方法論記事

前臨床焦点式超音波システムによるラットの血液脳関門開口部のモニタリング

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DOI:

10.3791/66793

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2024年9月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology & Biomedical Imaging, University of California, San Francisco, 2Department of Biomedical Engineering, Kyung Hee University, 3Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco, 4University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Radiation Oncology, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究では、頸静脈カテーテル法を受けた生きたラットを利用して血液脳関門(BBB)の開口部を監視する、磁気共鳴画像法(MRI)と低強度パルス焦点式超音波(FUS)を組み合わせたプロトコルについて説明しています。

要約

脳には、血液脳関門(BBB)と呼ばれる高度に選択的な半透性の血液関門があり、これが治療用高分子剤の脳への送達を防ぎます。MRガイド下低強度パルス集束超音波(FUS)とマイクロバブルプレインジェクションの統合は、非侵襲的で毒性のないBBB変調のための有望な技術です。MRIは、優れた軟部組織の造影剤と、血管透過性、灌流、MRI造影剤の時空間分布など、さまざまな定量的評価を提供できます。特に、ガドリニウムベースのMR造影剤による造影MRI技術は、BBB開口部を検出するためのゴールドスタンダードであることが示されています。この研究では、ラットモデルでBBBの開口部を監視するためのMRIプロトコルと動物手順を含む包括的な方法論を概説しています。ラットモデルは、頸静脈カテーテルの利用という追加の利点を提供し、迅速な投薬を容易にします。定位誘導前臨床FUSトランスデューサーは、動物処置やMRIプロトコルの改良と合理化を促進します。結果として得られる方法は、再現性とシンプルさを特徴とし、専門的な外科的専門知識の必要性を排除します。この研究は、ラットモデルを用いた前臨床手順の最適化に貢献し、神経障害の治療介入を強化するためのBBBの調節に関するさらなる研究を促進することを目的としています。

概要

BBBは、血管と脳組織の間のイオン、分子、および細胞の動きを調節します1.この機能により、神経細胞の機能と健康を維持しながら、治療用高分子剤の脳組織への送達を防ぐことができます。BBBの透過性が限られているため、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病などの脳腫瘍や神経変性疾患の治療の有効性と有効性が低下する可能性があります2。したがって、対流増強送達、直接頭蓋内注射、浸透圧破壊、強化された薬物設計などのさまざまなアプローチが、治療薬の制御された送達のためにBBBを回避するために研究されてきました3,4,5。

しかし、これらのアプローチには、侵襲性、感染リスク、出血リスク、不均一性、薬物の急速な流出など、固有の制限があります。マイクロバブルの注入を伴う低強度パルス集束超音波(FUS)は、局所的で可逆的なBBB破壊を可能にする有望な非侵襲的技術です。超音波とマイクロバブルの機械的影響は、BBBの透過性(つまり、BBBの開口部)を一時的に変化させる可能性があります6,7。BBB開口部を利用した治療応用がさらに進歩するためには、in vivo小動物実験が不可欠です。

この研究では、ラットモデルでBBBの開口部を監視するためのMRIプロトコルと動物手順を導入しました。プロトコルには、商業組織によってカニューレ挿入された頸静脈カテーテルを備えたラットモデルが含まれていました(材料の表を参照)。頸静脈カテーテル法のラットモデルには、迅速な投薬、血行動態モニタリング試験、および安定したカテーテル法の潜在的な利点があります。BBBの開口は、前臨床のFUSシステムを使用して達成されました。ラットやマウスなどの小動物モデルのBBB開口部用に特別に設計されたこのシステムには、ベンチトップシステム、制御コンピュータ、トランスデューサ、水デガッサー、付属のアクセサリなどの必須コンポーネントが組み込まれています。この定位誘導前臨床FUSシステムの使用は、精度を向上させるだけでなく、動物の手順やMRIプロトコルを合理化し、実験プロトコル全体の再現性とシンプルさに貢献します。

プロトコル

この研究のすべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。この研究では、雄のSprague-Dawleyラット(200-250 g)を使用しました。ラットは、マウスとラットの国立衛生研究所の動物管理および使用ガイドラインのオフィスに従って飼育され、世話をされました。試薬や使用した機器の詳細は、資料表に記載されています。

1. 動物の調理法

注:社内での手続きでは、動物は準備室に運ばれ、手続きは次のように行われました。

  1. ラットを個別にルーサイトチャンバーに入れ、医療用酸素タンクから抽出した酸素と混合したイソフルラン(2%-3%)を意識不明になるまでさらします(施設で承認されたプロトコルに従って)
    注: イソフルランを使用した麻酔により、長期 MRI プロトコルの実装が可能になります。
  2. ラットをチャンバーから取り出し、脱毛(脱毛)クリームを使用して首の前部と後部の髪を剃ります。.
  3. 潤滑剤軟膏を目に塗ります。
  4. 鼻をノーズコーンに入れて、自発呼吸で麻酔を維持します(イソフルラン気化器は2%〜2.5%、酸素流量計は1〜1.5 L / min)。
  5. 麻酔をかけたラットを加熱された手術台に置き、つま先をつまんで確認します.
    注:MRIプロトコルには、T1強調グラジエントエコーイメージングやT2強調スピンエコーイメージングなどの造影シーケンスが含まれていました。これらの配列は、血液脳関門(BBB)の透過性を評価するために、ガドリニウム(GAD)ベースの造影剤の注射前と注射後の両方で実施されました。これには、ラットがMRIスキャナーにいる間にGAD造影剤を投与することが含まれます7。このプロセスを容易にするために、ラットにカニューレを挿入したカテーテルから伸びるカテーテルチューブを使用した。延長部には、カテーテルコネクタと30cmのポリエチレンチューブが含まれていました。開存性を確保し、漏れを防ぐために、延長チューブはヘパリン化グリセロール(250 IUヘパリン/ 1 mLグリセロール)で洗い流されました。

2. 定位誘導集束超音波装置

注:動物は移され、定位FUSシステムのテーブルに置かれました。ラットの鼻を鼻円錐に入れて麻酔を維持しました。FUSシステムは、ファンクションジェネレータ、RFアンプ、およびオシロスコープで構成されています。トランスデューサーをセットアップする前に、すべてのデバイスがシステムに適切に接続されていることを確認しました。トランスデューサーのセットアップは、次の手順で完了しました。

  1. 頭蓋骨のブレグマの位置に鋭いポインターを置き、その位置を保存します。ブレグマの位置は、正中線8でラムダの前方9.0 mmの位置を指すことで識別できます。ラムダは、両側の鼓膜9の間の線の中央にあります。
  2. ラットの頭、水結合バッグ、およびトランスデューサー(1MHz周波数)に超音波ゲルを置きます。ラットの皮膚、水結合バッグ、およびトランスデューサーの間に気泡が存在しないことを確認してください。
  3. トランスデューサーの同軸BNCケーブルをFUSシステムモジュールの入力に接続します。
  4. 制御コンピュータ内)事前に登録されたラットの画像については、ロードをクリックしてください。いくつかの焦点と音圧が選択されます。
  5. 制御コンピュータ内)処理モジュールのモーションテストをクリックして、トランスデューサがバースト期間内にスポット間を移動できることを確認します。
  6. ステップ3で説明した超音波処理パラメータを設定します。

3.マイクロバブル注入と超音波処理

  1. マイクロバブルを活性化します.
    注:この研究で使用されたマイクロバブルは、直径1.7μm、濃度0.2 × 109粒子/ミリリットル10によって特徴付けられました。マイクロバブルバイアルは、ベンダーから提供された処方指示と以前に公開されたレポートに基づいてアクティブ化されました11。
    1. ルアーロックチップ付きの5 mLシリンジを準備し、5 mLの無添加0.9%塩化ナトリウム注射液を充填します。
    2. 緑色のキャップを取り外し、シリンジを時計回りにねじ込んで、通気孔のあるディスペンシングピン(材料の表を参照)に接続します。
    3. ピン保護を取り外し、バイアルのゴム栓の中央に置きます。スパイクがストッパーに完全に挿入されるまで、しっかりと押し下げます。
    4. プランジャーロッドを押して、5 mLシリンジ全体をバイアルに空にします。.
    5. バイアルを20秒間激しく振って、すべての内容物を混ぜ合わせます。一貫した白色の乳白色の液体は、六フッ化硫黄脂質ミクロスフェアが形成されたことを示します。
    6. 必要な用量を得るには、シリンジを反転させ、懸 ?? 液の意図された容量をゆっくりと5 mLシリンジに引き出します。.
  2. 輸液ポンプを使用してください.
    注:注入アプローチ12は、シリンジポンプを使用してラットにマイクロバブルを送達するために使用されました。マイクロバブルの入った注射器をラットに挿入したカテーテルコネクタに接続しました。マイクロバブルをポリエチレンチューブで移送し、輸液ポンプの流量を0.66mL/minに設定しました。この注入速度により、3mLシリンジから2mLのマイクロバブルを3分間にわたって注入できます。注入は、超音波処理の前に1分間開始され、2分間の超音波処理期間を通じて継続されました。.
  3. 超音波処理を行う.
    注:この研究では、FUSパルスは次のパラメータで選択されました:(1)ターゲット領域:左海馬;(2)スポットの数:脳の海馬をカバーするために6つ。(3)バースト長:10ミリ秒。(4)バースト期間:1200ミリ秒。(5)音圧:0.65MPa;(6)FUSシステムの超音波処理モードメニューの「バーストモード」。(7)超音波処理時間:120秒。

4. 3T前臨床スキャナーを用いたMRI検査

  1. 超音波処理後、動物を前臨床3Tクライオジェンフリースキャナーのテーブルに移します。
  2. ラットを腹臥位に置きます。スキャナーの加熱パッドの温度を維持し、空気圧ピローセンサーを使用して呼吸数を監視します。MRIプロトコルを実行して、さまざまなタイプのMRイメージングをテストします(表1)。
  3. 造影MRIに加えて、拡散強調イメージング(DWI)、T2*マッピング、T1マッピング、動的造影(DCE)MRIなどの他の定量的イメージング技術を含め、さまざまなイメージング研究に対する潜在的な実用性を実証します。この研究で使用された MRI プロトコルについては、表 1 を参照してください。
  4. T1 強調 MR グラジエント エコー シーケンスの後に GAD ベースの MRI 造影剤 (Gadavist、1 mmol/kg) を注入し、GAD 後の画像を取得します><。 注:200gラットの場合、200μLのMRI造影剤を注入し、続いて200μLの生理食塩水を使用してチューブを洗い流しました。

5. ラット脳の肉眼的検査

注:MRIスキャン後、2mLのエバンスブルー溶液(リン酸緩衝生理食塩水で希釈した2%)を注入し、ラットを少なくとも30分間休ませて、溶液が全身に広がり循環するのを許しました。その後、ラットは、脳の肉眼的検査のためにイソフルラン(5%)の過剰投与を使用して安楽死させられました(施設で承認されたプロトコルに従って)。安楽死を確認するためには、つま先をパンチする必要があり、動物は少なくとも1分間の呼吸停止を観察しました。灌流手順が行われ、続いてラットの脳の検査が行われました。灌流手順は次のように要約されます。

  1. 手術用ハサミを使用して開胸術を行い、胸部の臓器を露出させ、心臓領域を視覚化します。
  2. 右心房を切開(~5 mm)します。
  3. 灌流のために生理食塩水を左心室に導入します。
  4. 手術用ハサミで頭蓋骨を開き、脳を明らかにして提示します.
    注:適切な灌流により、脳は均一に明るく見えるはずですが、持続する青い領域は、エバンスブルーで検出されるように、BBB関連のアルブミン漏れを示します。.

結果

本研究では、市販の動物用FUSシステムを用いてラットモデルにおけるBBB開通をモニタリングするための前臨床プロトコルを提示します。FUSシステムは、ベンチまたは大型のカートキャリア上に設置されました（図 1）。ラットは、トランスデューサホルダーを備えたフレーム内のノーズコーンを通じて、酸素を混合したイソフルランで麻酔をかけられました。音響キャビテーションを検出するために500 kHzで共振するハイドロホンが、共振周波数1.0 MHzのFUSトランスデューサに挿入されました。

図2に示すように、FUSシステムには超音波照射設定とターゲット位置を調整する機能が含まれています。トランスデューサがバースト期間中にスポット間を移動できることを確認するために、「動作テスト（motion test）」を行う必要があります。

BBBが開通すると、GADおよびエバンスブルー分子がBBBを通過します。T1強調MR画像により、GADによって誘導されたMR信号強度の変化が捉えられました（図3A）。灌流処置後、エバンスブルーで染色された組織が直接的に視認できました（図3B）。

BBBOの再現性を実証するために、3匹のラットを用いて実験を行いました。図4Aは、超音波照射およびGAD投与後のT1強調グラジエントエコー像を示しています。3回の実験すべてにおいて、標的部位でMR信号強度の有意な上昇が観察されました。DCE-MR画像により、信号強度の最も顕著な変化は、MRI造影剤のボルス投与から7-8分後に発生したことが示されました（図4B）。T1強調グラジエントおよびT2強調スピンエコーシーケンスでは、BBB開通領域が明確に示されましたが、GAD投与前のT1マップでは有意な変化は観察されませんでした（図4C）。

本研究で提案した動物およびMRIのプロトコールは、頸静脈カテーテルを留置したラットモデルを用いてMRイメージング研究を実施することが可能であることを示しています。血液脳関門（BBB）開通を検出するための新しいMRIバイオマーカーを調査するために、MR灌流画像および/または拡散テンソル画像（DTI）をこのプロトコールに組み込むことができます。

超音波イメージングの実験セットアップ。1 MHz トランスデューサー、オシロスコープ、ラットホルダーなどが含まれる。
図 1: ベンチトップ前臨床FUSシステムとラットの配置。 (A) ベンチトップ前臨床FUSシステム。 (B) システム内におけるラットの配置。 (C) 1 MHz トランスデューサーとハイドロフォン。ハイドロフォンはFUSトランスデューサーの中心に配置されている。 (D) ラットの頭部におけるトランスデューサーと水結合コンテナの配置。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

集束超音波ターゲット解析のためのソニケーションパラメータ表示およびMRIスポット局在化。
図 2: 前臨床FUSシステムソフトウェアのユーザーインターフェース。前臨床FUSシステムソフトウェアのユーザーインターフェースを使用して、ソニケーション設定およびターゲット位置を変更できます。ソニケーションを開始する前に、「モーションテスト」を実施し、バースト期間内にトランスデューサがスポット間を移動できることを確認する必要があります。この機能は、ソニケーションを行わずにトランスデューサのスポット間の移動時間を測定するものです。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

比較解剖学的分析用の、実際のR1およびR2サンプルの脳冠状面および軸方向断面。
図3GAD投与後のT1強調画像およびBBB開通後の脳領域。 (A) ガドリニウム造影後のT1強調像および（B) BBB開通後のラット脳の写真。 ( などのラベルR1およびR2はA) は、( ) に示す領域に対応している。C). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ダイナミック造影MRI；ラット脳イメージング；信号強度；T1、T2強調、T1マッピング。
図 4: 超音波処理およびGAD注入後のMRイメージング。(A) 超音波処理およびGAD注入後における3匹のラットのT1強調MR画像。(B) ラット#3のダイナミック造影（DCE）MRIであり、信号強度の時間的変化を示している。GADベースのMRI造影剤は、赤色の矢印で示された時点で注入した。(C) GAD造影剤注入前に取得したラット#3のT1強調MR画像、T2強調MR画像、およびT1マップ。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

2次元拡散強調画像（2D DWI）Cor 2D冠状断2D T1マップCor 2DCor 2D冠状断 2D DCE（ボルス1）Cor 2DCor 2D
R2*マップFLASH前処理RARE preFLASHポストRAREポスト
シーケンスEPIグルココルチコイド受容体伝達性海綿状脳症グルココルチコイド応答配列伝達性海綿状脳症グルココルチコイド受容体（GRE）グルココルチコイド受容体（GRE）トランスミッスブルスポンジオパチー（伝達性スポンジ状脳症）
TR2100 ms500 ms2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms30 ms2000 ms39.3 ms30 ms1500 ms
TE22.1 ms12個のエコー；10.29 ms5.1 ms65 ms2.9 ms5.1 ms65 ms
3 - 47 ms
厚さ1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm
視野40 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 40
マトリックス192192192256192128256192
FA（角度）906090/1802090/180122045/180
スライス数55555555
収集時間4分12秒3分12秒10分38秒2分9秒1分52秒8分23秒3分52秒1分24秒
オプションセグメント12、方向3、b = 0、54、180、522 s/mm2平均回数 = 2、エコースペーシング = 4 msエコースペーシング 10.3 ms、RARA係数 2RARE係数 10、平均 4200 µL 造影剤 (Gadavist, 1 mmol/kg)RARE係数10、平均4
ラット（200 g）に対し、投与前1分間および投与後7分間、注射を行う。 200 µL/min, 200 µL 生理食塩水フラッシュ

表1：3T MRIスキャナーにおける前臨床MRIプロトコル。

ディスカッション

BBB 開口研究のための頸静脈カテーテル法のラット モデルを使用したプロトコルと動物手順が開発されました。多数の前臨床プロトコルが存在しますが、このプロトコルには市販の FUS システムとラット モデルが組み込まれており、動物の調製手順を最小限に抑え、それによって実験の再現性が確保されます。

このプロトコルでは、マイクロバブルの選択は、その安定性と室温保存に基づいていました。他の市販のマイクロバブルが代替品として検討される場合があります。Kotopoulis et al. 膵臓がんの低強度ソノポレーションに対するさまざまなマイクロバブル タイプを調査および比較しました10. in vitro の結果に基づいて、この研究で選択されたマイクロバブルは、より低い強度で最適な製剤であり、他のマイクロバブルはより高い強度でより効果的であることがわかりました。ただし、ラットモデルでBBBを開くのに最適なマイクロバブルは不明のままです。Vlachos ら 13 は、BBB 開口部の量と血管破壊や浮腫などの組織損傷に対する音圧とマイクロバブルのサイズの影響を調査しました。提案されたプロトコルは、ラットモデルで使用するのに最適なマイクロバブルおよび超音波処理パラメータを調査および特定するための将来の研究を奨励します。

この研究では、多点ターゲティングのための迅速かつ正確な機能により、前臨床 FUS システムが選択されました。このシステムは、事前に定義された焦点を自動的に通過するようにプログラムされており、標的組織領域に向けられた局所超音波処理を容易にする機能です。代替案として、Sonic ConceptsおよびExAblate Neuro( 材料表を参照)が提供するような確立された集束超音波(FUS)トランスデューサーを使用して、血液脳関門を開くことができます14,15。特に、ExAblate Neuro トランスデューサーは MR イメージングと互換性があるように設計されており、治療プロセスのリアルタイムのガイダンスとモニタリングを提供します。将来的には、これらのトランスデューサを開発されたプロトコルに統合することができます。

提案された MRI プロトコルには、さまざまな MRI シーケンスが組み込まれており、多様な画像研究に対する潜在的な実用性を実証しています。BBB 漏出から MRI 造影剤によって誘発される信号強度の変化を捉えるには、造影前および造影後の T1 強調勾配エコー シーケンスと T2 強調スピン エコー シーケンスが推奨されます。ユーザーは、DWI、DCE、およびT2*マッピングをイメージングプロトコルに含めるオプションがあります。MRIスキャナーを使用する代わりに、Singhら16 は、焦点位置特定とパッシブ音響マッピングにドップラー超音波イメージングを使用して、BBB開放領域と相関するマイクロバブルのキャビテーションを検出する方法を導入しました。したがって、このプロトコルは全超音波システム内での実装が期待されており、潜在的な代替手段を提示します。

この研究では、超音波処理中の注入を指す注入アプローチ12 が採用されました。このアプローチは脳にマイクロバブルを継続的に供給するため、ボーラス注入と比較して、より安定した一貫した BBB の開口が得られる可能性があります。Lapinら12 は、一貫したBBB開口のための注入アプローチとボーラスアプローチの比較を調査し、7.2 μLのデフィニティマイクロバブル/ kg / min以下の速度で、さまざまな圧力レベルで損傷することなくBBBを開くことができることを発見しました。ただし、このアプローチでは、シリンジ内のマイクロバブルの濃度を長期間維持する上で潜在的な制限が生じる可能性があります。マイクロバブルはシリンジの上部に浮遊して凝集する傾向があり、マイクロバブルの投与量が減少する可能性があります。あるいは、マイクロバブルのボーラス注入を眼窩後洞に行うこともできます。提案されたプロトコルを使用した将来の研究では、ラットモデルでBBB開口を最適化するために、さまざまなマイクロバブル注入方法およびタイプとの比較を検討する必要があります。

この研究の限界は、ヘマトキシリンとエオシン (H&E) またはクリスタル バイオレット染色結果などの肉眼的損傷に対する組織化学的検証がないことです。ただし、提案されたプロトコルは、脳の肉眼的損傷を回避するために超音波処理およびMRIパラメータを最適化するために利用できます。さらに、この制限に対処するために、組織病理学分析の手順を将来の研究に組み込むことができます。

開示事項

著者には、宣言すべき関連する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(NIDCR)の助成金K99DE032397、UCSF学部のシード助成金(No.7504831)、UCSFのRAP助成金(PI:Kazim Narsinh, MD)、およびドイツ研究財団(DFG, GA 3535/1-1)によって部分的に支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mLシリンジBD plastipak
20 mL, Sodium Chloride 0.9%Hospira, Inc00409-7101-67
3 mL シリンジBD plastipak
5 mL シリンジBD plastipak
鈍針, 21 GSAI 輸液技術B21-50
カテーテルコネクタ, 21 GSAI 輸液技術CC-25-25
カテーテルロックソリューションSAI 輸液技術SKU # HGS-10(500 µ/mL) グリセロール
エバンス ブルーシグマ アルドリッチE2129-10g
ExAblate NeuroInsightec Inc., イスラエル
ガダビストバイエル2068062
GE  イソフルラン気化器 GEヘルスケア
IPS-12RSシリンジポンプInovensoIPS-12
イソフルランUSP獣医1501017
ルマソンmicrobbubleブラッコダイアグノスティックス株式会社SKJ709700
オスのSprague-Dawleyラット(200–250 g) Charles River Laboratories
Needle, 18 GBD Precisionglide
Phosphate-buffered salineMediatech21-030-CVR
ポリエチレンチューブBD Intramedic
前臨床 3T クライオゲンフリー Bruker Biospin スキャナー BrukerBiospec3T
ラットCharles River Laboratories
RK-50  集束超音波トランスデューサFUS InstrumentsTx-50-1000-0
RK-50 卓上型集束超音波システムFUS Instruments
SonicConcepts Inc., WA, USA
ベントディスペンシングピン Bブラウン4550560
頸静脈カテーテル法を備えた

参考文献

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