小葉全体のマウスにおける肺微小血管密度の定量化

サマリー

ここでは、イソレクチンB₄の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。

要約

肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害に関連しており、血管壁の完全性、血流調節、およびガス交換に深く関連しています。マウスモデルでは、肺葉のサイズ、形状、位置、血管新生に大きな違いが見られますが、既存の方法では微小血管密度を定量化する際のこれらの変動が考慮されていません。この制限は、肺の微小血管機能障害の包括的な研究と、さまざまな小葉にわたる微小血管系循環の潜在的なリモデリングを妨げます。私たちのプロトコルは、マウスの異なる葉にわたる気道枝のサイズ、形状、および分布を活用して、肺微小血管密度の変化を定量化するために 2 つの切片化方法を採用することにより、このギャップに対処します。次に、イソレクチンB₄ (IB₄)染色を利用して、さまざまなスライス上の肺微小血管内皮細胞を標識し、その後、無料で入手できるソフトウェアImageJを使用して偏りのない微小血管密度分析を行います。ここで紹介した結果は、若齢マウスと老齢マウスを比較して、老化に伴う肺小葉全体の微小血管密度の変化の程度が異なることを強調しています。このプロトコルは、肺微小血管密度の偏りのない定量化のための簡単で費用対効果の高いアプローチを提供し、肺微小血管系の生理学的側面と病理学的側面の両方に関する研究を促進します。

概要

内皮細胞(EC)は、血管の内層に位置する特殊なタイプの細胞で、動脈と静脈の樹全体を覆い、血管と臓器の安定性を維持する上で重要な役割を果たし^{ています1。}肺は高度に血管新生された器官であり、血管壁の形成、血流の調節、ガス交換の促進、炎症反応の調節、血小板活性の制御、血管の成長に関与する調節物質の分泌、修復、凝固バランスの維持など、肺で重要な生理学的および病理学的役割を果たします。

肺微小血管内皮細胞(LMEC)は、肺組織、特に肺の微小血管系(毛細血管)にある特定の内皮細胞であり、肺のより一般化された動脈および静脈内皮細胞と区別されます。これらの細胞は、血管緊張の調節、血管透過性の制御、炎症反応の調節への参加、血栓形成の調節など、さまざまな機能を持っています。それらは、肺循環、ガス交換、栄養素の輸送の調節に重要な役割を果たし、肺に関連するさまざまな生理学的および病理学的プロセスに関与しています^。また、肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害と関連しています³。Larissa L.らは、従来の内皮細胞マーカーCD31と空間的局在化(具体的には肺の末梢領域)を用いて、老齢マウス(18ヶ月齢)の微小血管内皮細胞密度が若齢マウス(4ヶ月^{齢)と比較して}有意に減少していることを観察しました4。喘息に関連する肺の病理の文脈では、Makoto H. et al. は、喘息患者からの抗コラーゲン IV で染色された気管支生検標本の血管誘導の大幅な増加を、対照被験者と比較して示しました⁵.最近、透過型顕微鏡と走査型電子顕微鏡の技術を導入することにより、Maximilian A. et al. は、Covid-19 または Influenza A (H1N1^{) で}死亡した患者における腸感受性および発芽血管新生に関連する特徴の数値密度が著しく増加したことを報告しました6。明らかに、異常な微小血管の起源は肺の機能障害と関連しています。しかし、現在、微小血管密度の変化を定量化するための簡単で経済的な方法はありません。

マウスモデルでは、肺は従来、右頭蓋、右中央、右尾、左頭蓋、左尾の5つの異なる葉に分割されます。各葉は、サイズ、形状、位置、および血管新生の可能性に関して独自の特性を示し、効率的なガス交換と肺循環の潜在的に相乗的な調節に貢献します。しかし、私たちの知る限りでは、肺微小血管の変化を調査する際に、これらの肺葉の違いを説明する方法論はありません。

この研究は、肺微小血管密度の偏りのない定量的評価のために、肺微小内皮細胞⁷の明確なマーカーである_IB4を利用して、マウスで小葉を切片化する新しい方法を提示します。この革新的なアプローチは、マウスの個々の葉の明確な特性を考慮することにより、マウスの肺の微小血管の変化をより包括的に理解する必要性に対処します。デモンストレーションとして、老化マウスでは、肺の大幅な減少
微小血管密度は、尾葉と左葉の両方で特異的に観察されます。このプロトコルは、マウス肺の微小血管状況の変化の調査に葉特異的解析を統合することの重要性を強調しています。特に、この方法は、血管新生を超えて、肺の発達と病変の生理学的および病理学的進行の両方を包括的に理解しようとする研究者にとって貴重な研究参考文献を提供します。

プロトコル

すべての実験は、四川大学動物研究委員会(No K2023023)の倫理ガイドラインに従って行われました。

1. マウス肺葉のパラフィン切片の作製

1. マウスから肺組織を採取します。
   1. 6週目と16か月後の雄のC57Bl/6マウスを選択して、さまざまな年齢層のマウス肺の微小血管密度を評価します。
   2. マウスの腹腔内注射により、100 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与します。.麻酔後に子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。胸腔を開き、肺組織を採取します。
2. パラフィン切片を調製します。
   1. 組織の体積の10倍の4%パラホルムアルデヒド溶液に組織を固定することで、組織の形態と構造を維持し、劣化を防ぎます。
      注:マウスの肺の血管灌流固定中に空気を膨らませる最近の新しい方法が開発されました。この方法は、気道、肺胞細胞、および間質の形態と位置をより良く保存すると報告されており、肺の組織学的研究により適しています。この方法は、対応する機器と自社製の機器⁸を備えた消耗品を備えたラボに推奨されます。
   2. 肺葉を切開して、埋め込み方向を決定します(図1)。
      1. 3時間の固定後、5つの肺葉を分離し(目の直接観察下)、右肺の頭蓋葉、中葉、および副葉を別々に埋め込みます。
      2. 右肺の尾葉を肺葉-気管支接合部に垂直な方向に左から右へ4mmで2つに切り、切断面を上に向けてワックスブロックに埋め込む。
      3. 左肺葉に3つの切り込みを入れます。最初のカットは、メイン気管支接合部の横方向、上部から2mm下に行います。2番目のカットは、メイン気管支接合部の横方向、上部から5mm下に行います。ローブの端、上部から8mm下に3番目のカットを行います。ティッシュの最上部を捨て、残りの3つのピースをワックスブロックに包み、切断面を上に向けています。
         注:複数の肺片を一緒に埋め込む場合、顕微鏡拭き取り紙を使用してそれらを包み、組織包埋ボックスに入れて脱水プロセスを続行できます。
      4. 組織を固定剤に24時間再固定します。
   3. ティッシュブロックを容器に入れ、流水で15分間すすぎます。
   4. 組織を次の溶液に順次置きます:65%エタノール30分間、75%エタノール30分間、85%エタノール30分間、95%エタノールIを60分間、95%エタノールIIを60分間、無水エタノールIを60分間、無水エタノールIIを60分間、70%エタノールを120分間、80%エタノールを120分間、 90%エタノールで120分、95%エタノールで120分、無水エタノールIで120分、無水エタノールIIで120分。
   5. 組織をキシレンIに30分間、キシレンIIに30分間置きます。
   6. 組織を54°C未満で1時間、硬質ワックスIを58°Cで1時間、硬質ワックスIIを58°Cで30分間静寂します。
   7. 適切な金型サイズを選択し、適切な量の液体パラフィンを充填し、鉗子を使用して、金型の中央にある埋め込みフレーム内の組織を正しい方向に配置します。型と組織を埋め込み機の凍結領域に置き、鉗子で組織をやさしく押します。
   8. パラフィンがわずかに白くなり始めたら、覆われていない埋め込みフレームを金型の上にすばやく配置し、2回目のワックス注入を実行して、埋め込みフレームの下部にある穴を塞ぎます。金型全体を冷凍テーブルに移して成形します。
   9. ワックスブロックをスライサーに固定し、粗いトリミングと細かいトリミングにより滑らかで平らな切断面を露出させた後、ミクロトームのホイールクランクを回転させて厚さ4μmのスライスを切断します。
   10. 取り外した部分を順番に水面にスムーズに配置します。セクションが完全に伸びたら、各セクション間の接合部で壊れたピースを分離します。
   11. セクションの下にスライドガラスを傾け、接触したら、スライドを垂直にゆっくりと均等に水面から持ち上げます。セクションはスライドガラスに接着します。

2. 肺微小血管系検出のための免疫蛍光染色

1. パラフィン包埋スライスを65°Cのオーブンに60分間置きます。
2. スライスをスライドラックに置き、染色ジャーで次の手順を実行します:キシレン1、キシレン2、キシレン3をそれぞれ15分間浸漬し、続いてキシレン/エタノール(1:1)に5分間浸漬し、100%エタノール#1、100%エタノール#2、85%エタノール、75%エタノール、および蒸留水にそれぞれ5分間浸します。
3. 修飾クエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液を脱イオン水で50倍に希釈します。電子レンジを高出力で沸騰するまで予熱し、スライドを抗原抽出物に入れます。スライドを抗原抽出物中で15分間沸騰させた後、室温まで自然に冷却します。
4. スライドをPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。0.25%トリトンを2回、各10分間透過処理します。
5. 免疫組織化学ペンで組織を囲み、室温(RT)で5%BSAと1時間インキュベートします。スライドをPBSで5分間一度洗浄します。
6. Alexa-647 Fluor標識IB₄ およびDAPI染色を行います。
   1. IB₄ を氷上に置き、1%BSAで1:50に希釈します。円の周りの余分な水分を取り除き、希釈したIB₄ を各組織切片に50〜100 μL加え、4°Cで一晩インキュベートします(このステップ以降、すべての手順は暗所で行ってください)。
   2. スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。0.25% Triton で 10 分間透過処理します。
7. DAPI(10 μg/mL)をPBSで1:10の比率で希釈し、各組織切片に50〜100 μLを室温で5分間加えます。
8. スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
9. 光の露出を避けて、色あせ防止封入剤をスライドに一滴塗布します。スライドを風乾し、蛍光顕微鏡で核と標的シグナルの画像を観察および取得します。

3. 肺微小血管密度の定量化

1. 画像を取得します。
   1. 若年層と高齢者の両方の各肺葉について、10倍の対物レンズの下で肺微小血管密度信号とDAPI信号を観察します。
   2. 観察結果に基づいて、各チャンネルの光源強度と露光時間を標準化します。各肺葉の全領域をカバーするデュアルチャネル画像をキャプチャします。画像を 2 つのチャネルを持つ ND2 形式で保存します (図 2)。
2. 画像Jを用いて定量化します(補足図1)。
   1. ImageJソフトウェアを起動します。
   2. 指定された画像をImageJにインポートし、ロードして選択します。それに応じてチャネルを分割します。DAPIと_IB2 の両方の4チャンネルのND4形式でファイルをロードします。
   3. [分析]に移動し >スケールを設定し>画像パラメータを0.48μm/ピクセル( 写真パラメータによって異なります)に構成 >グローバル>OKに設定します。
   4. 同じ表示範囲を設定して、画像の表示効果を調整します。 [画像]を選択し>>明るさ/コントラスト>セットを調整します。2つのチャネルのそれぞれに個別に表示範囲を設定します、IB₄:0-10000;DAPI:0-20000。
   5. バックグラウンド信号の影響を排除するには、次の手順に進みます。 [Process] > [Math] > [Subtract] をクリックします。 背景のMagic Wand ツールによって検出された信号値に基づいて、背景信号を減算します、IB₄:3000;DAPI:300です。
   6. 元の画像に最も一致するしきい値を選択するには、[ 画像] > [複製] に移動します。
   7. 元の画像と複製画像の両方を選択します > タイプ > 8 ビット。
   8. 肺の微小血管系を正確に識別するために、適切な閾値を選択します。画像をクリックして >>しきい値>インターモードを調整します(元の図に対して最も現実的なしきい値を選択します)、[ 暗い背景]>[適用]>チェックマークを付けます。
   9. 動脈や静脈を含むマウス肺の大きな血管からIB₄ 陽性シグナルを除去する: Magic Wand ツールを使用して、複製した画像と比較して大きな血管を選択し、[ 削除]をクリックします(大きな血管の内皮細胞のIB₄ 陽性シグナルが除去されるまで繰り返します)。
      注:IB₄ 染色シグナルは、マウス肺の動脈および静脈の内皮細胞で検出されます。肺微小血管系の発生を特異的に検査するためには、より大きな血管の内皮細胞のシグナル病巣を均一に除去することが推奨されます。
   10. ターゲット信号の数をカウントし、[解析] > [測定値の設定] をクリックし、[エリア]、[しきい値に制限]、[ラベルを表示] にティックします。次に、[パーティクルの分析]を選択し、[サイズ]を0-無限大に設定します。真円度:0.00-1.00;表示する:過度にマスクします。[要約]にチェックマークを付けて、[OK]をクリックします。
   11. [Summarize Results (結果の集計)] > [File (ファイル>名前を付けて保存)] を選択します。
3. データ分析と統計
   1. 同じ画像で、IB₄ 陽性病巣と DAPI 陽性病巣の数をそれぞれ一致させ、統一されたテーブルに整理します。
   2. 示された若年層または年齢層の各葉の IB₄ 陽性病巣と DAPI 陽性病巣の総数を要約します。
      1. IB4_陽性病巣の総数を各葉の DAPI 染色病巣の総数で異なるグループで割ることにより、IB4 陽性病巣の割合 (%) を計算します。図3Aに示すように、IB₄陽性病巣の数、DAPI染色病巣の数、およびIB₄陽性病巣の割合(%)を示します。
   3. データ分析ソフトウェアを起動し、新しい列テーブルを作成します。
      注:ここでは、統計分析にGraphPad Prism 9を使用しました。
   4. グループAからグループJまで順番に「若頭蓋葉」、「旧頭蓋葉」、「若中葉」、「旧中葉」、「若尾葉」、「旧尾葉」、「若副葉」、「旧副葉」、「若左葉」、「旧左葉」と名付けます。次いで、対応する_IB4 陽性病巣(%)を表(補足表1)に入力する。
   5. ペアワイズ比較に対応のないt検定を使用して、2つの年齢グループ間の対応する地域の有意差を評価します。5つのローブに対して合計5つの比較を行います。
   6. 結果を視覚化するためのグラフを作成します (図 3B)。棒グラフを選択し、図に統計分析を含めます。

結果

主気管支の病変と小さな気道枝の病変を区別するには、これら 2 種類の気道の病変の連続構造が観察されていることを確認することが重要です。これは、 図1で概説した切断および埋め込みの手順に従って実現できます。マウスには多数の肺葉があり、さまざまな方向に向けられ、メッシュ状の構造を持っているため、他の固形組織と比較して崩壊しやすくなっています。標的領域の病変を明確かつ直感的に観察するためには、切断前に組織サンプルを数時間固定することをお勧めします。

図1:マウスの肺葉の代表的な写真は、合計5つの異なる葉を示しています。 左肺は1つの葉ですが、右肺には4つの葉があります(上から下へ:頭蓋...

ディスカッション

肺微小血管密度の研究は、肺の生理学的プロセスの理解や呼吸器疾患のバイオマーカーの定義に重要な意味を持っています。肺循環は、内皮細胞の細い層に包まれた広範な毛細血管表面積を誇っています。これらの細胞と肺胞上皮細胞の調和のとれた並置は、ガス交換の複雑なプロセスを容易にするために特別に設計された壊れやすい肺胞毛細血管膜を生じさせます³。このような細胞間コミュニケーションは、肺の生理学的プロセスのスペクトルを調節する上で極めて重要な役割を果たしており、呼吸機能の微妙なバランスを維持する上でのこの密接な関連の重要性を強調しています。したがって、肺の微小血管の変化を研究することは、ガス交換プロセスの肺の基本機能を評価するために重要です。さらに、微小血管密度の変化は、血流の調節に直接関連しています。微小血管密度の変化は血液灌流に影響を与える可能性があり、低酸素症や肺や他の組織への酸素供給障害などの状態につながる可能性があります。内皮細胞は、再生を調整し、制御解除された疾患^{促進プロセス}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% パラホルムアルデヒド	バイオシャープ	BL539A	組織固定剤
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインド	ール MCE	HY-D0814	核染料
Alexa-647 フッ素結合イソレクチン B4	サーモ	I32450	結合マイクロ血管
抗蛍光錠剤シーラー	アブカム	AB104135	サンプル固定
抗原修復液	バイオシャープ	BL151A	抗原部位の修復
生検カセット	ActivFlo	39LC-500-1	組織サンプルの固定と位置決め
ウシ血清アルブミン	Σ	B2064-50G	シーリングソリューション
コールドプレート	ライカ	HistoCore アルカディア H	サンプルの凍結
恒温電気乾燥オーブン	Taisite101-0AB	高温修理
使い捨てミクロトームブレード	ライカ	14035838383	切ってセクションを準備するための切
金型Shitai		26155166627	固定組織サンプル
エタノール	ケロン	CAS64-17-5	組織脱水溶液
加熱パラフィン埋め込みステーション	ライカ	EG1150	への TSSUE サンプルの埋め込み
	ライカ	HI1220	組織サンプルの平坦化と固定
ImageJ (フィジー)	NIH	1.54f	定量的ツール
免疫組織化学ペン	バイオシャープ	BC004	水遮断剤
医療鉗子	上海医療機器	N/A	組織サンプルの把持、操作、または移動
顕微鏡	ニコン	TS2	イメージングデバイス
封入剤	江源	無味	固定と保存ティッシュセクション
パラフィンワックス	SCHLEDEN	80200-0014	固定組織構造
PBS	Beyotime	C0221A	洗浄バッファー
ペントバルビタールナトリウム	北京化学試薬会社	Q / H82-F158-2002	麻酔回転
式ミクロトーム	バイオベース	BK-2258
滅菌はさみの準備上海	医療機器	N/A	セグメンテーション 組織サンプル
外科用メス	上海 医療機器	N/A	切断 組織サンプル
Triton	Solarbio	T8200	透過化液
ウォッシュフリースライド	PLATINUM PRO	PRO-04	用固定サンプル
	SUM	XK13-011-00031	組織脱ワックス液