涙由来の外色体miR-15aを糖尿病網膜症の新たな診断ツールとして

サマリー

本記事では、糖尿病網膜症の新しい診断ツールとして、裂傷からmiR-15aを採取・検出するプロトコルについて説明しています。

要約

糖尿病網膜症(DR)は糖尿病の主要な合併症であり、糖尿病患者のかなりの割合に影響を及ぼしています。早期診断と介入は、不可逆的な視力喪失を防ぐために極めて重要です。現在の診断方法は効果的であるものの、限界があります。miRNAは、標的mRNAの3'非翻訳領域(3'-UTR)に結合することでmRNAの安定性や翻訳を阻害する小さな非コードRNAであり、糖尿病と有意な関連があることがますます認識されており、裂傷から得られることもあります。本研究では、涙液由来の外小体miR-15aがDRの新規診断マーカーとしての可能性を調査しました。涙液サンプルは135名の糖尿病患者(糖尿病性網膜症[DR]36名、DRなし50名)と49名の健康対照群から採取されました。エクソソームを単離し、エクソソームmiR-15aの発現レベルをドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を用いて測定しました。結果は、糖尿病患者およびDR患者でエクソソームmiR-15aの発現が健康な人と比べて変化していることを示しました。これらの発見は、涙液由来の外色体miR-15aが糖尿病およびその合併症の分子メカニズムに関与している可能性を示しています。さらに、糖尿病網膜症の非侵襲的かつ信頼性の高い診断バイオマーカーとして高い感度と特異性を提供する可能性も秘めています。

概要

糖尿病性網膜症(DR)は、糖尿病の最も顕著な微小血管合併症の一つであり、世界中の何百万人もの視力を脅かしています。IDP Atlas 2019の人口データによると、DRの世界的な有病率は世界の糖尿病患者全体の22.7%と推定されており、新規感染者数は特に先進国および発展途上国で継続的に増加しています^。臨床的には、DRは初期段階のDRまたは非増殖性糖尿病網膜症(NPDR)、末期のDRまたは増殖性糖尿病網膜症(PDR)、および黄斑浮腫の存在を特徴とします。血管透過性の増加と毛細血管閉塞はNPDRでよく見られる病理学的変化であり、PDR ^2,3では虹彩、黄斑、視神経乳頭、網膜の異常な新生血管化が観察されます。PDRへの進行は硝子体出血や網膜剥離を引き起こす可能性があり、重大な視力障害を引き起こす可能性があります^。いずれの場合も、訓練を受けた眼科医による眼底鏡検査や眼底写真検査によって病理学的変化を検出^{できます。}標準的な眼底写真撮影法を用いると、糖尿病性網膜症は感度78%-96%、特異度86%-97%で検出可能です⁵.しかし、この方法は網膜に損傷が起きてからのみ検出します。ブロット網膜出血、微小動脈瘤、滲出液、新血管の増殖など、臨床的に目に見える網膜症状が現れる前にDRを早期発見する必要性が未解決です。

分子ツールの進歩により、がんや心血管疾患を含むさまざまな疾患の診断ツールとしてエクソソームが発見されました ^6,7。エクソソームは、ほとんどの細胞が細胞外小胞(EV)空間に分泌する脂質二重層膜によって結合されたナノサイズの粒子です。これらのエクソソームは血液、涙、唾液、尿などのバイオフルイドによって輸送されるため、非侵襲または低侵襲の診断手技に容易に利用^{可能です。}これらはタンパク質、脂質、核酸など、さまざまな起源細胞マーカーを運んでいます。特に注目すべきは、EV内に搭載されている小型非コードRNAです。これらのRNAはタンパク質としてコードされていませんが、遺伝子調節において重要な役割を果たし、膵臓のβ細胞を含む多くの生理学的および病理学的プロセスに関与していることが示^{されています。膵}臓の細胞は糖尿病の発症に非常に重要です。

具体的には、miR-15aは主にインスリン産生や膵臓のβ細胞機能の調節を通じて糖尿病の発症と強い関連があることが示されています¹¹。私たちのグループは最近、糖尿病性網膜症の血漿中でmiR-15aが変化していることを示しました。さらに、miR-15aは膵臓のβ細胞によって分泌され、血流を通じて網膜¹²に到達することも示されています。涙液は、非侵襲的かつ費用対効果の高い方法で眼から簡単に入手できる、容易にアクセスできる液体と考えられています¹³。これはさまざまなタンパク質、脂質、電解質、その他の分子の混合物を含み、眼表面や網膜を含む周囲組織の生理的状態を反映^{しています。}涙液中で血清や房水溶液よりも多くのmiRNAが検出されています^15,16。涙の組成は、糖尿病¹⁷を含むさまざまな全身性疾患に応じて変化します。実際、涙液分析は多発性硬化症や乳がんなど、眼に関連しない他の疾患のモニタリングや診断において有望な可能性を持つことが示されています(^18,19)。糖尿病性網膜症が眼に直接結びついていることから、この疾患における涙液の潜在的な診断的特性を探ることがより重要でしょう。糖尿病網膜症患者の涙液中のIL-1RA、IL-8、IL-6、TNF-αのレベルは変化が観察されており、これも疾患の重症度に応じて変化します^20,21。従来の眼底鏡検査と比較して、糖尿病網膜症の涙液分析はアクセスのしやすさ、非侵襲性、特異性の面で潜在的な利点を持ち、発症前の早期発見を可能にします²²。

したがって、本研究の主な目的は、糖尿病性網膜症集団の涙液からmiRNAを単離・定量することで、涙液由来の外小体外小体miR-15aが糖尿病網膜症の新規診断マーカーとしての可能性を調査することです。これにより、涙液スクリーニングによる糖尿病網膜症の新たな検出方法が生まれ、網膜合併症の発症前から検出可能となり、早期の予防や治療的措置が可能になります。

プロトコル

本研究は、マラヤ大学医療センター医療研究倫理委員会(参照番号:20165-2446)の承認を得て実施されました。採用前にすべての被験者から書面による同意が得られました。クアラルンプールのマラヤ大学医療センター(UMMC)眼科クリニックに通う患者から合計135名の被験者が対象となりました。対象基準には、UMMCの下でサービスを受けた20歳から80歳の患者が含まれていました。アクティブインスリン治療を受けている患者、過去3か月以内にレーザー治療または抗VEGF治療の既往がある患者、または通常の抗血小板薬または血液サラサラ薬を服用している患者は研究から除外されました。被験者は3つのグループに分けられました:(1) 健康な対照群(対照群)、(2) 網膜症なしの糖尿病(DM No DR)、(3) 網膜症併発糖尿病患者(DR)。プロトコルの概要は 図1に示されています。本研究で使用される試薬および装置の詳細は 材料表に記載されています。

図1:プロトコルの概要。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

1. 材料の準備    

1. 鉗子2本、綿球6個、ガーゼパッド4枚、トレイ、バイオハザードバッグを含む滅菌の基本ドレッシングセットを用意します。
2. 0.9%の塩化ナトリウム洗浄液5mLをトレイに注ぎます。
3. まぶた洗浄用のワイプを開けて、滅菌フィールドに置いてください。
4. 防腐液250μLのチューブを準備します。
5. 包装のままのくさび形でシルマーストリップを折りたたみ、滅菌ストリップを滅菌フィールドに置きます。
6. 無菌的に手術用手袋を着用してください。
7. 滅菌鉗子を使い、綿球に0.9%のw/v滅菌塩化ナトリウム洗浄液を湿らせます。

2. 被験者の準備    

1. 被験者が快適に座れるようにして、目を閉じるように頼みましょう。
2. 洗浄液に浸した綿球で眼窩周囲の皮膚を4回拭きます。
3. 眼瞼周りの皮膚をまぶた用の洗浄用ワイプで拭き取ってください。

3. 人間の涙液の採取

1. 側頭下窩に置いたシルマーズストリップを使って涙液を集めます。
2. 部分的に折りたたまれたストリップを右目に置く際、被験者に左を向くよう求めます。下まぶたを引き下げて下窩を露出させます。
3. 無菌鉗子を使い、下結膜窩の外側3分の2にシルマーストリップを貼ります。試料が汗や他の皮膚に付着するのを防ぐために、ストリップが皮膚に触れないようにしてください。
4. 皮膚が触れないように、ストリップの下にガーゼパッドを敷いてください。
5. 裂け目が20mmの地点まで、または最大5分までテープに吸収されるのを待ちましょう。
6. 20mmのレベルに達しない場合は、マーキングに基づいて裂け目のレベルを記録し、涙液量の標準化を可能にします。
7. 滅菌鉗子を使い、シルマーストリップを慎重に取り出し、1xリン酸バッファー生理食塩水(PBS)溶液を入れたチューブに入れます。
8. チューブをクーラーボックスに入れて、実験室へ運ぶ準備をします。
9. 眼窩周りの表面を、皮膚に残った溶液を拭き取りて清掃します。

4. 涙サンプルの前処理    

1. シルマーストリップ入りのチューブを室温で5分間PBSに浸したヴォルテックス。
2. ロッカーに乗せたチューブを室温で5分間かき混ぜます。
3. チューブを2000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
4. 溶液を新しいチューブに移し、ラベルを付けて-80°Cの温度で下流処理まで保ちます。
5. 残りのストリップは廃棄します。

5. エクソソームの分離

注意:RNA分離は、メーカーのプロトコルに従い市販キットを使用して行われます(材料 表参照)。

1. 涙液を氷で10分間解凍します。
2. 使用前に室温で15分間スピンカラムを平衡に保ちます。
3. カラムの下部の出口を取り外し、提供された廃棄物収集板に置きます。
4. 上部のシーリングマットを外し、重力で貯蔵バッファーをカラムを通過させます。
5. PBSを250μL加え、カラムを通過させます。
6. ステップ5.5を繰り返します。
7. 各カラムの上部に110μLのサンプルを塗布し、サンプルをカラムに挿入します。
8. カラムを提供されたサンプル採取プレートに移します。
9. PBSを100μL加え、カラムを通過してサンプル採取プレートに届けます。
10. カラムを廃棄物収集皿に移します。
11. 200μLのPBSを4個カラムに加え、最初のローディングで遊離タンパク質の割合を除去するためにカラムに入ります。
12. カラムに110μLのサンプルを加えます。列に入ることを許可してください。
13. カラムをサンプル採取プレートに置きます。PBSを100μL加え、カラムを通過させます。
14. サンプル採取プレートを100 x g で30秒間短時間遠心分離します。分離されたエクソソームはRNA分離の準備が整いました。

6. RNA単離

注意:RNA分離は、メーカーのプロトコルに従い市販キットを使用して行われます(材料 表参照)。

1. 単離エクソソームの被験者200 μLをRNA分離にかけました。
2. 分離したエクソソームに60μLの溶解バッファーを加えます。5秒のボルテックス。
3. 室温で3分間培養します。
4. 阻害剤沈殿バッファー20μLを加え、20秒のボルテックスを経て室温で3分間培養します。
5. 12,000 x g で室温で3分間遠心分離機にします。
6. 透明で無色の上澄液を新しいチューブに移します。
7. イソプロパノールを1量加えます。
8. 5秒ほどボルテックスし、キットに付属のミニスピンカラムに溶液を移します。
9. 室温で8000 x gの圧力で15秒遠心分離機を使います。流れを捨てましょう。
10. 700μLのRWTウォッシュバッファーでカラムを洗浄します。
11. 遠心分離機で8000× gで15秒間。フロースルーは捨てましょう。
12. 500μLのRPEウォッシュバッファーでカラムを洗浄します。
13. 遠心分離機で8000× gで15秒間。フロースルーは捨てましょう。
14. サンプルのミニスピンカラムに80%エタノール500μLを加えます。
15. 遠心分離機で8000× gで2分間加熱します。フロースルーチューブと回収チューブは廃棄します。
16. ミニスピンカラムを新しい2mLの収集チューブに入れます。
17. カラムとチューブを18,000 x g で5分間遠心分離します。フロースルーと収集チューブを廃棄します。
18. ミニスピンカラムを新しい1.5mLチューブに入れ、スピンカラム膜の中心にRNaseフリー水15μLを加えます。
19. 室温で3分間培養します。
20. 18,000 x g で1分間遠心分離機でRNAを溶出します。RNAは下流処理の準備が整っています。
21. ナノ粒子追跡解析を行い、品質管理およびRNA収量の検証を行います。

7. cDNA合成

1. メーカーのプロトコルに従い、市販キットを使用してcDNA合成を行います( 材料表参照)。
2. マスターミックスは 表1 に従って1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブで準備します。
3. ピペットで上下に混ぜて溶液を混ぜます。
4. マスターミックスの5.1 μLを0.1 μLのPCRチューブにピペットで送ります。
5. マスターミックスを含む割り当てチューブに9.9μLのサンプルを追加します。
6. PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、 表2に従って処理します。
   注:cDNAはさらなる解析の準備が整っています。

構成要素	音量/反応
10倍RTバッファ	1.5 μL
100M dNTPミックス	0.15 μL
RNAs阻害剤(200U/μL)	0.19 μL
マルチスクライブRT酵素(50U/μl)	1 μl
20倍RTプライマー	0.75 μL
RNAseフリーウォーター	1.51 μL
サンプル	9.9 μL
総体量	15 μL

表1:単離RNAからcDNA合成に使用されるPCRマスターミックスの調製。

ステップ	温度	期間
逆転写	16°C	30分
	42°C	30分
やめて	85°C	5分
ホールド	4°C

表2:cDNA合成のための熱循環条件。

8. デジタル液滴PCR

注:デジタルドロップレットPCR(ddPCR)は、メーカーのプロトコルに従い市販されているキットを使用して行われます(材料 表参照)。

1. 表3に従って1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブでddPCR用のマスターミックスを準備します。
2. ピペットで19.8 μLのマスターミックスを0.1 μLのPCRチューブに注入します。2.2μLのサンプルを加え、混合物を上下に10回ピペットで混ぜます。
3. 20μLのサンプル混合物をddPCRカートリッジのサンプルレーンに移します。
4. カートリッジのオイルレーンに50μLのオイルを加えます。
5. プレートのフックを使ってカートリッジにガスケットを取り付けます。
6. カートリッジをドロップレット発生装置に入れます。カチッという音は、カートリッジが適切にドロップレット発生装置に挿入されたことを示します。
7. 生成されたすべての液滴を96井戸板の井戸に慎重に移します。ネガティブコントロール井戸として、少なくとも1つの無テンプレートコントロール井戸を追加してください。
8. プレートシーラーマシンでピアス可能なホイルを使ってプレートを密封します(材料 表参照)。
9. プレートをサーモサイクラーに入れ、 表4に従って動作させます。
10. プレートを液滴読み取り機に移し、正の液滴と負の液滴を数えます。
11. コピー数/mLを、実行から生成されたコピー数/20μL値を定量化します。

構成要素	音量/反応
プローブ用のddPCRスーパーミックス2個(dUTPなし)	10 μL
20倍プライマー/プローブ	1 μL
サンプル	7 μL
RNAseフリーウォーター	2 μL
総体量	20 μL

表3:ddPCR用PCRマスターミックスの調製。

ステップ	温度	期間	ランプ	サイクル
酵素活性化	95°C	10分	各ステップごとに~2°C/秒	1
変性	94°C	30年代		40
アニーリング	60°C	1分		40
酵素不活性化	98°C	10分		1
ホールド	4°C	該当なし		該当なし

表4:ddPCRの熱サイクル条件。

結果

標準曲線
各患者から採取された正確な裂傷量を決定するための標準的な曲線が作成されました。基本的に、3μLから25μLまでの異なる保存液体積をシルマーストリップに曝露しました。また、シルマー川の湿潤地帯の距離も観察されました。各手順は3回繰り返され、平均値が計算されました。採取した裂痕の体積とシルマーの湿潤部分の距離の標準曲線(図2)が作成され、採取された涙液量の基準とされました。

図2:採取された裂痕の体積とシルマーの湿潤部分の距離の標準曲線。

ディスカッション

眼底鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、蛍光血管造影は、糖尿病性網膜症の検出において現在利用可能な検出技術です。これら3つの技術は、さまざまな網膜および脈絡膜疾患の包括的な評価を行うためにしばしば併用されます。眼底鏡検査は、糖尿病網膜症の評価中に定期的に行われる臨床検査です。この方法は訓練を受けた眼科医によって行われ、糖尿病網膜症の診断におけるゴールドスタンダードです。この方法は網膜の詳細な評価を可能にし、将来の比較のために網膜の外観を記録できること、写真の特定の関心領域を電子的に拡大すること、そして画像を^{電子的にアーカイブ}・送信する能力を備えています ^4,23。光的コヒーレンス断層撮影は光波を用いて網膜および視神経の高解像度の断面画像を提供します。蛍光血管造影では、網膜循環の異常を検出するために特定の染料を注入・照射^{する必要があります。}しかし、検出技術は発症後にのみ適用可能です。世界の糖尿病患者数の増加が予...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%塩化ナトリウム	Ain Medicare Sdn Bhd	GB16165967618
リン酸塩バッファー生理食塩水1個	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	10010-023
応用バイオシステム TaqMan MicroRNA逆転写キット	応用バイオシステム	4366596
ddPCRスーパーミックス(プローブ用)(dUTPなし)	バイオラッド・ラボラトリーズ	1863024
ddPCR 96ウェルプレート	バイオラッド・ラボラトリーズ	12001925
DG8カートリッジ	バイオラッド・ラボラトリーズ	1864008
DG8ガスケット	バイオラッド・ラボラトリーズ	1863009
プローブ用の液滴生成油	バイオラッド・ラボラトリーズ	1863005
エクソスピン-96エクソソーム分離キット	セル誘導システム	EX07-96
miRNeasy 血清/プラズマアドバンスドキット	キアゲン	217204
PX1 PCRプレートシーラー	バイオラッド・ラボラトリーズ	1814000
QX100 ドロップレットデジタルPCRシステム	バイオラッド・ラボラトリーズ	QX100
QXDx ドロップレットジェネレーター	バイオラッド・ラボラトリーズ	12001049
シルマー・ストリップ	オプティテック	SCH-100
T100サーマルサイクラー	バイオラッド・ラボラトリーズ	1861096
Taqman MicroRNAアッセイ MTOMED 20(アッセイID:000389)	応用バイオシステム	4440887	ターゲットシーケンス:UAGCACACAUAAUUGUGUG