低コストのエピミジオル筋電図電極の開発:製造と試験のための簡素化されたワークフロー

サマリー

私たちの目的は、エピミシス型筋電図電極の作製と試験に関する最新のわかりやすいガイドを提供することでした。そのために、材料調達の手順と、製造およびテストプロセスの詳細なウォークスルーを提供します。

要約

筋電図検査(EMG)は、神経筋の異常を検出するための貴重な診断ツールです。埋め込み型エピミシール電極は、前臨床モデルでEMG信号を測定するために一般的に使用されます。エピミシアル電極製造の原理を説明する古典的な資料は存在しますが、電極理論を実践に変換する説明的な情報はまばらです。これを改善するために、低コストのエピミジアル電極の製造とテストに関する最新のわかりやすいガイドを提供しています。

電極は、2つのプラチナイリジウム箔を折り畳み、事前にカットされたシリコーンベースに挿入して接触面を形成することによって作られました。次に、被覆されたステンレス鋼線を各接触面に溶接して電極リードを形成しました。最後に、電極をシールするためにシリコーン混合物を使用しました。 生理 食塩水浴中で、特注の電極を業界標準の電極と比較するためにEx vivo試験を実施しました。その結果、すべての波形で高レベルの信号一致(正弦波[クラス内相関 - ICC= 0.993]、二乗[ICC=0.995]、三角[ICC=0.958])、および時間同期性(正弦波[r = 0.987]、二乗[r = 0.990]、三角[r=0.931])が見られました。低レベルの電極インピーダンスも、電気化学インピーダンス分光法によって定量化されました。

また、ラットの外側広筋を特注電極で外科的に計装し、上り坂と下り坂の歩行中にシグナル伝達を獲得したin vivo 性能評価も実施しました。予想通り、下り坂の歩行時(0.008 ± 0.005 mV)は上り坂(0.031 ± 0.180 mV、p = 0.005)よりもピーク筋電図活動が有意に低く、このデバイスの有効性を裏付けています。このデバイスの信頼性と生体適合性は、移植後14日および56日での水平歩行時の一貫したシグナル伝達(それぞれ0.01 ± 0.007 mV、0.012 ± 0.007 mV、p > 0.05)および組織学的炎症がないことによっても支持されました。私たちは、低コストのエピミシアル電極の作製と試験のための最新のワークフローを提供しています。

概要

筋電図検査(EMG)は、筋肉の電気的活動を研究するための強力なツールです。EMG記録は、神経筋機能障害を治療するための介入の有効性を評価するために、前臨床動物モデルで特に役立ちます。これらのモデルでは、運動ニューロンと筋線維の間の神経生理学的界面を評価するために、埋め込み型生体適合性電極が一般的に使用されています。これらの埋め込み型電極は、筋肉の興奮を局所的に測定することができ、その構成、形状、および材料の点で多様であり、最適な設計は最終的に場所と使用目的によって決定されます。

前臨床モデルにおける筋興奮の評価に適しているにもかかわらず、エピミズム電極の使用はコストによって制限される可能性があります。その結果、多くの研究者は、自社で製造されたカスタムメイドのエピミシアル電極を使用しています。電極の製造、試験、および使用に関する基本的な考慮事項を詳述したリソースは存在します^{が 1,2}、最新の方法を使用したエピミシアル電極の調達、製造、および検証を詳述した最新の教育ガイドが必要です。Loeb と Gans³ などの電極理論の基礎研究に基づいて、低コストのエピミシアル電極の調達と製造に関する最新の指示を提示し、一連の ex vivo および in vivo 実験でその性能をテストします。その目的は、科学界の他の人々が動物用の低コストのエピミジア電極を社内で調達、製造、およびテストするためのユーザーフレンドリーなガイドを提供することであり、前臨床モデルにおける筋肉興奮のより広範な定量化を可能にすることです。

このプロトコルでは、現代の電気生理学研究室で動物が使用するエピミシアル電極の調達、製造、および試験に関する指導ガイドを提供します。形状、寸法、接触表面積、電極間距離、リード長など、製造用に選択された電極パラメータは、実験ニーズに合わせて選択され、市販の業界標準のエピミジアル電極と同等でした( 材料の表を参照)。他のグループには、これらのパラメータをニーズに合わせて変更するだけでなく、ユースケースに適した信頼性の高い業界標準の電極を選択することをお勧めします。

読者に電極性能を比較的迅速に理解していただくために、電極インピーダンスを測定するオプションを備えた ex vivo 試験プロトコルの例も提供しています。さらに、 in vivoでの電極性能の評価を例に挙げます。 ex vivo 実験では、カスタム作製の電極を生理食塩水浴で業界標準と比較し、安定した生理学的条件を模倣しました。インピーダンスは、電気化学インピーダンス分光法(EIS)を介して ex vivo でも評価されました。 in vivo 実験は、16週齢の雌Long Evansラット(HsdBlu:LE、Envigo)の外側広筋(VL)にカスタム作製の電極を外科的に移植して、高信号または低信号(上り坂、下り坂の歩行)を誘発することが知られている条件下でEMG信号を測定することで構成されました。カスタム作製電極の信頼性を評価するために、EMGシグナル伝達は、完全な外科的回復後および犠牲前(それぞれ移植後14日および56日)のレベルウォーキング中に取得されました。ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色を計装した筋肉に対して実施し、カスタム作製電極の生体適合性を評価しました。

プロトコル

in vivo 手順は、ミシガン大学の Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC 承認 #PRO00010765) の承認の下で、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。

1. 電極の調達・製作

注: 図1 は、すべての主要な製造手順の概要と、追加の視覚的な指示を提供するQRリンクを示しています。

1. 生体適合性電極材料は、製造のためにメーカーから直接バルクで調達します。すべての電極部品と調達の詳細が記載された 材料表を参照してください。
   注:シリコーンベース、シリコーンシーラント、およびプラチナ-イリジウム接触箔が生体適合性であることを確認して、有害な免疫応答を回避し、慢性的な移植を可能にします。自社製造の経済的利点をサポートするために、カスタム作製されたエピミシアル電極の詳細なコスト分析を業界標準と比較します(材料の表)。
3. シリコンベースに穴を開けます。シリコンベースをカッティング治具にのせてテープで留めます。コンタクト箔を配置するために、X-actoナイフを使用して切断治具のガイドを使用してシリコーンを穴を開けます。
4. ホイルをシリコンベースに挿入して、接触面を形成します。生体適合性のあるプレカットされたプラチナ-イリジウムコンタクトフォイル(1.25 mm x 5 mm)を折りたたみ治具を使用してU字型に折ります。次に、折りたたまれたホイルのアームをシリコンベースの穴あきスロットに導き、電極の接触面を構築します。このようにして、12個のホイルすべてをシリコンベースに挿入します。電極間には1本のカラムを空けておき、適切な間隔を確保します。
   注:この構成により、6つのバイポーラエピミシアル電極の製造が可能になります。カッティング治具を編集することで、必要に応じて容量を拡大することができます。
5. カッティング治具からシリコンベースを取り外します。接触面にサージカルテープを貼って、ホイルを所定の位置に保持します。次に、カッティングジグからシリコンベースを取り外し、U字型ホイルのアームが露出するように裏返し、U字型ホイルの片方のアームをシリコンベースと同じ高さに折ります。
6. 電極リード線を接続します。パーフルオロアルコキシ(PFA)被覆ステンレス鋼線を希望の長さに切断して作製します。次に、ステンレス製ワイヤーの一端を市販のライターで~1cm下げます。ステンレス鋼線のむき出しの端を、ホイルの広げたアームの内側に配置します。マイクロTIG溶接機を使用して、ステンレス鋼線をホイルのアームに溶接します(パルス幅= 0、溶接エネルギー= 25)。
7. リードフォイルインターフェースを点検します。ステンレス鋼線に張力をかけて、ワイヤーとホイルの接続をテストします。接続が保持されている場合は、ホイルのアームをシリコンベースと同じ高さに折り、シリコンシートに隣接するテープをはがします。
   注: 指定したユースケースで適用される張力を表す張力を適用します。
8. 電極をシールします。より薄い粘稠度を得るには、1 gの生体適合性液体シリコーンと0.75 mLのトルエンを混合します。18 Gの鈍い先端のシリンジを使用して混合物を引き出し、各電極の溶接面に適用して電極の背面をシールします。
   注意:トルエンは可燃性であり、飲み込んだり気道に入ったりすると致命的となる可能性があり、皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。ドラフトの下で作業し、直火を避けてください。
9. バッチを個々の電極に分けます。電極を取り扱う前に、シリコーントルエンを72時間設定してください。次に、はさみを使用して、シリコンベースを10 x 5mmのサイズの個々の電極に切断します。
   注:電極サイズは、切断治具の寸法と特定のユースケースによって異なります。超音波浴で電極をオートクレーブおよび/または洗浄します。

図 1.電極製造の手順。 (A)シリコンベースに穴を開けます。(B)折り畳み治具でU字箔を成形します。(C)U字型のホイルを穴あきシリコンベースに挿入します。(D)シリコーンベースには、6つのバイポーラ電極を形成するための12枚のホイルが含まれています。(E)カッティング治具から取り外す際に、ベースにサージカルテープを貼って箔を固定します。(F)カッティングジグからシリコンベースを取り外します。(G)Denude PFA被覆ステンレス鋼線をマイクロTIG溶接機を使用して直立ホイルアームに溶接します。(H)むき出しのワイヤーを位置合わせし、シリコーン-トルエンシーラントを塗布してセットします。(I)シリコーンベースを個々の電極に分割し、超音波浴で洗浄します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. ex vivo 試験

1. 電極を記録装置に接続します。各電極リード線を電極インターフェースボード(EIB)のチャネルにピンで固定します。比較のために、選択した業界標準の電極について、この手順を(同じEIBを使用して)繰り返します。EIBを磁気テザリングケーブルシステムを介してデータ収集プラットフォームに接続します。
   注:業界標準の電極は、信頼性が高く、実験的なニーズに適した任意の電極にすることができます。
2. EIBを接地します。PFAコーティングされたステンレス鋼の一端をデヌードし、接地源(ステンレス鋼のネジなど)にスポット溶接します。アースリード線を同じ電極インターフェースボードの指定された「アース」位置にピンで固定します。
3. 生理食塩水浴を設置します。ガラスビーカー(250 mL)に180 mLの生理食塩水(0.9%滅菌生理食塩水)を満たします⁴。カスタムメイドの業界標準のエピミシャル電極を生理食塩水浴に浸し、安定した位置に固定します。次に、接地源を生理食塩水浴に沈め、その位置を固定します。最後に、2つの刺激針電極を生理食塩水浴に浸して固定し、刺激電極を信号発生器に接続します。
4. 信号発生器を使用して、信号の一致と時間的同期を評価します。信号発生器を使用して、選択した電圧と周波数(0.1Vおよび5Hz)で繰り返し波形を刺激電極を介して生理食塩水浴に送達します(図2)。さまざまな波形(正弦波、方形波、三角波)を提供して、カスタム作製のエピミジアル電極間で記録された信号を業界標準と比較して比較します。
5. 性能を非公式かつ視覚的にリアルタイムで評価し、電極間の信号の変動の程度を評価します。クラス内相関 (ICC) とピアソン相関を実行して、シグナルの一致と時間的同期性をそれぞれ評価します。
   注:分析の目的で、8,000のサンプルを4,000 Hzで取得し、ハイパスおよびローパスのバターワースフィルター(ハイパス= 75 Hz、ローパス= 2 kHz)でリアルタイムでフィルタリングしました。
6. 電極インピーダンスを測定します。電極インピーダンスを測定するには、Richieらが以下に説明する手順を使用して、ポテンショスタットを使用して10Hz〜31kHz⁵の周波数でカスタム作製の電極(10個の電極など)にEISを収集します。⁶. バイポーラ電極の電極インピーダンスの測定に関する追加情報については、Sarolic et al.を参照してください⁷.
7. Richieらの手順に従って、エピミシス電極1 mmを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸します。銀-塩化銀(Ag|AgCl)参照電極と対極としてのステンレス鋼棒で回路を完成させます。
8. Agを一時停止|ビーカークランプを使用した1x PBSのAgCl参照電極とステンレス鋼ロッド。参照電極を使用するインピーダンスシステムの基準に接続し、使用するインピーダンスシステムの対電極入力に接続します。
9. ポテンショスタットを使用して、1 kHzのインピーダンススキャンを実行します。スキャン周波数を1kHz、0.01Vrms、1つの正弦波に設定します。スキャンの最初の5秒間は、ポテンショスタットを0Vに設定して、記録された信号を安定させます。ポテンショスタット関連ソフトウェアを使用して、測定値を記録します。

図2: 生体外 試験: 特注の電極、業界標準の電極、2つの刺激電極、および接地源を含む生理食塩水浴。信号の一致と時間的同期性は、信号発生器から正弦波、方形波、三角波を生理食塩水浴に送達し、データ収集プラットフォームを使用して各電極で検出された波形を記録することによって評価されました。注:電気化学インピーダンス分光法は図に写っていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 生体内 試験

注: in vivo 試験手順は、実験的な使用例を説明しています。カスタム作製のエピミジア電極は、ユーザーの意図した実験条件に一致する方法で in vivo で試験することをお勧めします。

1. 手術情報を確認します。次のリソースを使用して慢性神経記録電極を埋め込むプロセスを学んでいる外科医向けの情報を参照してください^8,9。
   注:私たちの原稿の焦点が電極の製造と試験にあるため、ここでは、 in vivo 電極試験のために私たちの研究室で使用されている外科的技術の簡単な概要のみを提供します。
2. 計装するラットを選択します(例:16週齢の雌のLong Evansラット)。ラットにトレッドミル順化の前に1週間の実験室順応を受けさせます。実験室で順応した後、ラットを徐々にげっ歯類のトレッドミルに最大16 m / minの速度でさらします。
3. EIBを準備するには、まず、各電極リード線をEIBのチャネルに固定することにより、カスタムメイドのエピミジアル電極をEIBに取り付けます。EIBを接地するには、PFA被覆ステンレス鋼ワイヤの一端をデヌードし、選択した接地(ステンレス鋼ネジなど)にスポット溶接します。次に、アース導線を指定された「アース」位置の同じEIBに固定します。
   注意: 計装中に電極を保護するために、電極を保護カバー(パラフィルムなど)で包みます。
4. 開始する前に、すべての手術器具と手術部位を消毒してください。密封された無菌手術用品を使用し、滅菌包装されていないすべての手術器具をオートクレーブします。サージカルドレープを使用して無菌の手術野を作成します。
5. 3-5%イソフルランと1L / min酸素を含む誘導チャンバーを使用して動物に麻酔をかけ、ラットを準備しながら2%イソフルランと500mL酸素を含むノーズコーンを介して維持します。麻酔の手術面に到達した後、つま先をつまんで評価し、眼軟膏を塗布し、呼吸数を監視し (70-110 呼吸/分)、直腸プローブを使用してコア温度を評価します。
6. 次に、動物用クリッパーで手術部位を剃り、手術部位から破片を取り除きます。手術部位を剃ったら、クロルヘキシジン、イソプロピルアルコール、ポビドンヨードを使用して手術部位の中心から外側に向かってこすり洗いして手術部位を消毒します。必要に応じて鎮痛薬を投与し、承認されたことを確認し、深部体温(37.5-38.5°C)を維持するために熱を提供します。調製後、ラットを定位フレームに配置し、無菌フィールドを確立します。
7. 外科医の適切な外科的準備のために、石鹸および/または消毒剤(クロルヘキシジン)を使用して手をよく洗ってください。適切なPPEを着用してください:マスク、滅菌手袋、使い捨てのガウン/スクラブトップ。何らかの理由で無菌技術に違反した場合は、新しい滅菌手袋を着用してください。
8. 右VLを器具にするには、メスを使用して右後肢の前外側部分に3〜5 cmの切開を行い、鈍的解剖を使用してVL筋肉を特定します。
9. 冠状縫合糸に沿って1cmの矢状面を切開し、頭蓋骨を露出させます。細い鉗子を使用して、右後肢から頭蓋骨の基部まで皮下トンネルを作ります。鉗子を使用して電極をつかみ、電極をVLに配線します。
10. ボーンドリルを使用して、頭蓋骨に穴を開けます(ドリルの仕様がアーススクリューの仕様と一致していることを確認してください)。接地ネジを固定し、歯科用セメントを使用してEIBを頭蓋骨に取り付けます。
    注:少量の過酸化水素を適用して、頭蓋骨の多孔性を高め、歯科用セメントの接着性を高めることができます。
11. VL筋を特定したら、4-0非吸収性モノフィラメントを使用して、筋線維に沿って埋め込まれたカスタム作製のエピミズ電極を埋め込みます。傷口クリップを使用するか、縫合して切開部を閉じます。
12. 閉鎖後、動物を麻酔から外し、清潔で乾燥した動物ケージに個別に収容します。ラットが加熱されたパッドで回復するのを待ち、動物が歩行できるようになるまで15分ごとにラットの体温と呼吸数を監視します。術後の痛みを治療するには、器具使用後数日間に承認された鎮痛薬を投与します。
    注:ラットは完全に回復するまで個別に収容する必要があります。
13. 14日間の期間後、 in vivo 電極試験を実施して、カスタム作製されたエピミズ電極の有効性を評価し、筋肉活動の生理学的変化を捕捉します。計装されたラットをげっ歯類のトレッドミルに置き、VL EMGシグナル伝達の増加または減少(16メートル/分で16°傾斜、16°低下)を引き出す上り坂と下り坂の歩行条件にランダムにさらします。縦断的なデータ(装置装着後14日や56日など)を収集し、長期にわたる信頼性を確保します。
    注: 14 日間と 56 日間の評価は、14 日間の期間として選択されています 完全な外科的回復と 56 日間の期間は、実験タイムラインを超えています。私たちは、他のユーザーが使用前に実験タイムラインを再現する時間枠を使用して電極の性能と信頼性をテストすることをお勧めします。速度(16m/分)と歩行条件(傾斜16°、下降16°)は、このモデル¹⁰で確立されたVL励起の増減条件に一致するように選択されました。
14. 実験のニーズに合わせて取得パラメータを変更します。データ収集プラットフォームを使用して、歩行中のEMG信号を2,000Hzの速度でキャプチャし、モーションキャプチャシステムと同期します。
    注意: 別の取得デバイスを使用している場合は、製造元の指示に従って、実験のニーズを満たすためにEMGとモーションキャプチャを収集します。
15. 各歩行条件から25秒の歩行データを抽出し、カスタマイズされたPythonスクリプトにエクスポートして、さらに信号処理と分析を行います。ベースライン調整 (ゼロ)、修正、および平滑化は、ビン幅が 50 ミリ秒の二乗平均平方根アルゴリズムを使用して行います。ピーク検出アルゴリズムを適用して、その後のデータ解析に利用するRMS-EMGピークを選択します。
    注:EMGデータを前処理および分析する方法は、プログラミング言語とEMG取得ソフトウェアおよびハードウェアによって大きく異なるため、簡単に説明しました。著者は、追加情報3,11,12,13について次のリソースを参照することをお勧めします。

4. 生体適合性試験

1. 縦断的EMG収集の終了後(または選択した時点で)、適切で承認された方法を使用してラットを安楽死させます(例:.、CO₂ を使用した窒息とそれに続く両側開胸術)。
2. 安楽死後、前外側の右肢と左後肢に切開を作成することにより、両側のVL筋肉を抽出します。液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。
   注:抽出中は、電極を計装された筋肉(右VLなど)の所定の位置に保つように注意してください。あるいは、副電極領域に印を付けるか、副電極領域から筋肉のみを抽出します。これは、対側筋/制御筋には適用されません。
3. クライオスタットを使用して、電極-筋膜界面の真下にある領域から連続した筋肉の断面積(7 μm)を切断します。対側VLの筋肉腹から切片を切り取り、コントロールとして機能します。クライオセクショニングの詳細については、Kumar et al.を参照してください¹⁴。
4. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色します。骨格筋断面¹⁵のH&E染色に関する詳細は、Wang et al.を参照のこと。
5. 染色された切片(計装および制御)を光学顕微鏡で20倍の倍率で調べます。サンプルの起源を知らなくても組織学的変化を解析します。次の病理学的特徴を使用して評価された組織の健康状態を評価します:免疫細胞の浸潤、内部筋核蓄積、線維形成、およびサルコレンマの断片化。

5. 推奨される統計分析

1. カスタム作製した筋外電極の性能を業界標準と比較して評価するには、選択した統計パッケージに ex vivo データをインポートします。カスタム作製および業界標準の電極から収集した ex vivo データ(例えば、正弦波、三角波、および矩形波からの8,000の代表サンプル)に、以下の統計的検定を適用します。アルファ レベル を a アプリオリに p ≤ 0.05 に設定します。
   1. 電極間の信号一致のレベルをテストするには、クラス内相関 (ICC) と Bland-Altman プロットを使用します。ICC 推定値とその 95% 信頼区間を、単一評価 (k = 2)、絶対一致、2 因子変量効果モデルに基づいて計算します。
   2. 時間的同期とも呼ばれる、時間の経過に伴う共変波形の記録の程度をテストするには、カスタム作製の業界標準の電極で収集された値に対してピアソン相関を実行します。
   3. 選択したカスタム作製電極(10個の電極など)からの両方の接触面(1kHzで測定)の平均電極インピーダンスを、業界標準の電極のインピーダンスと比較します。
      注:電極インピーダンスの値は、電極製造中に使用されるユースケースと材料によって異なります。
2. in vivo 記録の品質を評価するには、トレッドミルでの歩行中に収集されたデータを選択した統計パッケージにインポートします。
   1. in vivo試験(ラットの歩行が上り坂と下り坂の歩行によって摂動され、筋肉活動の生理学的変化を誘発された)中にカスタム作製電極の有効性を評価するには、ウェルチのt検定を実行して、上り坂と下り坂の歩行条件の平均ピーク値を比較します。
      注:読者は、ここで簡潔に説明されていない追加のテストと分析(信号対雑音比(SNR)評価など、EMG信号取得のDelysysの基本概念を参照)を実行することをお勧めします¹⁶。
   2. 電極のシグナル伝達の信頼性を経時的に評価するには、一貫した条件 (移植後 14 日間隔と 56 日間隔で 16 m/min で水平歩行) で収集された縦断的データを、対応のある t 検定によって評価します。

結果

生体外 性能
ICCは、すべての波形(正弦[ICC = 0.993]、正方形[ICC = 0.995]、三角形[ICC = 0.958]、p<.001)にわたって、カスタム製造電極と業界標準電極との間に高いレベルの一致を示しました。Bland-Altmanプロットは、電極間の信号の一致度が高いことも明らかにしました。Bland AltmanプロットとPearson相関は、カスタム作製電極と業界標準の電極との間に強い正の相関があることを 図3 にまとめています。ピアソン相関により、カスタムメイドの電極と業界標準の電極との間には、すべての波形(正弦波[r = 0.987]、正方形[r = 0.990]、三角形[r = 0.931])で高レベルの時間同期が明らかになりました。

図3: ex vivo 試験結果。 0.1 Vおよび5 Hzでの繰り返し(A)正弦波、(D)方形波、および(G)三角波のカスタム電極および業界標準電極からの生データ(B、E、H)それぞれの波形の8,000サンプルのカスタム電極とMicroProbe電極の電圧測定値の相関関係。(C,F,I)Bland Altmanプロットは、それぞれの波形の平均値に対するカスタム電極とMicroProbe電極の差の割合を評価します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

カスタム作製したエピミシアル電極の代表的なインピーダンススペクトルを 図4に示します。インピーダンス測定値は10Hzから31kHzで収集されましたが、結果はEMG取得に関連する周波数である1kHzで報告されています。業界標準(参照電極)のインピーダンスは2kΩでした。比較のために、カスタム作製した10個のエピミシール電極の平均インピーダンスは、接触面1と2でそれぞれ1kHzで7.95kΩ±3.61、1.63±1.59kΩでした。

図4:インピーダンス。 代表的なカスタム作製エピミシアル電極のインピーダンス値を ~ 1 kHz でのオーム (Ω) 単位で示したボード線の大きさプロット。チャネル 1 と 2 は、それぞれ接触面 1 と 2 に関連します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

In vivo での性能(補足ビデオS1)
カスタム作製の電極は、さまざまなトレッドミル歩行条件で誘発されるVL EMG活動の生理学的変動を効果的に捉えました。注目すべきは、平均ピーク筋電図活動は、下り坂の歩行時(0.008 ± 0.005 mV)が上り坂(0.031 ± 0.180 mV、p = 0.005)よりも有意に低いことがわかったことであり、これは以前の知見と一致している¹⁰。さらに、対応のある t検定により、14日時点のEMG振幅のピーク値(0.01 ± 0.007 mV)は、56日時点のピーク振幅値(0.012 ± 0.007 mV、p > 0.05)と有意差を示さず、デバイスの長期的な信頼性を裏付けていることが示されました(図5)。同じ記録条件下でEMGの大きさの値が大きく異なる場合は、電極の損傷または故障を示している可能性があります。

図5: in vivo 電極の信頼性。 計装後 14 日 (T14) および 56 日 (T56) での水平トレッドミル歩行 (16 m/分) 中の外側広筋のピーク EMG 振幅 (mV) のテューキー箱ひげ図。略語:EMG =筋電図;ns = 重要ではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

生体適合性
H&Eは、計装された筋肉(図6、右パネル)と比較して、対照筋(図6、左パネル)に炎症の証拠を示さなかった。これには、免疫細胞の浸潤、内部筋核蓄積、線維形成、および/または対照筋または計装筋から抽出された断面間のサルコレンマの断片化の明確な証拠は含まれていませんでした。

図6:生体適合性。 ヘマトキシリンとエオシンで染色した対照筋(左)と計装(右)の外側広筋(40x)の組織学的比較。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:Catch_tray.gcode。 折りたたみ治具から折りたたまれた箔をキャッチするために折りたたみ治具の一部として設計されたキャッチトレイの3D印刷テンプレート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:Cutting_jig.gcode。 カッティングジグの3Dプリントテンプレートは、シリコンベースに一貫して穴を開けるためのガイドとして等間隔のスロットが含まれています。カッティングジグは、20枚の箔を配置して10個のバイポーラエピミシャル電極を形成するように構成されています。ただし、現在、カッティングジグを使用して6つのバイポーラ電極のバッチを作成しており、電極間にスペースを空けることをお勧めします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:Folding_jig.gcode。 折り畳み治具の3Dプリントテンプレートにより、プラチナイリジウム箔を簡単に折りたたんで目的のU字型に形成できます。ホイルの折り畳みは、必要に応じて手動で行うこともできます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオS1: In vivo 試験。 カスタムメイドのエピミジアルEMG電極を使用して、電動トレッドミルで16m/minの衰退歩行(-16°)中のVLのEMG信号。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

私たちの目的は、EMG製造プロセスを合理化し、エピミシャル電極設計の広範な採用と実装を可能にし、アクセシビリティを促進し、神経筋研究を前進させることでした。この目的のために、低コストのエピミサイアル電極を社内で調達、製造、およびテストするためのユーザーフレンドリーなガイドを提供します。また、他の研究グループを支援することを考え、彼らの研究活動のための社内エピミジアル電極の製造を容易にするための補助的な3Dプリンティングテンプレートも提供しています。

これらの製造技術の採用を検討している研究者は、読者は次のことを考慮する必要があります:1)このワークフローで指定された電極パラメータ(形状、寸法、接触表面積、電極間距離、リード長など)は、実験モデルに合わせて選択され、さまざまなユースケースに合わせて変更する必要があります、2)リード線をコンタクトフォイルに溶接することは、成功裏に実行するための練習が必要な重要なステップです。溶接中にパルス幅と溶接エネルギーを調整することで成功率を高めることができます、3)リード線に張力を加え、溶接後にインターフェースの性能を評価してリード線と接触面の接続をテストすることが不可欠です、4)最終的な製造ステップには、電極をシリコーンでコーティングしてシールすることが含まれます。これは、電極の最適な性能を得るためのシンプルでありながら重要なプロセスです。シリコンコーティングは、移植中の真皮組織への刺激を防ぐために薄く比較的滑らかである必要がありますが、コーティングが薄すぎると電極の性能が損なわれる可能性があります。研究者は、シリコーンシーラントの堅牢でありながら薄く滑らかな層を実現するために、仕様に応じてシリコーンとトルエンの比率を変更することをお勧めします。

電極の性能を評価する際には、他の人が次の点に注意する必要があります:1) 私たちはin vivo 評価の例を提供しましたが、読者には、カスタム作製のエピミシアル電極の意図された使用例を模倣した in vivo テスト手順を使用することをお勧めします、2)私たちの in vivo テストプロトコルは、カスタムメイドの電極と業界標準の電極の同時埋め込みを空間的に許可していませんでした。そのため、電極間の信号一致を in vivo で測定できなかったため、評価できませんでした。3)さらに、私たちの in vivo テスト構成では、移植後の電極インピーダンスの評価ができませんでした、4)私たちのデータは、実験の必要性から比較的低いレベルの電圧(<1 V)で ex vivo でテストされたことを考慮することが重要です。したがって、これらの電極のオンボーディングを検討している研究者は、より高い電圧でその有用性をテストしたいと思うかもしれません。これらは、他の人が自分のエピミシャル電極をテストする際に考慮に入れる可能性のある考慮事項です。

先行研究は、運動ニューロン活動^17,18,19,20をより正確に解読するためのマルチチャネルおよび高密度記録電極の可能性を強調している。マルチチャンネルエピミジアル電極の開発と使用に関心のある方は、ここで提供する教育リソースを活用し、拡張することをお勧めします。記録電極としての役割に加えて、エピミシス電極は、神経刺激21,22,23およびプロテーゼ制御実験^24,25の刺激電極として一般的に使用されている。これらの目的でエピミズ電極を使用することに関心のある方には、私たちの研究に基づいて、独自のカスタムメイドのエピミーゼ電極の刺激能力をテストすることをお勧めします。

全体として、筋肉の電気的活動の定量化は、多くの病状の根底にあるメカニズムと潜在的な治療法の有効性を理解するための基本です。この更新されたワークフローは、筋骨格系の健康に関するこの重要な指標を確実に定量化するために使用できる、費用対効果の高いエピミジアル電極を社内で製造するための簡単なガイドを表しています。この方法論が、他のグループが独自のカスタムメイドのエピミシャル電極を製造およびテストするためのテンプレートとして役立つことを願っています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>電極材料
			電極あたりの数量と価格
接触面	プリンス&イザント PT90/IR10 1.25 mm x 5 mm ホイル	カタログ #1040055	電極あたり2個 フォイルあたり$7.50 電極あたり$15.00
PFA被覆ステンレス電極リード線	A-M Systems マルチストランド PFA コーティング ステンレス鋼線 50.8 & マイクロ;mストランド径	カタログ#793500	のリード線の長さに依存します(例:9インチのリード線x2) 25フィートスプールあたり128ドル フィートあたり5.12ドル インチあたり0.42ドル(x18) 電極あたり7.68ドル
折りたたみ治具	3Dプリント (.gcodeファイルを参照)	NA	NA
電極本体用シーラント	Nusil Med-1137液体シリコーン	カタログ #MED-1137	1グラム 2オンスあたり344.66ドル(59.15mL) 電極あたり5.83ドル
シリコーンベース	Implantech Alliedsilシリコーンシート強化、長期埋め込み型(8 "x 6") .007厚	カタログ#701-07	10mm x 5mm シート $225.00/8 x 6 inch $0.36/電極 (10 mm x 5 mm)
シーラント混合物用シンナー	トルエン 99.5% ACS 試薬 500mL または キシレン ACS 99.5%	カタログ #179418-500 ML	0.75 mL $25.53 / 500 mL $0.38 / 電極
シリコンベースを穿孔するためのテンプレート	カッティングジグ – 3D プリント (CADファイルを参照)	NA
NA カスタムメイド電極: $29.25
業界標準電極(EP105 EMGパッチ電極、2接点、片面、7mm x 4mm、ライフサイエンス用MicroProbe):$305.00
追加の製造材料
			電極あたりの数量と価格
3Dプリンティングソフトウェア	Solidworks(Solidworks、2022)
Micro-Tig溶接機	Micro-Tig溶接機(CD1000SPM、シングルパルス研究および光生産抵抗スポット溶接機、サンストーン)	SKU 301010	$3,500
超音波浴	超音波浴 (CPXシリーズ超音波浴、フィッシャーブランド).	15-337-403	NA
strong>Ex Vivo 試験材料
			電極あたりの数量と価格
データ取得プラットフォームおよびソフトウェア	DigitalLynx 4sX Base Cheetah version 6.0 (Neuralynx Inc.)	NA	EMG取得ハードウェアおよびソフトウェア
電極インターフェースボード(EIB)	EIB、EIB16-QC、Neuralynx Inc.	31-0603-0007	NA
信号発生器	5 MHz関数発生器、B&Kプレシジョン	4005DDS220V	$387.46
ポテンショスタ	ット PGSTAT1 ポテンショスタット (EcoChemie, Utrecht, Netherlands)	NA
NA ステンレス鋼ネジ	Fine Science Tools	19010-00	$98
Ex Vivo Testing Materials
			電極あたりの数量と価格
げっ歯類のトレッドミル	Exer 3/6 オープントレッドミル、Columbus Instruments	NA	NA
デンタルセメント	Excel Formula®ポアブルデンタルマテリアル、セントジョージテクノロジー株式会社	#24211	$125.60
光学顕微鏡	キーエンス BZ-X800, キーエンスコーポレーション, 大阪, 日本	NA
NA モーションキャプチャーシステム	Optitrack カラーカメラ、Optitrack、NaturalPoint Inc.	NA	NA
ピーク検出アルゴリズム	」SciPy.signal.find_peaks - SciPy v1.8.1 マニュアル」、2022	NA
NA Python ソフトウェア	Python ソフトウェア財団。Python 言語リファレンス、バージョン 3.9。http://www.python.org	NA
NA Rat	HsdBlu: LE, Envigo	140	NA
統計ソフトウェア	GraphPad Prismバージョン10.0.0 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA)	NA	NA