mLのコニカルチューブに移します。5 mLの新鮮なECGMを使用して残りの細胞を採取し、それらを円錐管に加えます。
  4. コニカルチューブを250 × g で3分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。
  5. 上清を捨て、細胞ペレットを新鮮なECGM1 mLに再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントし、ステップ6.4を繰り返して細胞ペレットを採取します。300万個の細胞を90 μLのフレッシュECGMに再懸濁します。
  6. 細胞懸濁液をチャネルに導入する前に、チャネルを短時間真空吸引して内腔をクリアにします。
    注意: チャネルの完全性を損なわないように、チャネルを長時間吸引しないでください。
  7. ウェルあたり50万個の細胞の播種密度で細胞懸濁液をチャネルに穏やかにロードします。マイクロピペットを使用して、この懸濁液を~15 μL加え、チャネルを満たします。
    注:播種密度は、チャネルのサイズによって異なる場合があります。この密度は、20 Gノズルと約900 μmの内径でプリントされたチャネルに最適化されています。
  8. プレートをインキュベーター内に平らに置き、2時間待ちます。その後、プレートを180°に反転させ、次の2時間フラットな位置に維持します。
  9. 4時間後、DPBSでチャネルを洗浄し、非接着性細胞と死細胞を除去します。各ウェルに2 mLの新鮮なECGMを加えます(チャネルの両側に1 mL)。10°の傾斜角度と5rpmでロッカーの動的培養を開始するには、チャネルをロッキングの方向に平行にしてロッカーにプレートを配置します。成長培地は一日おきにリフレッシュしてください。
    注:動的培養は、リザーバーとチャネル間の培地交換を促進し、細胞が一晩で増殖するのを助けます。

7. 内皮成熟評価

  1. ECGMおよびDPBSを37°Cのウォーターバスで30分間予温し、Cell Counting Kit-8(CCK8)試薬を室温で使用。
  2. 各ウェルに100 μLのCCK8試薬と1 mLの新鮮なECGMを混合して、CCK8の作業溶液を作成します。プレート/6チャンネルで作業しながら、600 μLのCCK8試薬を6 mLの新鮮なECGMと組み合わせて調製します。
  3. 吸引して増殖培地を取り出し、DPBSでチャネルをすすぎます。各ウェルに1 mLのCCK8ワーキング溶液を加え、プレートをインキュベーター内で30分間平らに保ちます。その後、ステップ6.9で説明したようにロッカーで動的培養を開始し、このプロセスを次の3時間続けます。
  4. 3時間後、プレートを片側に傾けて各ウェルから内容物を取り出し、新しい6ウェルプレートに移します。DPBSでチャネルをすすぎ、新しい培地を追加します。
    注意: 吸光度が測定されるまで、プレートをアルミホイルで覆います。すべてのウェルで試薬量を一定に保ち、測定値が均一になるようにします。ピペッティング中は、光学濃度の読み取り精度を損なう可能性のある気泡の混入を慎重に避けてください。
  5. プレートを15秒間静かに振とうして色が均一に混ざり合うようにした後、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。
  6. 事前定義された時間間隔でこの手順を繰り返します。各時点の平均光学密度を計算し、グラフ作成ソフトウェアで成長曲線をプロットします。この曲線は、経時的な内皮の相対的な成熟を示しています。

8. 透過性アッセイ

  1. 目的の1つのウェルから培地を取り出します。
    注:透過性アッセイでは、他のチャネルが乾燥し、血管透過性が変化するのを防ぐために、各ウェルを別々に処理することをお勧めします。
  2. 70 kDaのFITCデキストランをDPBSに溶解して、FITC標識デキストランの0.1 mg / mL溶液6 mLを調製します。.
    注:100 mgのFITCデキストランを5 mLのDPBSに溶解して、20 mg / mLのFITCデキストランストック溶液を準備します。.溶液を穏やかにボルテックスした後、凍結融解サイクルが繰り返されないように、500 μLを1.5 mLチューブに分注します。これらのアリコートは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。アッセイを行う前に、ストック溶液を0.1 mg/mLの使用濃度に希釈してください。
  3. プレートを顕微鏡ステージにしっかりと配置し、位相差モードで対物レンズの倍率を調整すると、視野内で関心領域のチャネル壁と近くにあるゲルがはっきりと見えるようになります。
    注:効果的な透過性評価のために、視野内の関心領域を囲むゲルの面積を最大化するようにしてください。この側面は、デキストラン輸送の正確な監視の鍵となります。
  4. 目的の領域に焦点を合わせた後、位相差から蛍光モードに変更します。 [画像取得 ]タブで、 FITC を 広視野チャネルに追加し、デキストラン溶液を添加する前に画像を取得して、バックグラウンド蛍光強度を計算します。次に、1 mLのFITCデキストラン作動溶液をチャネルの片側に加え、静水圧差によって駆動される溶液をウェルの反対側に向けて流します。
  5. あらかじめ決められた時間間隔で画像を取得します。透過性の高いチャネルではより頻繁に、透過性の低いチャネルではその頻度が低くなります。

9. ImageJにおける蛍光強度測定

  1. ImageJ画像解析ソフトウェアでは、初期時点の強度(It1)、後の時点で観測された平均強度(It2)、およびバックグラウンドノイズによる強度(Ib)を以下に概説するように測定します。式(1)を使用して、透過係数(PD)を計算します。T1 と T2 は、画像取得の初期時点とその後の時点を指します。
    figure-protocol-1(1)
    1. ImageJを起動し、初期点で取得した画像を開きます。
    2. ImageJ でスケールを設定します。 [分析] |スケールを設定します。既知のスケールと測定単位を入力します。
    3. 長方形ツールを選択し、蛍光強度測定が必要なゲルの領域に長方形を描きます。
    4. [分析] |[測定] を設定し、[平均] グレーの値がオンになっていることを確認します。
      注意: このオプションは、選択した領域内の平均強度を測定します。他のパラメータは、特定の解析に必要に応じて選択できます。
    5. 領域を選択したまま、[ 分析] |測定するか 、 単にMを押します。 結果 ウィンドウが開き、平均蛍光強度と選択したその他のパラメーターが表示されるのを待ちます。
    6. 3 つの測定を行い、スプレッドシートで平均蛍光強度値を計算します。
    7. その後の時点t2で撮影された画像、および後の時点における蛍光強度を計算するためのデキストラン溶液を添加する前に撮影された画像について、この手順を繰り返して、背景蛍光を決定する。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サイズとパターンに柔軟性を持たせたVOPプラットフォームは、マルチヘッドバイオプリンティングシステムで製造されました。中空で灌流可能なチャネルには、内皮化を促進するためにHUVECを播種し、その後、透過性アッセイで評価しました(図1A)。この方法のマルチスケール製造能力を実証するために、ストレート、二股、畳み込みの3つの異なる構成をプリントしました(図1B)。簡単な作製アプローチにより、ハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれた6つの中空の灌流可能な血管チャネルを、標準的な6ウェルプレート内に作製することができます。その後、これらのチャネルはHUVECで内皮化できます(図2A)。細胞は急速に付着して増殖し、血管チャネルの管腔表面を覆います(図2B)。下部管腔表面と上部管腔表面の両方に接着した細胞は、内腔内に均一な分布を示します(補足図S1)。

プレートを加湿インキュベーターに3日間置いて、シリコンインクを硬化させながら、犠牲パターンが乾燥しないようにしました(図3A)。これらのチャネルを通る流れを評価するために、緑色のマイクロビーズを導入し、チャネルが効果的に灌流可能であることを実証しました(補足ビデオS1)。チャネルの直径は、犠牲パターン印刷中にノズルサイズを22Gから18Gに変更することにより、558±38μmから1094±45μmまで変化させました。さらに、バイオプリンターのGコード (補足ファイル1) を変更してチャネルの幾何学的構成を操作し、畳み込みパターンと分岐パターンの印刷を可能にしました(図3B)。

UVによる架橋時間は120秒に最適化され、効果的な細胞増殖をサポートします(補足図S2)。この架橋持続時間により、内皮細胞の増殖を促進する生理学的に関連性のある環境がもたらされましたが、これはおそらくハイドロゲルのバランスの取れた機械的特性と多孔性によるもので、細胞の接着とその後の増殖が促進されました。HUVECは管腔表面で効果的に増殖し、播種後5日目までに丸石のような形態を示しました。内皮の成熟度は、1日目、3日目、および5日目に実施されたCCK8アッセイで評価しました(図4A、B)。内皮の成熟は、細胞播種後5日でCD31の免疫染色によって確認され、タイトジャンクションでのCD31の局在が実証されました(図4D)。

内皮のバリア機能を評価するために、成熟の5日目にチャネルを介して70 kDaのデキストラン溶液を灌流しました。比較のために、内皮のない(むき出し)コントロールチャネルを選択しました。内皮化されたチャネルは、経時的に血管周囲ゲル領域内の蛍光の変化が最小限であったため、内皮がそのバリア機能を効果的に維持していることが示唆されました。しかし、裸のチャネルは血管周囲ゲル領域における蛍光の増加を示し、したがって、内皮がないために透過性が高いことが示されました(図4C および 図4E)。

figure-results-1
図1:印刷された血管チャネルの調製とその構成(A)印刷された血管チャネルの作製、内皮化、および透過性アッセイの概略図。(B)この方法で示される3つの構成(直線、二股、および畳み込み)の概略図。略語:VOPs = プレート上の容器。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:犠牲パターンとシリコンチャンバー、および血管チャネル内皮化を印刷するための製造タイムライン(A)図はウェルプレートの単一のウェルを表し、AA'は断面面に沿ったビューを指します。(B)製造工程の代表的なイメージ。スケールバー = 5 mm (B1)、200 μm (B2-4)。略語:GelFib = 15%ゼラチンメタクリレートおよび1%フィブリノーゲン、0.05% w / vリチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸溶液中。HUVECs = ヒト臍帯静脈内皮細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:プレート上の容器 (A)犠牲パターンとシリコンチャンバーの印刷後のプレート上の容器のグロスイメージ。(B)緑色のマイクロビーズで灌流された、さまざまな構成とサイズの血管チャネルのマルチスケール製造のデモンストレーション。スケールバー = 200 μm (ストレートチャンネル)、1,000 μm (畳み込みチャンネルと分岐チャンネル)。略語:ID =内径。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:血管チャネルとその内皮成熟および透過性 (A)緑色蛍光タンパク質タグ付きHUVECを播種した後の1日目、3日目、および5日目の血管チャネルの蛍光顕微鏡画像、5日目のHUVECの増殖および丸石形態を示す。(B)内皮の成熟は、細胞播種後1日目、3日目、および5日目にCCK-8アッセイで評価しました。(C)内皮化された(内皮+)および裸(内皮-)血管チャネルの透過性アッセイ。(D)CD31染色の代表的な画像は、5日目のタイトジャンクションでのCD31の局在を示しています。(E)拡散透過性の定量化。スケールバー = 200 μm (A, C, D)。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GFP HUVECs = GFPタグ付きHUVECs;CCK-8 = 細胞計数キット 8;DAPI=4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

印刷用インク印刷パラメータ
ノズルゲージ温度 (°C)空気圧(kPa)ヘッド速度(mm / min)
犠牲インク183740-48200
20
22
シリコンインク225100

表1:犠牲インクとシリコンインクの印刷パラメータ。

補足ファイル1:犠牲パターンと6ウェルプレート内のシリコンチャンバーを3Dプリントするためのコマンドを含むGコードスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:細胞播種後の下部および上部管腔表面の代表的な画像で、下部および上部焦点面の両方でGFP-HUVECが付着していることを示しています。 スケールバー = 200 μm。略語:UU '=上部焦点面;LL' = 下焦点面。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:UV(405 nm)との異なる架橋期間下でのGFP-HUVEC増殖。 スケールバー = 200 μm。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GFP HUVECs = GFPタグ付きHUVECs。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ S1: 緑色のマイクロビーズによる灌流は、直線、畳み込み、および分岐チャネルを通る効果的な灌流を示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:GコードおよびMコードコマンドの機能。 注意: Gコードでは、X、Y、およびZは、それぞれX軸、Y軸、およびZ軸に沿った移動の座標を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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3Dバイオプリンティング技術の精度、自動化、およびコンピューター制御の性質を利用して、市販のマイクロプレートリーダーや顕微鏡イメージングセットアップとの互換性を考慮して、標準的な6ウェルプレートで血管チャネルを作製するための合理化された方法を確立しました。プレートのデザインは、マルチサイズのチャンネルと、より大きなチャンネルの成長に十分な量のメディアに対応しながら、メディア交換の必要な頻度を減らすことができます。この設計の将来の適応は、他の市販の標準ウェルプレートにも適応させることができるため、実験スループットが向上し、材料の使用が減少します。

マイクロ流体プラットフォームは、その非毒性、ガス透過性、および高い透明性のために、PDMSと呼ばれるシリコーンポリマーをよく使用します28。しかし、PDMSは形状忠実度が低いため、マイクロエクストルージョンベースのバイオプリンティングでの形状忠実度の高いチップ製造での使用が制限されています。SE170029は、別のシリコーンポリマーで、組織製造用のチャンバーの構築においてより高い精度を提供しますが、その高粘度はより大きなノズルとかなりの空気圧を必要とします。SE1700とPDMSをブレンドし、より小さなノズルで使用できるように配合することで、限られた領域での高精度かつ形状忠実な製作を可能にしました。ポリカプロラクトン(PCL)またはポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)などの他のタイプのポリマーも、その高い形状忠実度を考慮すると、チャンバー印刷に使用できます30。

GelMAの光学的透明性も重要である31。他のECMベースのハイドロゲル(架橋後に不透明になるコラーゲンなど)とは対照的に、GelMAは透明性を保持しているため、チャネルサイズが拡大してもチャネル内の細胞分析をリアルタイムで行うことができます。この側面は、コンストラクトのサイズが大きくなるときに観察のために薄い切片を必要とする方法よりも大きな利点を提供する32。GelMAの生分解性は、ECM足場が崩壊する際に新しい機能組織との交換を促進し、それにより新たに形成された機能組織33,34の成長に必要なスペースを提供する。さらに、その証明された低い細胞毒性は、組織工学アプリケーション35,36に非常に適しています。GelMAの優れた機械的特性は、血管組織工学37のアプリケーションに適した候補となっています。HUVECによる血管導管の内皮化を促進するその有効性は、十分に文書化されています38。

この研究で内皮化に利用された細胞であるHUVECは、高い単離成功率を示し、広範囲の心血管疾患および代謝性疾患を調べるための優れたモデルです39。ただし、このアプローチは、動脈に由来する細胞や患者から直接由来する細胞など、さまざまな種類の内皮細胞に対応するように調整できます。この適応性により、患者固有の血管組織モデルの作成が可能になり、特定の薬物に対する個々の反応の評価が容易になります。

このプロトコルには、読者が心に留めておくべきいくつかの重要な手順があります。まず、ほとんどの市販のウェルプレートは疎水性であるため、プラズマ処理はプレートの表面特性を変更するため、特に親水性を高めるために重要です。プラズマ処理では、表面に極性官能基を導入することで、シリコンチャンバーやハイドロゲルとの結合能力が向上します。第二に、犠牲インクは低温で液化し、シリコンインクは早期硬化を防ぐために低温を必要とし、ノズルからのインクの押し出しを妨げる可能性があるため、温度制御が重要です。第三に、PF127の全ての痕跡を徹底的に除去することが極めて重要である、なぜなら、残留PF127は、細胞接着を妨害するなどして、細胞プロセスに悪影響を及ぼす可能性があるからである40。第4に、細胞培養中に細胞が90%を超えるコンフルエントに成長すると、スペースと栄養素の競争によりストレスを感じる可能性があります。このストレスは、細胞の挙動の変化、細胞生存率の低下、および細胞微小環境の変化を引き起こす可能性があります。細胞の健康と適切な増殖を維持するために、培養物の密度を90%未満に保つことをお勧めします。第5に、反転の前後にインキュベーター内でプレートを平らに保つことが重要であり、これによりチャネル内での細胞接着が均一になり、最終的には内皮化が均一になります。最後に、画像取得時には、露光時間、励起レーザー強度、顕微鏡の焦点を一定に保つことが重要です。これらのパラメータの変動は発光信号の強度を変化させ、結果の精度に影響を与える可能性があるためです。

このアプローチにより、ここで示す直線パターン、分岐パターン、および畳み込みパターンなど、複数の構成でチャネルを作成できます。この適応性は、人体内の多様な血管ネットワーク形状を再現するために不可欠であり、金型の周りでのハイドロゲル鋳造やチューブ状構造30,41,42に使用される同心円状のノズルベースのバイオプリンティング技術などの従来の方法の能力を凌駕している。ただし、この方法の1つの制限は、犠牲パターンが平らな面に配置されるため、チャネルの真円性が保証されないことです。

複数のサイズでチャネルを構築する利点は、マイクロチャネルに制限されることが多いマイクロ流体プラットフォームの制限を克服するための鍵です。この制限は、従来の生化学的アッセイの欠点となる可能性があります。例えば、ウェスタンブロッティングなどの標準的なタンパク質発現アッセイに十分な材料を得るためには、複数のマイクロ流体デバイスからの出力を組み合わせる必要があります。さらに、中空チャネルが作成されると、ハイドロゲルは針の除去プロセスに耐えるのに十分な剛性を維持する必要があります。私たちのアプローチは、温度が下がると液体になる熱可逆性の犠牲材料を使用しているため、ゲルの完全性を損なうことなくこのプロセスを促進します。さらに、ゼラチン43などの他の熱可逆性ゲル化材料も、この方法で犠牲材料として利用することができる。

このアプローチにより、プレート上の組織構造のカスタマイズが容易になり、創薬における薬理学的試験に有望なツールとなります。この方法は、血管機能障害に関連する疾患の治療法を開発する上で重要な要素である血管透過性への影響を評価することにより、薬物のスクリーニングを容易にすることができます。私たちのモデルは、炎症などの特定の条件下での血管透過性を研究し、異常な血管透過性44を含むさまざまな疾患の治療に関連する血管正常化の戦略を開発するために使用でき、このプロセスの理解を深め、潜在的な臨床応用45を開発します。

血管透過性を評価するために、血管チャネルを介して70 kDaのデキストランを灌流しました。典型的には、健康な血管内皮は、この分子量のデキストラン分子に対する効果的なバリアとして機能する46。しかし、炎症の存在下では、タイトジャンクションの破壊が起こり、これらの分子が漏れることを可能にし、それによって血管透過性が増加する30。さらに、蛍光標識デキストランは、人工組織47内の薬物の分布を評価するために利用される。このモデルでは、双方向の流れとチャネル内の制御オーバーフローダイナミクスの制限が限界ですが、エンドユーザーは、カスタマイズされたロッカーを使用してチャネル内の流れのダイナミクスを制御することで、要件に応じてシステムを適応させることができると想定しています。この適応は、ポンプレス一方向フロー48の実施を含んでもよい。

将来的には、この作製法をスケールアップして複雑な組織を構築することができるようになるかもしれません。他の種類の細胞を血管チャネルの近くに正確に配置することで、灌流可能な血管新生組織を作製することができ、それによって体積組織のバイオプリンティングにおける大きな課題を克服することができます。また、この方法は、リンパ管や腸など、他の種類の中空の灌流組織をハイスループットでシミュレートするために、さまざまな生物医学的応用に適応できると考えています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、韓国政府(科学情報通信部、三井海洋科学技術庁)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けたものです。NRF-2019R1C1C1009606;番号2020R1A5A8018367;そして No.RS-2024-00423107]。本研究は、MSITが資金提供するNRF助成金のBio and Medical Technology Development Programの支援を受けたものである。NRF-2022M3A9E4017151 および No.NRF-2022M3A9E4082654]。この研究は、産業通商資源部(MOTIE、韓国)の資金提供を受けた技術革新プログラム[第20015148号]と錬金術師プロジェクト[第20012378号]の支援を受けました。この作業は、韓国農林業技術計画評価院(IPET)の支援も受け、農業・食糧・農村地域部(MAFRA)の資金提供を受けた「研究人材開発のための農業・食品融合技術プログラム」を通じて行われました。RS-2024-00397026]。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mL 血清ピペットSPL SPL91010
10 mL シリンジ Shinchang Medical
15 mLコニカルチューブSPL50015
3Dバイオプリンター T&R Biofab3DX-プリンター
6ウェルプレート SPL37206
生物学的安全キャビネットCHC LABPCHC-777A2-04, 
明視野倒立顕微鏡ライカDMi1
細胞計数キット (CCK8)GlpBioGK10001
細胞計数キット (CCK8)GlpBioGK10001
細胞培養フラスコ 75TSPL70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mLCorning354230
蒸留水
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO、細胞培養グレードSigma aldrichD2438
Dow-Corning、PDMS-Sylgard 184a キットDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 クリア W/C 1.1 KG キット DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
内皮細胞増殖培地 MV 2 (すぐに使用)プロモセルC-22022
エッペンドルフ マイクロピペット(1000,200,100,20,10)エッペンドルフ
エチルアルコール 99.9%DuksanD5
Excelマイクロソフト
ウシ血漿由来フィブリノーゲンSigma AldrichF8630-1G
FITC デキストラン 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
蛍光ビーズ (1.0 μm、緑)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA粉末(メタクリル酸ゼラチン)50 g3D材料 20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mLGibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)Promocell
ImageJ softwareNIH
IncubatorThermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 インキュベーター
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)Thermo FisherL3224
リチウムフェニル (2,4,6-トリメチルベンゾイル) リン酸粉末 常陽化学工業(株)85073-19-4 
マリエンフェルド・スーペリア、計数室カバーマリエンフェルド・スーペ
リア、血球計算盤、細胞計数室マリエンフェルド・スーペリアHSU-0650030
エッペンドルフ量遠心分離5920 R
NCViewer.com
窒素タンクワージントン・インダストリーズ LS750
オムニキュアUVレーザーエクセリタスシリーズ 1500
フィルム MamcorPM-996
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x)GenDEPOTCA005-010
プラネタリーミキサー株式会社シンクィARE-310
プラズマ処理機FEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
既製バッファー、(P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
試薬収納キャビネットZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
リアルタイム ライブセルイメージング顕微鏡Carl ZEISS
冷蔵庫SAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D デジタルIKA4003000
スクープスパチュラキャッシュBySL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%Sigma aldrichT4049-100ML
Dodecyl Sulfate (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
シリンジ バレル チップ キャップFISNAR3051806
Tallycounter Control Company C23-147-050
テーパーノズル (18 G)MushashiTPND-18G-U
テーパーノズル (22 G)MushashiTPND-22G-U
テーパーノズル 20 GMusashiTPND-20G-U
ウシプラズマからのトロンビンSigma AldrichT7326-1KU
タイマー、4 チャンネルETLSL.Tim3005
トリパンブルー溶液 0.4%Gibco15250061
トリプシン中和液プロモセルC-41120
UG 24 mL UG 軟膏瓶山遊No. 3-53
UG 58 mL UG 軟膏瓶山結No. 3-55
ウォーターバスダイハン サイエンティフィックWB-11
ウェイトマシンザルトリウスBCE2241-1SKR
微機 パラー

参考文献

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3D CD31

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