PyOKR:光運動反射追跡能力を定量化するための半自動法

サマリー

ここでは、2次元画像の動きに対する視覚反応に起因する眼球運動を直接測定する半自動定量分析法であるPyOKRについて説明します。Pythonベースのユーザーインターフェースと分析アルゴリズムにより、従来の方法よりも高いスループットと正確なアイトラッキングパラメータの定量的測定が可能になります。

要約

視覚刺激に対する行動反応の研究は、視覚系の機能を理解するための重要な要素です。注目すべき反応の1つは、網膜の画像安定化に必要な高度に保存された先天的な行動である視運動反射(OKR)です。OKRは、画像追跡能力の堅牢な読み出しを提供し、さまざまな遺伝的背景を持つ動物の視覚系回路と機能を理解するために広く研究されてきました。OKR は、視面の端への刺激を目が追う低速追跡フェーズと、眼窩内の目の位置をリセットする代償高速フェーズ サッケードの 2 つのフェーズで構成されます。ゲインの定量化を追跡する従来の方法は、信頼性は高いものの、労働集約的であり、主観的または任意に導き出される可能性があります。アイトラッキング能力のより迅速で再現性のある定量化を得るために、私たちは、あらゆるタイプのビデオ眼球撮影装置に適応できることに加えて、あらゆる方向刺激に応答する2次元アイトラッキング運動の定量化を可能にする新しい半自動分析プログラムPyOKRを開発しました。この方法では、自動フィルタリング、低速トラッキングフェーズの選択、垂直および水平の視線ベクトルのモデリング、刺激速度に対する眼球運動ゲインの定量化、および結果データの統計的およびグラフィカルな比較に使用できるスプレッドシートへの整理が提供されます。この定量的で合理化された分析パイプラインは、PyPIインポートを介して簡単にアクセスでき、OKR応答の迅速かつ直接的な測定を提供し、それによって視覚行動反応の研究を容易にします。

概要

手ぶれ補正は、自己運動中に発生する全体的な光学の流れを補正するために、正確な眼球運動反応に依存しています。この安定化は、主に視運動反射(OKR)と前庭眼反射(VOR)^1,2,3の2^つの運動反応によって駆動されます。網膜を横切るゆっくりとした全体的な動きはOKRを誘発し、OKRは対応する方向に反射的な眼の回転を誘発して画像を安定させます^1,2。この動きは、遅相と呼ばれ、早速相と呼ばれる代償性サッカードによって中断され、目が反対方向に急速にリセットされ、新たな遅相が可能になります。ここでは、これらの高速位相のサッカードを視線追跡運動 (ETM) と定義します。VORが前庭系に依存して眼球運動を誘発し、頭部の動きを補う^のに対し3、OKRはONの発火とそれに続く中脳の補助光学系(AOS)へのシグナル伝達によって網膜で開始されます^4,5。網膜回路に直接依存しているため、OKRは、研究と臨床の両方の環境で視覚追跡能力を決定するために頻繁に使用されてきました^6,7。

OKRは、基本的な視覚能力^2,6,8、DSGC発達^9,10,11,12、眼球運動反応¹³、および遺伝的背景間の生理学的違い⁷を評価するためのツールとして広く研究されてきました。OKRは、動刺激¹⁴を与えられた頭部固定動物で評価される。眼球運動反応は、典型的には、様々なビデオツールを用いて捕捉され、視線追跡運動は、水平方向および垂直方向^のOKR波形として捕捉される9。トラッキング能力を定量化するために、トラッキングゲイン(刺激の速度に対する眼の速度)とETM周波数(特定の時間枠における高速位相サッカードの数)の2つの主要な指標が説明されています。ゲインの計算は、歴史的に、目の角速度を直接測定して追跡能力を推定するために使用されてきました。ただし、これらの計算は手間がかかり、ビデオ眼球撮影の収集方法とその後の定量化に基づいて任意に導き出すことができます。より迅速なOKR評価のために、ETM頻度のカウントは、追跡の鋭敏さを測定するための代替方法として使用されてきました⁷。これにより、トラッキング能力をかなり正確に推定できますが、この方法では、遅延位相応答を定量化するために間接的なメトリックに依存しており、多くのバイアスが生じます。これらには、サッカードの決定におけるオブザーバーバイアス、設定されたエポック全体で時間的に一貫したサッカード応答への依存、および遅い位相応答の大きさを評価できないことが含まれます。

現在のOKR評価アプローチでこれらの懸念に対処し、OKRパラメータの高スループットで詳細な定量化を可能にするために、OKR波形を定量化する新しい分析方法を開発しました。私たちのアプローチでは、「PyOKR」という名前のアクセス可能なPythonベースのソフトウェアプラットフォームを使用します。このソフトウェアを使用すると、OKRの遅い位相応答のモデリングと定量化を、より詳細に、より詳細に、より多くパラメータ化して研究することができます。このソフトウェアは、無数の視覚刺激に対する反応のアクセス可能で再現性のある定量的評価と、水平および垂直運動に応答する2次元の視覚的追跡を提供します。

プロトコル

ジョンズ・ホプキンス大学医学部(JHUSOM)で行われたすべての動物実験は、JHUSOMの動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)で行われたすべての実験は、UCSFのInstitutional Animal Care and Use Programによって承認されたプロトコルに従って行われました。

1. 行動データの収集

1. 波のデータ (つまり、球面座標での目の視線角度の時系列) を生成するために選択したビデオ眼球撮影法を使用して OKR の眼球運動を記録します。
   注:JHUSOMで収集された代表的なデータは、前述の^9,13(図1)のように、ヘッドポスト移植手術とビデオ眼鏡検査を使用して取得されました。UCSFから収集された代表的なデータは、前述の¹⁰(図7)で説明したように、ヘッドポスト移植手術とビデオ眼鏡法によって取得されました。
   1. 刺激と記録パラメータ(記録フレームレート、刺激の速度と方向、刺激エポック間と刺激エポック後の時間の長さ)をメモします。正弦波刺激の場合は、刺激波の振幅と周波数にも注意してください。
2. 収集した wave データを .水平および垂直(方位角と仰角)の波データを含むCSVファイル。
   1. ウェーブ データをタブ区切りの .水平データ (epxWave) と垂直データ (epyWave) を含む 2 つの列を含む CSV ファイル。

2. 解析ソフトウェアのインストール

1. Pythonをダウンロードしてインストールします。
   1. グラフの監視には、Anaconda経由でSpyderをインストールします。
   2. Spyderでグラフが正しく機能するようにするには、 Ipythonコンソール>グラフィック>グラフィックバックエンド>ツール>環境設定に移動します。 [Inline] を [Automatic] に設定します。
2. Python を使用して新しい Anaconda 環境を作成します。
3. pip install PyOKR を使用して PyPi 経由で PyOKR をインストールし、パッケージの依存関係 (補足コーディング ファイル 1 と補足コーディング ファイル 2) と共に最新バージョンをインストールします。
4. Windows コンピューターを使用している場合は、 PyOKR インポート OKR_winから o として 実行し、次に o.run() として実行します。
5. Mac コンピュータを使用している場合は、 PyOKR import OKR_osx から o として 実行し、 次に o.run() を実行します。

3. 波動データの分析

1. 解析とファイルインポートの初期化
   1. .pyスクリプトで o.run() を実行して、ユーザーインターフェースを開きます。
   2. [ファイル]で、[開く]機能またはCtrl + O [iOSコマンド]コマンドを使用して、ユーザーが目的のウェーブファイルを選択できるブラウザを開きます。
   3. ファイルの下で、エクスポートフォルダボタンまたはコマンドCtrl+Eを使用してフォルダブラウザを開き、最終解析のエクスポート先となる出力フォルダを選択できます。
   4. [出力ファイル]の下に最終的な解析ファイル名をAnimalGenotype_AnimalNumber_Analysisなどの推奨形式で入力します。
   5. [ファイル]の下の[サブジェクトの設定]コマンドまたは[Ctrl]+[S]コマンドを使用して、個々の動物のデータセットを初期化し、個々の動物のプログラムを設定します。
2. waveファイルパラメータの定義
   1. 刺激パラメータの設定を開始するには、[ Select stimulus direction ] で 4 つの基本方向のいずれかを選択して、指向性を定義します。正弦波刺激の場合、 それに応じて(水平) または (垂直) を含むものを選択し、基本方向が正弦波の初期方向を定義します。
   2. [Select stimulus type]で[Select stimulus type]で[Unidirectional]、[Oscillatory]、または[Oblique]のいずれかに設定します。
   3. 指向性を設定したら、自分の刺激位置データセットをインポートするか(自分の刺激ベクトルデータをインポート)、パラメータに基づいてベクトルを自動的に生成します(パラメータから刺激ベクトルを生成)。刺激ベクトルをインポートする場合は、3.2.3.1に進んでから、手順3.3にスキップします。スティミュラスベクトルを生成する場合は、次の手順に進みます。
      1. 独自のベクトルデータをインポートする場合は、ステップ3.2.1で説明したのと同じ形式で、刺激の距離値(つまり、刺激が隣接する各取得フレーム間を移動する距離を表す時系列)をインポートします。さらに、PyOKR v1.1.2 以降、インポートされた刺激値をサブセット化する機能は追加されていないため、データセット全体を個々のエポックに分割するのではなく、1 つのエポックとして分析します。
   4. 「Stimulus parameters」で、データ収集に使用するスティミュラスのパラメータを設定します。
      1. ヘッドとテールを使用して、特定の試行の開始時(ヘッド)と終了時(テール)で刺激を受けない時間の長さを設定します。
      2. 刺激が表示される時間、その後の無刺激時間、および特定の試行内の合計エポック数をそれぞれ [エポックの長さ]、[ 後刺激の長さ]、 および [エポック数] で設定します。
      3. 一方向刺激と斜め刺激の場合は、 Horizontal Speed と Vertical Speedを使用して刺激速度を度/秒で設定します。
      4. コレクションカメラのキャプチャレートを キャプチャフレームレートで設定します。
      5. 正弦波刺激の場合、 周波数 と 振幅を使用して振動刺激をモデル化するための正弦波を生成します。
   5. パラメータ化後、上記の入力された刺激情報から、 パラメータから刺激ベクトルを生成するを使用して適切なモデルを作成します。
   6. 入力された刺激の特定のエポックを選択し、[ エポックの選択 ]を使用して、全波ファイルをスキャンします。
3. 追跡フェーズの監督付き選択
   1. トラッキングが遅い領域を特定するには、[Unfiltered Data] または [Filtered Data] をクリックして [Preliminary adjustment] で高速位相サッケードを自動的に選択します。これにより、最大速度の変化に基づいて潜在的なサッケードにラベルが付けられます。
   2. [フィルタリングされていないデータ] で、サッケードが青い点で正確に選択されていることを確認します。自動選択が正確でない場合は、マウスの左ボタン(LMB)でポイントを手動で削除するか、マウスの右ボタン(RMB)でポイントを追加します。高速位相サッケードが適切に選択されたら、マウスの中央ボタン(MMB)でポイントを保存し、グラフを閉じます。
   3. 自動フィルタリングが必要な場合は、 Zスコアしきい値 を設定し、[ フィルタリングされたデータ ]をクリックしてサッケードを自動的にフィルタリングします。必要に応じて、手順 3.3.2 で説明したのと同じ手動監視を使用して、ノイズを除去します。
   4. 適切なサッカードを選択した後、 Point Adjustment を押して、削除する領域を選択します。ステップ 3.3.2 で前述したのと同様の制御スキームを使用して、上部と下部のポイントを変更します。上(緑)のポイントを LMB または RMB で編集し、下(赤)のポイントを Shift+LMB または Shift+RMB で編集します。ポイントが正しく配置されている場合は、 MMB を使用してポイントを保存します。
      注:Macを使用している場合、下端と上端の調整は2つの別々のボタンにあり、手順3.3.2で説明されているのと同じ制御スキームに従います。
4. スロートラッキングフェーズの解析
   1. Set Polynomial Order を使用して多項式モデルの順序を設定し、個々の低速フェーズに適合する多項式モデルを定義します。
      注:単方向または斜めの刺激の場合、トラッキングゲインを計算するには直線性が必要なため、デフォルト値は1です。正弦波刺激の場合、波の曲線をモデル化するには、既定値を 15 にすることで、より高い次数が必要です。
   2. トレースを解析するには、[最終解析]を選択して、選択した低速フェーズの低速フェーズモデル(図2)を生成し(図2A-Dを参照)、エポック全体で平均化された距離、速度、およびトラッキングゲインを計算します(図2E)。
   3. 選択した領域の 2 次元 (2D) または 3 次元 (3D) グラフを表示するには、それぞれ [2D グラフの表示 ] または [ 3D グラフの表示 ] を選択します。
   4. [ エポックの追加 ] を選択して、手順 3.4.2 で生成された収集された値を保存します。特定の動物に追加されたすべての値と、収集された試験の平均を表示するには、[ 現在のデータセットを表示] を選択します。
   5. エポックが追加されたら、ステップ 3.3.1 から 3.4.4 に従って、 Select epoch を使用してファイルの残りの部分を循環します。
   6. ウェーブ ファイルが完全に分析されたら、新しいファイルを開き、適切なパラメーターを設定し、それに応じて分析することで、特定の動物の他のすべてのファイルに対してこのプロセスを繰り返します。ファイルごとに手順 3.2.1 から 3.4.5 を繰り返して、特定の動物のすべてのウェーブ データを含む最終的なデータセットを生成します。
5. データの最終エクスポート
   1. 特定の動物のデータ分析が完了したら、すべての方向または刺激を分析して、 データのエクスポートを使用してデータセットをエクスポートします。
      注:生のデータセットは、 出力ファイル名 に基づいてエクスポートされ、 出力フォルダ で設定されたパスに沿って、各刺激パラメータの合計平均を含む個々のエポックデータを含むCSVとして保存されます。
   2. 個々の動物をエクスポートした後、Ctrl + S キーでデータセットを再初期化し、前のすべての手順を繰り返して新しい動物を分析します。
   3. 必要に応じて、[解析] タブの [データの並べ替え] コマンドを使用して、複数の動物について収集されたすべての出力データを再編成し、解析を容易にします。
      注:この機能は、出力フォルダ内に保存されているすべての分析された動物ファイルのすべての平均値をコンパイルしてソートし、グラフの生成と統計的な比較を容易にします。ソートは、v1.1.2 以降のファイルの名前に依存します。各ファイルに対して、手順 3.1.4 で説明されている推奨命名スキーム ( WT_123_Analysis など) を使用します。

結果

上記の解析方法を検証するために、野生型マウスと既知のトラッキング欠損を持つ条件付きノックアウト変異体から収集された波動トレースのOKRトラッキングゲインを定量化しました。さらに、私たちの分析方法のより広範な適用性をテストするために、異なるビデオ眼球収集法を使用して取得した野生型マウスの別のコホートから得られたトレースを分析しました。サッケードの自動フィルタリングにより、OKRデータの処理と分析が容易になります(図3)。単方向および正弦波刺激(図1D)からの記録を使用して、野生動物(n = 13)の単方向刺激に対する4つの基本方向(図2F)のOKRトラッキングゲインを計算し、水平および垂直の正弦波刺激(図4)に応答してゲインを追跡することも計算しました。単方向刺激と正弦波刺激の両方について、刺激方向に対する追跡能力の不一致は、すべての野生型マウスで一貫して観察され^{、2で説明されている}ように、垂直応答よりも有意に高い追跡ゲインを示す同様に堅牢な水平応答を示します。さらに、上向きと下向きの応答の間の非対称的な追跡ゲインは、以前に報告されているように、両方のビデオ眼球収集方法を使用した野生型マウスでも観察されます^2,10。公開されている OKR 応答の特性と比較したトラッキング ゲインの相対的な大きさと一貫性は、ソフトウェアを使用して計算されたトラッキング ゲインがトラッキング能力を正確に反映していることを示しています。一方向のゲイン計算に加えて、水平方向と垂直方向の眼球運動を同時にモデル化できるため(図5)、特定の刺激に反応した眼球運動を3次元的に再構成できます。これにより、クロスカップリングされた^{水平応答と}垂直応答9を調査する将来の研究に役立つ追加の定量化機能が提供されます。

異なる実験条件にわたる有意な行動変化を特定するためのソフトウェアの有用性を検証するために、公開されたデータ⁹を再分析して、高速位相サッカードの手動カウントによってその研究で評価された垂直追跡の欠損が、ここで提示された方法論を使用して追跡ゲインに反映されることを確認しました。以前の研究では、転写因子T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) の網膜における遺伝的不活性化が、Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre) を使用した条件付きノックアウトにより、上向きに調整された ON 方向選択的神経節細胞 (up-oDSGC) の特異的な損失を引き起こし、Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f) が特異的に失われることが示されています。Pcdh9-Cre変異体は、垂直OKR^追跡9の特異的な損失を示します。ここで説明する方法を使用した定量分析は、Tbx5f / f;Pcdh9-Cre動物は、前述のものと同様に、通常の水平追跡ゲインを保持し(図6A)、高速位相サッケード(ETM)(図2F)の手動カウントによって得られます。しかし、これらのマウスは、上向きと下向きの両方の刺激に応答して、垂直方向のトラッキングの有意な損失を示し、ほぼゼロのゲインを示します(図6B、C)。さらに、正弦波応答の分析により、Tbx5 cKO動物は、垂直方向のトラッキングが大幅に減少する一方で、水平方向のトラッキングゲインが大きいことが確認されています(図6D-F)。PyOKRを使用してこの前述の表現型を再解析すると、この新しい方法論の精度と感度が実証され、異なる遺伝系統のマウスにおけるOKR応答の定量的比較が可能になります。

最後に、UCSFで収集された野生型の垂直OKRトレースを分析して、さまざまなビデオ眼球撮影方法と刺激パラメータを使用したソフトウェアアプリケーションの有用性を検証しました。UCSFからのデータは、頭部固定動物¹⁰ (図7A)を囲む半球に405nmの波長のプロジェクターの反射を通じてマウスに可動格子を提示させる半球投影システムを使用して収集されました。一方向垂直格子を毎秒10度の速度でマウスに提示し、OKR応答を60秒間隔で記録しました(図7B、C)。垂直トレースをPyOKRを介して定量的に分析し、上向きの応答と下向きの応答を比較しました(図7D)。予想通り、上向きの反応は下向きの反応よりも有意に強かった¹⁰;ただし、トラッキングゲインは、JHUSOMで記録されたトレースと比較してわずかに減少しました(図2F)。さらに、正弦波応答の定量化をPyOKRを介して分析し(図7E)、正弦波運動刺激に対する垂直応答の有意な非対称性が計算されたゲインに反映されています(図7F)。JHUSOMとUCSFで収集されたゲイン値の差は、刺激速度、タイプ、波長の違いなど、刺激パラメータの違いに起因する可能性があります。しかし、各収集方法を使用して取得したデータの分析で観察される全体的な一貫性は、PyOKRがJHUSOM OKRデータ収集システムを超えて、ビデオ眼球撮影法に関係なく、他のOKR記録に簡単に適応できることを示しています。これらの結果は、ここで説明するソフトウェアプラットフォームが正確であり、眼球運動反応の研究に一般的に適用できることを示しており、異なるグループに属する動物間の正確な定量的比較を可能にして、視覚画像安定化回路の研究をさらに進めることができます。

図1:OKR応答データの収集 (A)前述の^9,13の行動刺激のためのOKR仮想アリーナ装置。4つのモニターが頭に固定された動物(1)を取り囲み、連続的に動く市松模様の刺激(2)を表示します。仮想ドラムは、4つの基本方向すべてに一方向の動きと振動正弦波刺激を示すことができます。マウスの左目を赤外線(IR)で照らし、カメラ(3)で記録して、アイトラッキングに反映された視覚系の反応を記録します。(B)アイトラッキングの解析は、瞳孔とIR光によって生成された角膜反射を捉えることによって行われます。仮想ドラムに応答した眼球運動のデータ収集および計算は、前述のように行われた^9,13。(C)垂直方向(Y波)と水平方向(X波)に移動する視線ベクトルの模式図。(D)一方向の上向きおよび後向きの動き、および垂直方向と水平方向の正弦波運動に対する目の追跡反応のサンプルトレース。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:一方向の視覚反応のトラッキング解析 (A-D) ゲイン解析のための低速トラッキングフェーズの特定と選択。サンプルの単方向トレースは、マウスの目に対する前方(A)、後方(B)、上方(C)、および下方(D)の動きに対する視覚的な応答とともに示されています。遅いフェーズは、手順 3 で説明した赤と緑の点を追加してサッカードを削除することで識別され、選択した低速フェーズは黄色で強調表示されます。多項式回帰は、トレースに線としてオーバーレイされます。(E)PyOKR読み出しに整理されたサンプルトレース(A-D)の定量化。各トレースについて、方向性に関係なく、合計 XY 速度とそれぞれのゲインが計算されます。一方向応答では、これらの合計速度は通常、特定の方向の個々の速度を反映します。ただし、正弦波応答の場合、この値は目の全体の平均速度を反映します。水平速度と垂直速度の成分は、それぞれの方向の速度を示すために分解されます。次に、提示された刺激速度に基づいてゲインが計算されます。(F)野生動物(n = 13)の4つの基本方向における追跡ゲインの計算値と、それらに関連するETM定量化と比較した結果。データは平均SD±示され、データは多重比較による一元配置分散分析で分析されます。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005、****p<0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:サッケードの自動フィルタリングにより、OKRデータの処理と分析が容易になります。(A-D)図2A-Dのトレースの自動フィルタリングは、サッケードを削除し、急速な速度変化を取り除き、遅い位相をつなぎ合わせることで、遅い位相の動きのみをモデル化します。最終的な傾きは、特定のエポックにおける眼球運動の合計を表します。(E)フィルタリングされたサンプルデータからのゲインの定量化(PyOKRリードアウトに整理されています)。(F)フィルタリングされていないサンプルとフィルタリングされたサンプルアイトレースのゲイン値の比較は、有意差を反映していません。データは平均 ± SD として表されます。データは、Mann-Whitney U 検定で分析され、フィルタリングされていない結果とフィルタリングされた結果の間で分析されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:振動視覚刺激に対するトラッキングゲインの導出 (A,B) 正弦波運動刺激に対する垂直(A)および水平(B)眼球運動の反応は、定義された振動刺激パラメータに対してモデル化することができる。選択した領域には黄色のラベルが付けられ、トレースの上に多項式近似がオーバーレイされます。刺激のモデルは、トレースの背後にオレンジ色の正弦波として表示され、各ポイントでの刺激が何であるかを参照できます。(C)野生型の正弦波応答(n = 7)のゲイン計算は、水平追跡能力と垂直追跡能力の間の非対称応答を反映しています。データは平均SD±示され、データは多重比較による一元配置分散分析で分析されます。**p<0.01,***p<0.005. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:指向性トラッキングは、その水平成分と垂直成分でモデル化できます。 (A)上向きの刺激に応答する視線追跡波の垂直成分。(B)上向きの刺激に応答する視線追跡波の水平成分。(C)垂直方向と水平方向の両方の全体的な眼球軌道。(D)下向きの動きに応答した時間の経過に伴う目の動きベクトルの3次元モデル。生のトレース データは赤で表示され、軌跡の回帰モデルは青で表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:Tbx5f / fでのOKRの分析。Pcdh9-Creマウスは、一方向の垂直追跡ゲインに有意な欠損を示しています。(A)TBX5F / f;Pcdh9-Cre動物は、水平追跡ゲインに有意な変化を示さなかった。(B,C)TBX5f/f;Pcdh9-Cre動物は、上向き(B)と下向き(C)の垂直応答のゲインの大幅な減少を示しています。(D,E)Tbx5f/fの正弦波応答;水平(D)および垂直(E)振動刺激に応答するPcdh9-Cre動物。(f)Tbx5f / fの定量化。Pcdh9-Cre振動応答は、水平トラッキングゲインの有意な増加を示しますが、垂直応答の減少を示します。データは平均SD±示され、データはMann-Whitney U検定で分析されます。*p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:代替のビデオ眼球撮影法から取得したデータへのPyOKRの適用 (A)説明されているように、OKR仮想ドラム刺激のための装置¹⁰。波長405nmのDLPプロジェクターは、凸面鏡を介して半球に反射され、動物の視野を囲む仮想ドラムを作成します。眼球運動は、半球の外側に配置されたNIRカメラを使用して測定されます。一方向および正弦波のバー格子は、頭部固定動物に垂直方向に示されます。(B,C)上向き(B)および下向き(C)のトラッキングフェーズが特定され、定量分析のために選択されます。低速フェーズは黄色で強調表示されます。(D)ここに記載されている方法を使用して野生型動物(n = 5)の垂直追跡から計算された追跡ゲイン。非対称のトラッキング能力が観察され、下向きのトラッキングが大幅に減少します。(E)野生型動物の追跡ゲインを定量化するためにモデル化された正弦波刺激に対する振動応答(n = 8)。低速フェーズは黄色で強調表示されます。(F)正弦波のゲインを定量化すると、上向きのゲインと比較して下向きのトラッキングゲインが減少していることが明らかになります。データは平均SD±示され、データはMann-Whitney U検定で分析されます。*p<0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:PyOKR Windowsこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:PyOKR Mac このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

PyOKRは、眼球運動に反映された視覚反応を研究するためにいくつかの利点を提供します。これには、精度、アクセシビリティ、データ収集オプション、パラメータ化や可変刺激速度を組み込む機能が含まれます。

ダイレクト・アイ・トラッキング・ゲイン評価は、眼球運動の正確な特性評価を提供し、従来の高速位相サッカード(ETM)の手動カウントよりも直接的な定量的な指標となります。サッケードカウントは便利ですが、実際のトラッキング動作を間接的に評価することができます。PyOKRソフトウェアプラットフォームは、サッカード振幅や低速位相の長さなどの追加パラメータを考慮して、トラッキング速度を直接定量化します。さらに、高速位相サッカードカウントは、一定期間のサッカード周波数の評価に依存しているため、各トレースには、動物のストレスによるランダムなサッカードを含め、ノイズがほとんどまたはまったくないことが必要です。これらの要因により、収集された多くのトレースが使用できなくなるため、アイトラッキングを正確に評価するためのデータ収集にかなりの時間がかかります。ただし、ここで説明するソフトウェアは、特定のトレース内の個々の低速フェーズを直接定量化し、トレースに沿った瞬間的なポイントでのゲインを計算することで、この問題に対処します。これは、眼球運動の速度を特定の点での刺激の速度と比較することによって実現されます。サッカード周波数は解析を定義するパラメータではなくなったため、ユーザーの監督下でノイズを簡単に除去でき、ノイズが解析の品質に与える影響を軽減できます。これにより、収集データの利用可能性が高まり、これらのデータを分析する際の統計的検出力が向上し、アイトラッキングを定量化し、個々のマウスや異なるマウスグループのOKRパラメータを特徴付ける際の精度と再現性が向上します。Zスコア法によって発見された眼球速度の急速な変化に基づくサッカードの自動フィルタリングは、トラッキングゲイン¹⁰を特徴付けるためにも使用されてきた。このフィルタリング方法をソフトウェアに組み込むために、このタイプの速度フィルタリングを含めましたが、このアプローチによって生成される潜在的なエラーを減らすために、しきい値のパラメータ化や手動サッカード監視などの追加ツールを含めました。自動フィルタリングを使用する代わりに生のトレースを解析に使用すると、サッカード、まばたき、またはマウスの苦痛によって引き起こされる眼球運動の急激な変化が、トレース速度のガウスカーネル密度推定による最大速度変化を通じて特定されます。これにより、セグメンテーション領域を自動的に選択し、最終的には手動のユーザー監視に基づいて削除することができます。手動監視により、ノイズの多いトレースの許容範囲が高くなり、ユーザーは誤検出または偽陰性のマーキングを迅速に修正して、目を迅速に変更できます。さらに、PyOKRは多項式近似を使用して特定の方向の一般的な眼球運動をモデル化するため、個々のポイントでのノイズが平滑化され、トレース内のノイズに対してある程度の許容範囲で軌道速度を評価できます。トレース全体のデータ品質が極端に悪い場合や、データ収集中に不適切なキャリブレーションが発生した場合に限り、ソフトウェアは正確なデータ解析を生成できません。まとめると、ユーザー監視、フィルタリング、および瞬時ゲイン計算ツールを組み込むことにより、ここで説明するPyOKRソフトウェアアプリケーションは、以前の方法よりも高精度でより直接的なメトリックで追跡ゲインを生成します。

PyOKRには、OKR分析をユーザーのニーズに合わせてカスタマイズできる多くの機能もあります。刺激パラメータの入力と生の刺激ベクトルにより、ユーザーは任意の所望の刺激を正確に定義することができます。これらには、単方向、正弦波、または斜めの刺激が含まれる場合があり、これらすべてをソフトウェアが使用して、関連する視覚応答の正確なトラッキングゲインを生成できます。この方法論のスティミュラスパラメータ化により、各フレームで計算された瞬時ゲインを、入力されたスティミュラスに関係なく、高精度で確実に生成できます。ここでは斜め刺激のデータは解析していませんが、分解されたXY速度ベクトルを使用して斜め角度を再構築することで正確なゲインを計算できるため、斜め刺激の正確なゲイン計算が可能になります。刺激設定のアクセス可能なパラメータ化を通じて、当社のツールは、あらゆる視覚刺激に応答する波動追跡に広く適用できます。さらに、このソフトウェアは、以前の方法と比較して、より高いスループットと再現性のある定量を促進します。OKR トレースの選別には、時間と労力がかかります。しかし、PyOKRの合理化されたユーザーインターフェースは、以前よりも高い速度で多くのトレースを簡単にスクリーニングすることができます。これにより、トレースの定量化が高速化されるだけでなく、眼球速度の直接定量化、眼球運動の方向ベクトル成分、運動ベクトルの水平成分と垂直成分の両方での刺激に対する瞬間的なゲインなど、追加のOKRパラメータも明らかになります。さらに、私たちの方法によって得られるサッケードの自動同定と追跡速度の計算を考えると、データ解析における潜在的な実験者のバイアスは、偽陰性を生成する可能性のある手動ETMカウントや自動トレースフィルタリングなどの他の定量化方法と比較して大幅に減少します。さらに、大量の行動データを生成し、自動的にコンパイルして、ダウンストリーム分析を簡素化できます。PyOKRで利用可能なデータエクスポートおよびソート機能により、複数の動物や条件にわたる追跡データを自動的に処理し、整理されたデータ保存と迅速な統計分析が可能になります。回路操作や視覚応答など、同じ記録セッション中に複数の条件を使用する実験を行う場合は、この単一の記録セッションから導き出された関心のある独立変数に基づいて個別のデータセットを保存できる離散波ファイルまたはサブセット化されたエポックでデータを収集することをお勧めします。たとえば、実験パラダイム内で異なる正弦波周波数に対する応答の違いをテストする場合、 WT_1_Freq0.1Analysis、 WT_1_Freq0.2Analysis 、 WT_1_Freq0.3Analysisなど、異なるパラメータを異なる波形ファイルに保存して別々の解析を行うことをお勧めします。現在のバージョンでは、エポックが分析されると、データセット内の個々のエポック値を選択する機能はありませんが、必要に応じて将来追加される可能性があります。

最後に、当社の方法は複数のビデオ眼球撮影収集法に適応でき、ラボの特定のニーズに合わせて簡単に調整できる堅牢な分析プラットフォームを提供します。野生型と既存の変異型OKRデータの分析、およびさまざまな方法と刺激を使用して収集された野生型のOKRデータの分析を通じて、ここで、分析ツールがa)任意の指向性刺激からのOKR追跡を高精度かつスループットで定量化する能力があることを示します。b)遺伝的摂動に起因する視覚系の行動の違いを特定する。c)さまざまなビデオ眼球撮影法からの視覚追跡データを評価する。当社の分析プラットフォームのアクセシビリティと一般的な適応性は、OKR応答のさらなる研究を促進し、眼球運動反応の文脈における神経回路の組み立てとダイナミクスを特徴付ける行動研究を強化します。

正確な測定値とその後の有用なデータ分析を得るためには、データ収集にいくつかのステップが必要です。動物が行動試験装置に順応し、動物のストレスが行動反応に与える影響を減らすために、複数のセッションでOKRデータを収集することをお勧めします。しかし、過剰な記録はOKR応答¹³の増強につながる可能性があるため、テスト体制の設計には注意が必要である。OKRデータ収集中、分析されたデータの品質は処理されたトレースの直接的な機能であるため、正確な定量化にはビデオ眼球撮影装置の適切なキャリブレーションが重要です。重要なのは、Matplotlib によるグラフ監視には Spyder IDE の使用が必要であることです。私たちのプラットフォームのアクセシビリティとフレームワーク設計を考えると、他の人がソフトウェアの機能を拡張し、このプラットフォームを明確な行動実験パラダイムに合わせて調整するために必要なすべてのツールを利用できます。

結論として、ここでは、既存の方法論を使用して現在利用可能なものよりも、より深く、より定量的な力でOKR行動反応を分析するための、新しく、アクセス可能で、用途の広いツールについて説明します。PyOKRは、Pythonの初心者ユーザーでも簡単に使用でき、厳密性と再現性を高めたOKR波の迅速かつ正確な分析のための確立された分析パイプラインとインターフェースが含まれています。このソフトウェアの適応性は、ユーザーが特定のニーズとデータ収集手順に合わせて簡単に調整できる柔軟なフレームワークを提供します。この定量的手法により、眼球運動反応の研究が進み、視覚系の行動を駆動する神経回路の発達と機能の理解が進むと期待されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J  マウス	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex recording chamber - UCSF	Custom-built	N/A	Harris and Dunn, 201510
>Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	B. Bruneau からの贈り物	N/A	Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-CRE)NP276Gsat / MMUCD	MMRRC	MMRRCストック#036084-UCD;RRID:MMRRC_036084-UCDの