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方法論記事

マウスモデルにおける非安定化下顎骨折に対する低侵襲技術

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DOI:

10.3791/66824

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2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Physiopathological Bases of Osteochondrodysplasia, Imagine Institute, Université de Paris Cité, 2SFR Necker INSERM, LEAT antenne Imagine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、下顎骨の修復を分析するための包括的で効率的な方法を提供します。マウスモデルにおける非安定化下顎骨折の再現可能な技術について説明し、組織の損傷と骨の損失を最小限に抑えながら軟骨内骨修復のプロセスを分析できるようにします。

要約

マウスでは下顎部位に非安定化骨折を作れるため、軟骨内骨化モードを用いた骨修復の解析が可能になります。このプロセスを in vivoで最も正確に反映するには、特に下顎部位、つまり最小限のアクセスを特徴とする解剖学的部位において、過度の骨量減少と軟部組織の損傷を回避するための標準化されたプロトコルが必要です。私たちの知る限り、マウスの非安定化下顎骨折の低侵襲プロトコルを初めて説明します。成体マウスはイソフルランで麻酔され、皮下注射により術前用量のブプレノルフィンを投与されます。顎下膜アプローチが行われ、下顎骨の下縁に沿って皮膚切開が行われます。咬筋は、骨膜エレベーターを備えた下顎枝に沿って骨膜下面で上昇します。杉の垂直かつ完全な骨折は、基底縁から冠状突起の間(顆状突起と冠状突起の間)まで、底縁の生理食塩水血清灌漑下での圧電骨手術装置とハサミを使用して、下顎骨の骨折を完了します。スキンアプローチはシルク縫合糸で閉じられます。非安定化下顎骨折に対するこの詳細な手順は、骨量減少と軟部組織の損傷を最小限に抑える効率的な手順を提供します。この技術により、マウスモデルにおける軟骨内骨修復のプロセスを正確に反映し、成功し一貫した結果が得られます。

概要

骨修復は、骨折または骨切り術の安定化に応じて、膜状骨化プロセスと軟骨内骨化プロセスの両方を意味します。安定化骨骨切り術または骨折後の骨修復は膜性骨化に依存しているのに対し、非安定化骨折または安定化不良骨切り術は軟骨内骨化のモードに従って固化します1。膜性骨修復は、間葉系細胞が骨芽細胞に直接分化することによる骨形成を特徴とし、軟骨内骨修復は、一過性の軟骨テンプレートの形成を伴い、骨芽細胞に分化して骨カルスを形成します2。

骨の修復は、複数の組織と細胞の相互作用に依存します。また、部位特異的な要因やカルス3にかかる力の影響も受けます。下顎骨は、咀嚼力を支える可動性の骨であり、主に皮質骨によって形成されます。下顎骨修復のプロセスは、骨折の部位と方向の影響を受けます。筋肉や骨膜の損傷が骨圧固めや骨折部位4,5,6の重要な骨量減少に影響を与える可能性があることはよく知られています。

軟骨内下顎骨修復の分析は、価値ある偏りのない比較のための標準化された再現性のあるプロトコルを意味します。文献に関しては、マウスモデル3,7の非安定化下顎骨折のプロトコルを報告している著者はごくわずかで、ほとんどが大臼歯レベル8の前方を向いています。この技術を開発することにより、筋肉や骨膜の損傷を回避し、骨折部位での骨量減少を制限して、交絡因子なしに軟骨内骨修復のプロセスを最適に分析することを目指しています。また、マウス下顎骨折の新規技術を開発する目的は、小動物の術後疼痛や術後頻出する動物の死亡を最小限にすることでした。初めて、マウスのラムスレベルでの非安定化下顎骨折に対する低侵襲プロトコルについて説明します。このin vivoプロトコルは、骨折部位での過度の筋肉および骨膜の損傷または骨量の減少を回避し、術後の痛みのレベルと動物の死亡リスクを減らすのに役立ちます。

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プロトコル

このプロトコルは、イマジン・インスティテュートの動物管理ガイドラインに準拠しており、倫理委員会とフランス省によって検証されています(APAFIS 26995)。

1. 動物たち

  1. グループごとの動物の数を決定します。グループごとに12匹の動物をお勧めします。マウスの性別と年齢を決定します。このプロトコルは、生後6週齢のC57BL/6Jマウス(雄または雌)に適合しています。
  2. 処置の少なくとも1週間前に、動物に順応のための栄養補助食品ジェルを与えます。

2.外科的処置

  1. 必要な材料を準備します。器具をオートクレーブします:はさみ、ニードルドライバー、鉗子、圧電骨手術装置のインサートとハンドピース、エレベーター。滅菌手袋、絹縫合糸(4/0)、シェーバー、綿ガーゼ、10%ポビドンヨード溶液、加熱テーブル、イソフルラン、およびイソフルラン吸入用の鼻マスクを準備します。
  2. ブプレノルフィンを0.1 mg / kgで調製し、滅菌注射可能な生理学的血清で希釈します。.手術の30分前に25G針による皮下注射によりブプレノルフィンを投与します。.
  3. ヒーティングプレート(37°C)を準備し、その上にフォームサポートを置き、鼻マスクを小さな針または粘着テープで固定します。
  4. マウスをイソフルランタンクに入れて誘導し、イソフルラン拡散(4%)します。つま先をつまむことによる麻酔の深さをテストします。十分な誘導の場合、ペダル反射の欠如が観察されます。
  5. 麻酔をかけたマウスを仰向けにして、全手順で37°Cに保たれた滅菌フィールドで覆われた加熱プレートに置きます。マスクを鼻に配置して、イソフルランを連続吸入します(2.5%に維持します)。マウスの四肢を粘着テープで固定します。
  6. 全身麻酔による目の乾燥を防ぐために、アイローションを両側に塗布します。顎下毛を剃り、滅菌手袋を着用し、10%ポビドンヨード溶液とアルコールを数回スワイプして皮膚を消毒します。
  7. 以下に説明するように、顎下皮膚アプローチを実行します。
    1. 下顎角から下顎骨の水平枝の1/3後部-2/3前接合部までの皮膚切開をマイクロハサミで行います。
    2. 皮下組織を解剖して、咬筋を露出させます。
  8. 下顎骨の下縁から骨膜エレベーターを使用して付着する咬筋を切断します。
  9. エレベーターで下顎枝に沿って骨膜下面の咬筋を持ち上げます。
  10. 圧電骨手術装置を使用して、下顎骨の下縁、下顎角の前方、下顎角の前方、凹面の後部で、圧電式骨手術装置を使用して、下顎骨下縁に小さな骨切り術(長さ3mm)を作成します(図1、 図2)。
  11. 下顎骨とコロノイドノッチの後縁を(マイクロハサミまたは鉗子で)特定し、下顎枝に沿って挿入された小さなまっすぐなハサミを使用して骨折を完了します。骨折の正しい向きを可能にするには、はさみを下顎骨の下縁に対して垂直に配置します。
  12. 骨折が完全に完全であることを確認します:鉗子による2つのセグメントのソフトモビライゼーション中に、2つの骨セグメント間の完全な可動性を観察する必要があります。
  13. 分離された縫合糸でシルク縫合糸(4/0)で皮膚アプローチを閉じます。骨膜に縫合糸は必要ありません。
    注:あるいは、皮膚アプローチは、他の非吸着性縫合糸(例えば、ポリプロピレン縫合糸)で縫合することができる。
  14. 頭部外X線検査を行い、骨折の方向を確認します(図3)。
    1. X線撮影を行う前に、マウスを再びイソフルランタンクに戻し、短時間再誘導します。次に、マウスを横側に伸展させ、X線分析のために頭をわずかに過伸展させます。
    2. 骨折が下顎臼歯のレベルで前方に配置されすぎている場合、または骨折が下顎角を剥離した場合(図4)は、骨カルスの体積の異常な増加を観察します。このような場合は、分析の偏りを避けるために、動物を研究から除外します。
  15. マウスが意識を取り戻すまでマウスをチェックしてから、ケージに戻します。

3. 術後のケア

  1. 咀嚼力を避けるために、キブルやハードエンリッチメントのないマウスケージを準備します。
  2. 皮膚が完全に治癒するまで、手術 したマウスを1つのケージに1週間隔離します。術後1週間で、同じケージ内で雌マウスを一緒に操作しました。
  3. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を、手順の4時間後、24時間後、48時間後、および72時間後に皮下注射で投与します。.
  4. 0日目から圧密期間の終わりまでのすべての術後期間(すなわち、28日間)にマウスにソフトダイエットジェルを給餌して、骨折の痛みと二次変位を避けます。
  5. 骨折後 0 日目から 4 日目まで、朝、ブプレノルフィン注射前、その後、動物が犠牲になるまで (骨折後 14 日)、マウスの体重を毎日測定します。
  6. 術後の動物の健康状態を評価して、術後の動物のケアを最適化します。 表 1 のスコア スケールを使用して、動物の術後状態を評価し、フォローアップを適応させます。スコアが 1 >の場合、ブプレノルフィン注射が行われ、スコアが 3 >の場合、および/または食物濃縮にもかかわらず術前の体重の 20% >体重減少の場合、安楽死について話し合う必要があります (表 1)。

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結果

in vivo外科的処置に関しては、マウスモデルで非安定化下顎骨折のこの手順を最適に行うためには、特定の学習と訓練が必要です。

非安定化下顎骨折のこの技術は、軟骨内骨修復プロセスの研究を可能にします。安楽死後、下顎サンプルを4%パラホルムアルデヒド(24時間)で収集しました。EDTA pH 8で完全に脱灰した後、切片をパラフィンに包埋しました。矢状直切片を作製し、脱パラフィン溶液で脱パラフィンした後、標準プロトコルを用いてSirus Red/Alcian Blue染色の前に再水和しました。組織学的画像により、軟骨テンプレートを持つ柔らかいカルスの形成が確認されました(図5)。骨折後4週間で骨の治癒が完了することが、マイクロCT分析で示されています。カルス形成の開始(例:7日ごと(研究の目的に応じて7日ごと、14日目、21日目)以上)から骨治癒の終了(つまり、28日目)までのさまざまな重要なポイントで骨修復プロセスを、組織形態学的およびマイクロCT形態学的分析で研究することをお勧めします。

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ディスカッション

この技術により、マウスモデルにおける非安定化下顎骨折を、最小限のオープンアプローチで短時間(約10分以下)で実現することができます。この短時間の処置により、特にマウスなどの小動物における動物の罹患率や死亡のリスクが制限されます。軟骨内骨修復プロセスの分析で同等の結果を得るためには、下顎骨角の異常な分割なしに下顎骨折を同じ方向に行うために特別な注意を払う必要があります、この望ましくない影響は骨カルスの体積を異常に増加させ、圧密期間を遅らせる可能性があるためです。下顎骨折のこのプロトコルは、手術後の下顎切歯の成長に影響を与えません。このプロトコルの有効性を向上させるために、実験者には、まず同様の年齢の安楽死させた動物で運動し、必要に応じて下顎骨を骨折した直後に解剖して骨折方向を直接視覚化することをお勧めします。

隣接する筋肉からカルスに移動する間葉系前駆細胞は、骨の修復に寄与します6。骨膜および筋肉の損傷が骨固めに影響を与えることが実証されている

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、Mutuelles AXAの慈善部門がHead and Heart ChairとANR BonyBrainを通じて部分的に支援しています。私たちは、プラットフォームSFR Necker INSERM US24、LEAT Imagine、パリ、フランスのすべてのメンバーに、手順の実現に貢献してくれたことを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブプレノルフィン:ブプレケア0.3mg / kgアニマルケア
エレベーターOBWEGESER幅6mm長さ17,5cm Collin MedicalHA 5905
鉗子 : パッド プレート MORIA 11 cm N°5MORIA9906
加熱台 Bioseblab 55 cm x 33 cmBioseblab707
ニードルホルダー : Micro Halsey ニードルホルダー - 金属 ラボダーム21,100
ネオクリアー Merck Millipore, Darmstadt, Germany109843 
Ocry Gel Tube 10 g (眼用潤滑剤)tvm lab  3.70045E + 12
ピエゾトーム2 ASS FINALACTEONX57402
エゾトームインサートピエゾチシオンPZ3ACTEONF87574
はさみマイクロ MORIAMC52
シルク縫合糸 PERMA HAND SEIDE  / MERSILKETHICONREF 18501G 
ストレートハサミMORIA4877A
ベトフルラン(イソフルラン)250mlVIRBACVET066(セントラベット)
ピ

参考文献

  1. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
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