方法論記事

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患における脂肪沈着のin vitroモデリング

DOI：

10.3791/66810

⸱

2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、代謝機能障害に関連する脂肪性肝疾患のモデルとしてのオレイン酸誘導性HepG2細胞の使用について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)の有病率は、経済およびライフスタイルパターンの変化により急増し、重大な健康上の課題につながっています。これまでの報告では、MASLDの動物モデルと細胞モデルの確立について研究し、両者の違いを強調してきた。本研究では、MASLDに脂肪蓄積を誘導することにより、細胞モデルを作成しました。HepG2細胞を不飽和脂肪酸オレイン酸でさまざまな濃度(0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)で刺激し、MASLDをエミュレートしました。モデルの有効性は、Cell Counting kit-8アッセイ、Oil Red O染色、および脂質含量分析を使用して評価しました。この研究は、MASLD細胞の簡単な操作性を持つ細胞モデルを作成することを目的としています。細胞計数キット-8アッセイの結果は、HepG2細胞の生存がオレイン酸の濃度に依存していることを示し、GI50 は1.875 mMでした。0.5 mM群および1 mM群の細胞生存率は、対照群の細胞生存率よりも有意に低かった(P < 0.05)。さらに、Oil Red O染色および脂質含有量分析により、HepG2細胞上のさまざまなオレイン酸濃度(0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)での脂肪沈着を調べました。0.25 mM、0.5 mM、および1 mM群の脂質含量は、対照群よりも有意に高かった(P < 0.05)。さらに、OA群のトリグリセリドレベルは、対照群のトリグリセリドレベルよりも有意に高かった(P < 0.05)。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)には、単純性脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変、肝細胞がん1,2,3,4,5,6など、さまざまな疾患が含まれ、これらはすべてアルコール吸引以外の要因に起因します7 .MASLDは、代謝性肝障害によって引き起こされる最も一般的な肝疾患であり、世界人口のほぼ4分の1が罹患しています8,9,10,11,12。MASLDの正確な病因はまだ解明されていませんが、その発生を説明するためにさまざまな理論が試みられています。1つの一般的な概念は、古典的な「2ヒット」理論から「マルチヒット」モデル1への出発を示唆しています。これらの仮説の中心にあるのは、MASLDの病因13において極めて重要であると考えられているインスリン抵抗性の役割です。研究によると、肝細胞のインスリン抵抗性は遊離脂肪酸のレベルを上昇させ、その後、肝臓内に貯蔵されたトリグリセリドを形成します14,15。

研究者たちは、 in vivo モデルと in vitro モデルの両方を使用して、MASLDでの脂肪沈着をシミュレートしました。しかし、その病態メカニズムを完全に再現することは依然として困難です。この制限にもかかわらず、これらのモデルはMASLDの潜在的な治療標的の研究に役立っています。ただし、MASLDの安定したモデルの開発は非常に重要です。動物モデルは効果的ですが、時間と費用がかかるため、 in vitro 細胞モデルへの関心が高まっていることが浮き彫りになっています。これらのモデルは、多くの場合、オレイン酸(OA)やパルミチン酸などの単一または複数の遊離脂肪酸を使用して、食事誘発性MASLDを再現します。これらのうち、ヒト肝芽腫細胞株HepG2は、MASLDの in vitro 細胞モデルを確立するためによく使用されます。

OA誘導は、HepG2細胞を刺激して、確立された歴史を持つMASLDに似た脂肪沈着を再現します。この研究の目的は、0.25 mM OAで処理したHepG2細胞の生存率、Oil Red O(ORO)染色、脂質含量、およびトリグリセリド(TG)レベルを実証することでした。この実験の目的は、MAFLDモデリング研究の発展にさらなる証拠を提供することでした。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. 細胞培養

  1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(10%ウシ胎児血清[FBS]、100ユニット/ mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを含む)を含む培養フラスコでHepG2細胞を培養します。培養フラスコを5%CO2 インキュベーターで37°Cに維持します。

2. Cell Counting kit-8による細胞生存率に及ぼすオレイン酸の影響

  1. 特定の量のOAをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、200 mMの濃度を達成します。溶液は、将来使用するために-20°Cで保存してください。
  2. 96ウェルプレートにHepG2細胞を、ウェルあたり6×103 細胞の細胞密度で播種します。各ウェルに100 μLのDMEMを添加します。細胞をインキュベートし、5% CO2 インキュベーターで37°Cで24時間培養します。HepG2細胞を2つのグループに分けます。
    1. 対照群:細胞培養培地を添加します。
    2. OA基:OAを細胞培養培地に添加して、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMの最終濃度を達成します。
  3. 最初のインキュベーションの24時間後、各ウェルから上清を捨て、指定されたグループに従ってOAを添加し、ウェルあたり100μLを添加します。コントロールグループでは、各ウェルに100 μLの細胞培養培地を加えます。細胞をさらに24時間インキュベートし続けます。
    注:各グループに6つのレプリケートウェルがあることを確認してください。蒸発を防ぐため、100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を96ウェルプレートのウェル外輪に加えます。
  4. インキュベーション24時間後、各ウェルに10 μLのCell Counting kit-8 (CCK-8)を加え、穏やかに混合し、暗所で2時間インキュベートします。96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、マイクロプレートリーダーに入れて、450 nm(A450)での吸光度値を測定します。GI50 の値は、OD に従ってカウントされました。

3. 細胞内の脂肪滴形成を観察するためのオイルレッドO染色

  1. HepG2細胞を6ウェル細胞培養プレートに5×105 細胞/ウェルの密度で播種し、プレートを恒温インキュベーターで24時間培養します。説明されている手順を視覚的に表現するには、 図 1 を参照してください。
  2. 細胞培養の24時間後、OAを含む細胞培養培地2 mLを各ウェルに加え、最終濃度0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMを達成します。さらに24時間後、各ウェルから細胞培養培地を取り出し、PBSで2回洗浄します。各ウェルに1 mLのORO固定液を加え、30分間インキュベートします。
  3. ORO染色液は、染色液Aと染色液Bを3:2の割合で混合して調製します。混合物を室温で10分間放置し、0.45μmフィルターで1回ろ過します。ろ過した溶液は、使用するまで光から保護された遠心分離管に保管してください。
  4. 固定液を捨て、蒸留水で2回洗います。60%イソプロパノール1 mLを各ウェルに加え、30秒間インキュベートします。イソプロパノール溶液の60%を廃棄し、調製したばかりのORO染色液1 mLを各ウェルに加えてから、20分間インキュベートします。ORO染色溶液を廃棄し、各ウェルに60%イソプロパノール1 mLを加え、30秒間インキュベートします。水で5回洗って余分な染料を取り除きます。
  5. 細胞を蒸留水で覆い、顕微鏡で観察します。画像が収集されたら、プレート内の液体を捨てて乾かします。次に、各ウェルに2 mLのイソプロパノールを加え、オービタルシェーカーでプレートを10分間振とうします。液体を新しい96ウェルプレートに移し、各グループに16ウェルを配置し、ウェルあたり100μLを追加します。510 nm のマイクロプレートリーダー (A510) を使用して各ウェルの光学密度 (OD) を測定することにより、脂質含有量を計算します。

4. HepG2細胞上清中の総トリグリセリドに及ぼす濃度のオレイン酸の違いの影響

  1. キットを室温で20分間平衡化し、実験に必要なプレートを調製します。
  2. 細胞上清を回収し、1,570 × g で10分間遠心分離します。標準ウェルとテストサンプルウェルを設定します。標準ウェルに50 μL([S0 → S5]濃度、続いて0、0.5、1、2、4、8 mmol / L)を標準ウェルに加えます。ブランクウェルとスタンダードウェルに加えて、10 μLの異なるサンプルをサンプルウェルに加え、続いて40 μLのサンプル希釈液を各ウェルに加えます。100 μLの検出抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼを各ウェルに添加し、プレートメンブレンで密封し、恒温オーブンで37°Cで1時間インキュベートします。
  3. 上清を捨て、ほこりのない紙で拭き取り、1x洗浄液でそれぞれをよく洗います。室温で1分間放置します。洗浄プロセスを5回繰り返します。
  4. 各ウェルに50 μLの基質Aと50 μLの基質Bを添加します。穏やかに混合し、37°Cで15分間インキュベートします。 各ウェルに50μLの終端溶液を加え、450 nm(A450)で各ウェルのOD値を15分以内に測定します。
  5. X軸に沿って標準試料の濃度をプロットし、Y軸に沿って対応する吸光度(OD)値をプロットして線形回帰を実行し、曲線方程式を導き出して各サンプルの濃度値を計算します。

5. 統計分析

  1. 定量的データの有意差を決定します。
  2. 平均±標準偏差(SD)を計算し、データをグラフィカルに表示します。 0.05 は統計的に有意であると考えてください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞生存率に対するオレイン酸の影響
HepG2細胞は、さまざまな濃度のOA(0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)に曝露され、その結果、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、および1 mMでの細胞生存率が0 mMと比較して低下しました。0 mMと比較して、0.5 mM(P < 0.05)および1 mM(P < 0.05)で統計的有意性が観察されました。CCK-8キットによって評価されたOAの細胞生存率への影響の結果を図2に示します。OA処理HepG2細胞のGI50値は1.875mMと計算されました。

細胞内脂肪滴形成を観察するためのオイルレッドO染色
ORO染色は、脂質の可視化に一般的に使用される方法です16,17。その結果、OAと24時間インキュベートしたHepG2細胞における脂肪滴形成を、ORO染色後の顕微鏡下で観察した。図3および図4に示すように、OA処理細胞の赤色染色の強度は、未処理細胞よりも高かった。OA処理後のHepG2細胞の血漿中には赤色の脂肪滴が存在し、OA濃度の上昇に伴って脂肪滴と脂質の量が増加しました(図5)。

HepG2細胞上清中の総トリグリセリドに対する異なる濃度のオレイン酸の影響
実験結果は、 図6に示すように、対照群と比較して、さまざまな濃度のOAでHepG2細胞を処理する(0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM)結果、OA群での細胞上清のTG含量が有意に増加したことが明らかになりました(P < 0.05)。

figure-results-1
図1:オイルレッドO染色のフローチャート。 略語:OA =オレイン酸;OD = 光学密度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:細胞生存率に対するオレイン酸の影響(Cell Counting kit-8アッセイを用いて評価)。 各バーは、SD ±平均を表します (n = 6)。※P <0.05です。略語:OA =オレイン酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:複数の時点(3時、6時、9時、12時方向)のオイルレッドO染色画像。 脂質液滴の形成は、倒立顕微鏡を用いて細胞培養を40倍に拡大して検出しました。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:細胞内の脂肪滴に対するオレイン酸の影響(Oil Red O染色による評価)。 脂質液滴の形成は、倒立顕微鏡を用いて細胞培養を40倍に拡大して検出しました。スケールバー = 250 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:光学密度の値によって評価された、細胞内の脂質含有量に対するオレイン酸の影響。 相対的な折り畳みの変化は、異なるグループの光学密度の値で表されます。各列は SD ±平均を表します (n = 16)。※P <0.05です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:HepG2細胞上清の総トリグリセリドレベルに対するさまざまな濃度のオレイン酸の影響。相対的な倍率の変化は、さまざまなグループのトリグリセリドレベルの値で表されます。各列は SD ±平均を表します (n = 3)。※P <0.05です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MASLDは、アルコールや他の確立された肝臓損傷剤18以外の要因による肝細胞への過剰な細胞内脂肪沈着を特徴とする臨床病理学的症候群である。MASLDは、後天性代謝ストレス肝障害と複雑に関連しており、特にインスリン抵抗性と遺伝的感受性に関連しています。MASLDの薬剤を効果的に研究し、スクリーニングするためには、適切な実験モデルを選択することが重要です。細胞モデルの確立は、MASLD研究において特に重要であり、病理学的メカニズムのより深い理解と新規薬物効果の評価を促進します。

このプロトコルは、OA誘導性HepG2細胞を通じて確立されたMASLDのin vitroモデルについて説明しています。ORO染色と脂質含量分析は、このモデルを作成するための重要な方法として機能します。さらに、細胞生存率と細胞上清中の総TG含量を評価することは、適切なOA濃度を評価するために不可欠です。MASLDの診断基準は、肝細胞19,20に貯蔵されている5%を超えるTGの存在を含む。MASLD細胞モデルは主にHepG2細胞21、22、23、24、25、26、27、28に依存しており、国内外のさまざまな研究で脂肪肝変性モデルの構築に成功したことで知られています。肝腫細胞に由来するにもかかわらず、HepG2細胞は肝細胞と多くの表現型の特徴を共有し、容易に培養および増殖できます29,30。CCK-8キット、ORO染色、脂質含量、総TG測定などの試験は、研究対象者の細胞生存率、脂肪蓄積、脂質含量を評価するためのシンプルで客観的かつ合理的なアプローチを提供します。この文脈では、OAはMASLD31の病因と一致しており、エネルギー摂取量が消費を超えると過剰なエネルギーが脂質の形で貯蔵されます。

研究者は、OA 23,28,31,32,33、パルミチン酸34,35、およびオレイン酸/パルミチン酸26,36の組み合わせを利用して、MASLDモデルを再現しています。パルミチン酸とOAはどちらも、肝臓の脂肪変性とTGの蓄積に寄与します。パルミチン酸は、人体に最も多く存在する飽和脂肪酸であり、著しい脂肪毒性を示し、肝細胞への脂質蓄積、細胞内活性酸素ラジカルの増加、および細胞死または壊死を引き起こします37。逆に、OAは細胞内TG沈着がより顕著になり(図6)、細胞調節が少なくなります38。したがって、研究者はしばしばOA誘導性HepG2細胞を利用してin vitro MASLDモデルを確立します。プロトコルステップ2.2.2で説明したように、OA溶液を追加するときは加熱することが重要です。本研究では、HepG2細胞の脂質沈着を基礎としたORO染色と脂質含量解析を行い、複雑なメカニズムを持つMASLDのin vitroモデルの探索を効果的に支援し、研究に必要な時間とコストを削減しました。

OROは液滴状でTGに容易に結合し、脂肪を示すオレンジ色から赤色の染色を生成し、脂質濃度に応じた色の強度を示します。しかし、ORO染色液は不安定で沈殿しやすいため、事前の調製には適していません。したがって、ORO染色溶液は、調製およびインキュベーション中の光曝露を避けるための予防措置を講じて、プロトコールステップ3.2の後に調製しました(プロトコールステップ3.2、3.3)。プロトコルステップ3.5では、複数の時点(3時、6時、9時、および12時方向)での画像を選択することは、結果の精度を向上させるために不可欠な実験の主要な変更を表しています。OA濃度の上昇は細胞の生存に影響を与えるため、この方法の限界を表していますが、適切なOA濃度が細胞の生存率を確保することが実証されています。

この研究では、CCK-8キット、ORO染色、脂質含有量分析、および総TG測定を使用して、MASLDのモデルを確立し、検証する包括的なアプローチを採用しました。CCK-8キットは、細胞生存率に対する薬物の影響を評価するために使用され、重要な検証ステップとして機能しました。将来的には、このモデルは、MASLDの病因を理解し、潜在的な治療標的を特定することを目的とした薬物スクリーニングとメカニズム研究に有望です。バリデーションの信頼性をさらに高めるために、モデルに含まれる標的タンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析を用いて解析します。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、内モンゴル自治区科学技術局科学技術プログラムの2018年度支援プロジェクト「モンゴル医学の地域疾患に対するKoumissの治療効果に関する重要課題に関する研究」の助成を受けたものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上mフィルターMillex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µm フィルターMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 細胞培養フラスコCORNING430639
6ウェル細胞培養プレートCORNING3516
96ウェル細胞培養プレートCORNING3599
血球計数プレートShanghai Jing Jing 生化学試薬&インストゥルメント株式会社
Cell Counting Kit-8 assaysBeijing Solarbio Science & (英語)株式会社テクノロジー CA1210-1000T
CO2インキュベーターNUAIRENU-5710E
 DMSOジメチルスルホキシド 北京ソーラーバイオサイエンス&株式会社テクノロジー D8371
ダルベッコの改変イーグル培地Gibco8122691
酵素標識装置TecanSpark
Fetal Bovine Serum, 認定Gibco10099141
HepG2 細胞株北京華北 Chuanglian バイオテクノロジー研究所 (BNCC)221031
ヒト トリグリセリド (TG) ELISA南京Jiachengバイオエンジニアリング研究所20170301
細胞培養用倒立顕微鏡ライカDMi1 
イソプロパノール天津Zhiyuan化学試薬有限公司
オイルレッドステインキット、培養細胞用Beijing Solarbio Science &株式会社テクノロジー G1262
オレイン酸 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (三言生物科技(上海)有限公司)
A502071 ペニシリン連鎖球菌Gibco15140122
SPSS 24.0統計ソフトウェア
022701132021030141

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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HepG2 O in vitro MASLD

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