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方法論記事

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離

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DOI:

10.3791/66769

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2024年9月6日

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro アッセイを実行するためにプレーティングすることができます。

要約

ミクログリアは、脳の常在するマクロファージとして、脳の恒常性を維持するために不可欠です。彼らは、発生中にニューロン回路を形成し、破片や死んだ細胞のために環境を調査し、脳の感染や損傷など、さまざまな機能に対応します。しかし、神経発達やシナプス可塑性、病態生理学におけるそれらの重要な役割は完全には定義されておらず、さらなる研究の必要性が浮き彫りになっています。これらのプロセスにおけるミクログリアの役割をより包括的に理解するためには、ミクログリアを単離し、遺伝的、代謝的、機能的に特徴付ける必要があります。しかし、成体マウス、特に小さな脳構造からのミクログリアの単離は、ミクログリアが全脳細胞のごく一部を占め、単離されたミクログリアの収量が低すぎることが多いため、困難である。ここでは、CD11b+ マイクロビーズを用いたミクログリアの磁気的分離により、灌流したばかりの成体マウス脳の視床下部からミクログリア細胞を選別することができます。現在の方法では、細胞生存率を維持しながら、比較的高い純度と収率を短期間で達成することができます。

概要

ミクログリアは全神経細胞の5〜20%に相当し、卵黄嚢の赤骨髄前駆細胞に由来し、胚の日E9.5 1,2頃に発達中の脳にコロニーを形成し始める唯一のグリア細胞です。それらは、骨髄由来の細胞3とは無関係に、ゆっくりと自己再生を経る能力を持つ長寿命の細胞です。最も高度に動的な細胞の一部として、それらは文脈的および環境的な手がかりに応答して多様な表現型を獲得することができます2,4。その活動を調節できるシグナルの中で、中枢神経系(CNS)の損傷、ニューロンの活動、および栄養素が最も強力です。ますます多くの研究が、怪我、神経変性疾患、および肥満におけるミクログリアの重要な役割を示しています2,5,6。それにもかかわらず、生理学的プロセスと病態生理学の両方におけるミクログリアの正確な役割については、さらなる研究が必要です。したがって、DNA、RNA、タンパク質の局在化、定性的比較、およびミクログリアの形態学的特性評価にはin situ研究が適切であるため、さまざまな条件下でのそれらの転写、代謝、および機能の特性評価は非常に重要であり、それらの分離が必要です。

ミクログリアの単離には、Percoll勾配法7、フローサイトメトリー細胞選別法(FACS)8、磁気活性化細胞選別法(MACS)など、さまざまな手法が記載されています。適切な分析法の選択は、研究の目的と、ダウンストリームアプリケーションに必要な純度のレベルによって異なります。成体マウスの脳、特に視床下部のような小さな脳構造から純粋なミクログリアを単離することは、ミクログリア細胞の数が限られているため困難です。Miltenyi技術を使用した視床下部の自動穏やかな解離により、比較的高いミクログリアの収率を短時間で精製することができ、gentleMACS Octo Dissociatorを使用して最大8つのサンプルを同時に進めることができます。

組織の均質化に続いて、MACSカラムベースの技術と超磁性ナノサイズのCD11b+ビーズを使用したミクログリアの精製が行われます。したがって、すべてのサンプルはまったく同じ方法で処理され、無傷のCD11b+細胞が得られます。CD11bはミクログリアのみに存在するのではなく、マクロファージや単球を含む他の骨髄系譜細胞にも発現していることは注目に値する9。これを制限するために、視床下部抽出の前に氷冷生理食塩水による脳灌流(プロトコルステップ2.6を参照)は、ほとんどの骨髄細胞の排除を確実にし、常在マクロファージまたは血管に付着したマクロファージの潜在的に小さな部分のみを残します。健康な定常状態の中枢神経系の常在マクロファージおよび単球は、全脳免疫細胞のわずかな割合を構成する(それぞれ~10%および<2%)10,11。したがって、脳細胞をCD11b+ビーズで選別すると、ミクログリアとマクロファージの両方を単離することができますが、大多数はミクログリアです。

ミクログリアの最終収量とその生存率の維持により、特定の脳領域を解析できる利点を活かして、ex vivoおよびin vitroアッセイを行うことができます。最新の証拠は、ミクログリア集団が非常に不均一であり、領域特異的な遺伝子発現と形態学的特性および機能を表していることを示しています2,12,13。したがって、現在のプロトコルは、地域特異的な方法で成虫のミクログリアを分離および分析することを目的としています。実際、成体の視床下部ミクログリアの遺伝的、転写的、翻訳的プロファイルを、RT-qPCRやRNAシーケンシングなどの方法を用いて、またin vitro機能解析を行うことで特徴づけることができます。

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プロトコル

記載されているすべての動物実験は、欧州連合の勧告(2013/63/EU)に厳密に準拠して実施され、ボルドー大学の地元の倫理委員会(CEEA50)およびフランス高等教育研究イノベーション省によって承認されました(承認されたプロジェクトNTS-FR-619193 v.1、23-12-2022の非技術的要約)。

次のプロトコルは、平均生後 2 か月から 4 か月の成体 C57BL/6 マウスで実行されます。しかしながら、CNSの免疫細胞のランドスケープが変化し、常在するマクロファージおよび単球の割合が増加する可能性があること(例えば、老化および神経変性において)を考慮すると、全てのマウスの年齢および条件において実施することができる。

1. 溶液の調製

注:以下の容量および溶液は、厳密にはCd11b+細胞の単離を参照しています。

  1. サンプル数に基づいて、必要なD-PBS/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)の総量を決定します。市販のD-PBSとカルシウム、マグネシウム、BSA粉末を使用して溶液を調製します( 材料の表を参照)。
  2. 標識解離チューブ(Cチューブ)を調製し、成人の脳組織解離キットに付属の1,900 μLのバッファーZをそれぞれに充填します( 材料表を参照)。酵素を解凍し、次のステップで必要なすべてのバッファーとともに氷上に保ちます。
  3. 氷上での灌流(ステップ2.6)に必要な1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 材料表を参照)を調製し、常設します。各動物につき10mLに10%を加えた過剰量を計算します。
  4. RT-qPCR解析では、サンプルごとにqPCRバッファーを調製します:2.5 μLのチオグリセロール+ 250 μLの溶解バッファー、RNAを精製するための市販のキットを使用します( 材料の表を参照)。
  5. タンパク質の定量には、ホスファターゼ阻害剤カクテルとプロテアーゼ阻害剤カクテルを哺乳類抽出バッファーで1:100に希釈して溶解バッファーを調製します( 材料の表を参照)。
  6. 活性酸素種(ROS)の検出および食作用アッセイには、市販の10x HBSSから1x HBSSを調製します( 材料表を参照)。次に、1x HBSSに0.2% BSAを添加してFACSバッファーを調製します。

2.脳の除去

  1. キシラジンの20 mg / kgの用量で動物を鎮静させます。次に、400 mg / kgのペントバルビタールの過剰摂取でマウスを安楽死させ、解剖トレイに仰向けに置きます。.
    注:動物を安楽死させるための他の麻酔薬の組み合わせも機能します。
  2. 10 mLのシリンジに10 mLの氷冷した1x PBSを入れ、バタフライ21 G針に取り付けます。
  3. マウスが完全に麻酔をかけられたら(反応の欠如を確認するために足をつまんで確認します)、呼吸が止まり、心臓が細動になったら、鉗子で皮膚をテント張り、最後の肋骨と胸骨のレベルで胸腔をはさみで開きます。
  4. ハサミを使って、胸郭の側面に沿って胸郭の上部に向かって深く切り込みを入れ、心臓を露出させます。
  5. 21 Gの針を左心室の遠位部分に挿入します(針の約1/3が心室の内側にあることを確認してください)。すぐにハサミを使用して右心房を切開します。
  6. 氷冷した1x PBSを10mL注入して、循環免疫細胞から脳をきれいにします。
    注:脳を目視でチェックして、脳が清潔で十分に灌流されていることを確認します。
  7. マウスの頭を切り取り、脳を慎重に抽出し、氷で満たされてアルミホイルで覆われたシャーレの上に置きます。
    注:ペトリ皿とホイルは、脳の部分を見るのに役立ちます。代謝活動を制限するために、脳のピースを刻んでいる間、涼しい環境を維持することは有益です。
  8. 鉗子を使用して視床下部を分離し、かみそりの刃で細かく切ります。
    1. 視床下部を特定して解剖するには、脳を逆さまにして置き、皮質が腹側になり、視床下部が上面の背側に見えるようにします。湾曲した鉗子を使用して、第3脳室の両側の脳の底部にある視床下部を分離します。成体C57BL/6マウスの視床下部の平均重量は15mgです。
      注意: 脳の部分はできるだけ小さくする必要があります(<0.5 mm)。小さな断片に切断することは、細胞の解離を改善し、より高い収率を可能にするため、重要なステップです。
  9. 視床下部の断片を、1,900 μLのバッファーZをあらかじめ充填した解離チューブ(Cチューブ)に集めます(ステップ1.2)。
    注:アッセイを実行するのに十分なミクログリア細胞の良好な収量を得るには、チューブごとに最低2つ(タンパク質定量用)または3つ(qPCRおよびRNAseq用)の視床下部をプールします。

3.組織の解離

注意: すべての手順は氷上で実行する必要があります。どのステップでも細胞懸濁液をボルテックスしないでください。1,000 μLのピペットで慎重に混合するだけです。

  1. 表1に従って酵素ミックス2を調製します(すべてのチューブの総容量+ 10%の過剰量を計算)。各Cチューブに、ミックス1に含まれる酵素50 μL(表1を参照)と酵素ミックス2 30 μLを加えます。すべての酵素は、成体脳組織解離キットに含まれています(材料の表を参照)。
  2. Cチューブを閉じ、メーカーの指示に従って、加熱ブラケット付きの解離器に逆さまに置きます。プログラム 37C_ABDK_02を実行します。
  3. 15 mLのスナップチューブ( 材料表を参照)を準備し、その上に70 μmのストレーナを取り付けます。ストレーナーを2mLのD-PBSで濡らします。
  4. 解離/消化プログラムが終了したら、C-Tubeをストレーナーに空にし、200 μLのチップで引っ掻いて、細胞ろ過を増やし、フィルター上の組織ホモジネートの付着を減らすことで細胞損失を減らします。
  5. チューブを2 x 5 mLのD-PBSで洗浄し、洗浄液を空にしてストレーナーに付着させ、洗浄液の間に200 μLのチップで引っ掻きます。
  6. 300 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。 表1に従って、細胞ペレットを適切な量の冷たいD-PBSで慎重に再懸濁します。
  7. 直ちに450 μLの密度勾配試薬(デブリ除去溶液、 材料表を参照)と慎重に混合し、2 mLの冷D-PBSを非常に穏やかに重ねます( 表1を参照)。
    注:異なる密度グラジエント層を得るには、D-PBSを1 mLピペットで一度に1 mLずつ、可能な限り「乱れ」を抑えながら、一滴ずつゆっくりと重ね合わせる必要があります。
  8. 3,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、ゆっくりと加速し、ブレーキを遅くします(9がフルと等しい場合は5を使用します)。
  9. 3つのフェーズが形成されます。上部の 2 つのフェーズを完全に吸引し、破棄します。3番目のボトムフェーズを誤嚥しないように注意してください。
  10. 1800μLの冷たいD-PBSを充填し、チューブを3回静かに反転させます。
  11. 1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、全加速および全ブレーキで遠心分離し、上清を完全に吸引します。2 mLのD-PBS/BSA でゆっくりとピペッティングして、細胞ペレットを慎重に再懸濁します。

4. CD11b+細胞の磁気的分離

  1. 300 g×g、4°Cで 10分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。細胞ペレットを90 μLのバッファーD-PBS/BSA に慎重に再懸濁します。
  2. CD11b-マイクロビーズ混合物10μLを加え、ピペットでよく混ぜます。
  3. 氷上ではなく、冷蔵庫で2〜8°Cで15分間インキュベートします。1 mLのD-PBS/BSAを加えて細胞を洗浄し、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。500 μLのD-PBS/BSA に慎重に再懸濁します。
  4. 画面の指示に従って、セパレーターで POSSEL2 プログラムを起動します。小さな柱( 材料の表を参照)を磁場の中に置きます。
    注:マグネティックセルのソーティングには、予想される平均セル数に応じて、小さいカラムまたは大きなカラムを選択できます。小さなカラムの容量は最大1 × 107 、大きなカラムは最大1 × 108です。視床下部などの小さな構造から細胞を単離する場合は、小さなカラムが推奨されます。大きなカラムを使用する場合、試薬の容量は異なります(製造元の指示を参照)。
  5. カラム( 材料表を参照)を500 μLのD-PBS/BSAで濡らします。さらなる分析のために細胞の陰性画分(CD11b-)が必要な場合は、カラムの下にコレクションプレートを置き、カラムに細胞懸濁液を塗布します。
  6. 一度に500 μLのD-PBS/BSAをカラムに添加し、バッファーがカラムを通過するのを待つたびに、3つの洗浄ステップを実行します。
    注:カラムの上部が乾燥するのを防ぐことが重要であるため、すべてのバッファーが通過するまで待たないことをお勧めします。
  7. CD11b- フラクションの総流出物を収集プレートのウェルから15ミリリットルのチューブに移します。
  8. カラムをセパレーターから取り出し、5 mLのチューブにセットし、1 mLのD-PBS/BSAをカラムにピペットで注入します。
  9. カラムに付属のプランジャーをしっかりと適用することにより、磁気標識されたセル画分をすぐに洗い流します。
  10. 最終的には、血球計算盤またはその他の方法でCD11b + 細胞をカウントします。視床下部あたり~15,000個の細胞が期待できます。
  11. 細胞懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。

5. 分析

  1. RT-qPCR解析では、細胞ペレットをqPCRバッファー(調製についてはステップ1.3を参照)で再懸濁し、mRNAが抽出されるまでチューブを-80°Cで保存します。トータルRNAを単離し、MIQEガイドライン14に従って処理および分析します。最後に、cDNAを合成し、RT-PCRデバイスを使用してqPCRを実行します。使用されているすべての市販キットについては、 材料の表 を参照してください。
  2. タンパク質の定量には、細胞ペレットをD-PBS(BSAなし)で少なくとも2回洗浄してBSAを除去します。次に、2つの視床下部から細胞ペレットを20 μLの溶解バッファーで再懸濁します。タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質の定量を進めます( 材料の表を参照)。
    注:我々は、セリン/スレオニンキナーゼ活性アッセイを実施するためのタンパク質を定量するために、製造業者の指示15 に従った。
  3. ミクログリア細胞内の活性酸素種(ROS)を検出するには、ペレットを1x HBSSに再懸濁します。フローサイトメトリーアッセイのキットの製造元のプロトコルに従って細胞を治療します( 材料の表を参照)。次に、処理した細胞を200 μLのFACSバッファーに再懸濁し(調製についてはステップ1.5を参照)、FACSを実施して酸化ストレスを受けた細胞を検出します。
  4. 食作用アッセイでは、選別した細胞をD-PBS/BSAで蛍光ラテックスビーズ( 材料表参照)と30分間インキュベートします。ビーズの数を、セルあたり平均4つのビーズを持つように調整します。次に、300 × g で4°Cで7分間遠心分離し、200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、FACS(λex 575 nm; λem 610 nm)による蛍光発光を読み取ります。

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結果

最終収率の評価は、単離された細胞の純度と量に依存し、RT-qPCR、細胞計数、およびタンパク質定量によって決定できます。視床下部から単離された磁気細胞の純度は、RT-qPCRによるCD11b、C1qa、Gad1、およびGFAPの遺伝子発現解析によって確認されました(図1)。CD11bおよびC1qaは、主に定常状態でミクログリアによって発現され、CNS16 およびGad1およびGFAPは、それぞれニューロンおよびアストロサイトマーカーとして機能します。1つの視床下部からの総cDNAは55〜98 ngの範囲でした。注目に値するのは、正の画分のみがCD11bおよびC1qaの発現を示し、陰性画分ではミクログリア細胞の潜在的な損失がないことを示していたことです。プライマーを 表2に示します。

さらに、ニューロンマーカーとアストロサイトマーカーのマイナーレベルは、常在するマクロファージと単球が健康な脳の全免疫細胞ランドスケープのわずか10%を構成するため...

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ディスカッション

現在のプロトコルは、磁気活性化細胞ソーティングによる、新たに灌流された成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの分離を示しています。上記の結果は、単離された細胞の純度と生存率、およびこの方法が生体外でミクログリアを 機能的に特徴付ける方法の有効性、例えば食作用活性やROS産生定量化を通じて確認されています。特定の細胞集団を単離するための古典的な方法は、ミクログリア細胞にも使用できます。密度勾配分画は、サイズや密度に応じて異なる細胞とその粒子を分離するためのよく知られた方法です。この技術は、初代ミクログリアの単離と培養に適用できる可能性があります。しかし、成体ミクログリアの精製には、蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気細胞ソーティングを用いて、単離された脳細胞をさらにソーティングする必要があります。

具体的には、FACSは蛍光タグ付きの生化学的抗体に依存して細胞を標識し、サイズや代謝状態など、表面マーカーを超えた多数の変数に従って細胞を区別します。それにもかかわらず、細胞精製のプロセスは遅く、穏やかではないため、死細胞の数が増えるだけでなく、かなりの初期収量が必要...

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

ANは、フランス国立大学研究所(IUF)、ボルドー大学、フランス脳研究財団(FRC)、GLN(Lipid-Nutrition Group)、国立研究機関(ANR、PRC 2023-MicroNRJ)の支援を受けています。CAは、Fondation pour la Recherche Médicale(FRM-ARF201809006962)の支援を受けました。このプロジェクトは、MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
成人脳解離キットMiltenyi130-107-677このキットには、緩衝液Z、緩衝液Y、酵素AおよびP、破片除去液、緩衝液A(酵素Aを溶解する)が含まれています。
アルブミンウシ FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (ミクログリア) Microビーズ、ヒトおよびマウス - 小型Miltenyi130-093-636
CellROX グリーンフローサイトメトリーアッセイキットInvitrogenC10492
遠心チューブ、スナップポップ蓋 15 mLCellTreat978449
DPBS、カルシウム、マグネシウム、グルコース、ピルビン酸Gibco14287-072
gentleMACS C チューブMiltenyi130-093-237
ヒーター付き gentleMACS オクト ディスソシエーターMiltenyi130-096-427
Halt ホスファターゼ阻害剤カクテル (100x)サーモフィッシャー78420
Halt プロテアーゼ阻害剤カクテル、EDTA フリー (100x)サーモフィッシャー78437
HBSS (10x)、カルシウム、マグネシウム、フェノール不使用、赤色サーモフィッシャー14065056
ラテックスビーズ、カルボン酸変性ポリスチレン、蛍光赤色、シグマ・アルドリッチL3280
LightCycler 480 SYBR グリーン I マスターロッシュ 4707516001この試薬はPCRに使用しました。 
MACS SmartStrainers(70 & マイクロ;m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Assay KitThermofisher23235
M-PER Mammalian Extraction BufferThermofisher78503
MS ColumnsMiltenyi130-042-201プロトコルではスモールカラムと呼ばれています。 
MultiMACS Cell24セパレータープラスミルテニー130-098-637
PBSS、pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177このキットは、cDNAの合成に使用されました。
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011このキットには、1-チオグリセロールとBLバッファー(プロトコルでは溶解バッファーと呼ばれる)が含まれており、トータルRNAの分離に使用されました。
Vacutainer safety-lok 21 Gベクトン・ディキンソン367282
、

参考文献

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