方法論記事

マウスモデルにおける非安定化下顎骨折に対する低侵襲技術

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DOI：

10.3791/66824

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2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Physiopathological Bases of Osteochondrodysplasia, Imagine Institute, Université de Paris Cité, 2SFR Necker INSERM, LEAT antenne Imagine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、下顎骨の修復を分析するための包括的で効率的な方法を提供します。マウスモデルにおける非安定化下顎骨折の再現可能な技術について説明し、組織の損傷と骨の損失を最小限に抑えながら軟骨内骨修復のプロセスを分析できるようにします。

要約

マウスでは下顎部位に非安定化骨折を作れるため、軟骨内骨化モードを用いた骨修復の解析が可能になります。このプロセスを in vivoで最も正確に反映するには、特に下顎部位、つまり最小限のアクセスを特徴とする解剖学的部位において、過度の骨量減少と軟部組織の損傷を回避するための標準化されたプロトコルが必要です。私たちの知る限り、マウスの非安定化下顎骨折の低侵襲プロトコルを初めて説明します。成体マウスはイソフルランで麻酔され、皮下注射により術前用量のブプレノルフィンを投与されます。顎下膜アプローチが行われ、下顎骨の下縁に沿って皮膚切開が行われます。咬筋は、骨膜エレベーターを備えた下顎枝に沿って骨膜下面で上昇します。杉の垂直かつ完全な骨折は、基底縁から冠状突起の間(顆状突起と冠状突起の間)まで、底縁の生理食塩水血清灌漑下での圧電骨手術装置とハサミを使用して、下顎骨の骨折を完了します。スキンアプローチはシルク縫合糸で閉じられます。非安定化下顎骨折に対するこの詳細な手順は、骨量減少と軟部組織の損傷を最小限に抑える効率的な手順を提供します。この技術により、マウスモデルにおける軟骨内骨修復のプロセスを正確に反映し、成功し一貫した結果が得られます。

概要

骨修復は、骨折または骨切り術の安定化に応じて、膜状骨化プロセスと軟骨内骨化プロセスの両方を意味します。安定化骨骨切り術または骨折後の骨修復は膜性骨化に依存しているのに対し、非安定化骨折または安定化不良骨切り術は軟骨内骨化のモードに従って固化します1。膜性骨修復は、間葉系細胞が骨芽細胞に直接分化することによる骨形成を特徴とし、軟骨内骨修復は、一過性の軟骨テンプレートの形成を伴い、骨芽細胞に分化して骨カルスを形成します2。

骨の修復は、複数の組織と細胞の相互作用に依存します。また、部位特異的な要因やカルス3にかかる力の影響も受けます。下顎骨は、咀嚼力を支える可動性の骨であり、主に皮質骨によって形成されます。下顎骨修復のプロセスは、骨折の部位と方向の影響を受けます。筋肉や骨膜の損傷が骨圧固めや骨折部位4,5,6の重要な骨量減少に影響を与える可能性があることはよく知られています。

軟骨内下顎骨修復の分析は、価値ある偏りのない比較のための標準化された再現性のあるプロトコルを意味します。文献に関しては、マウスモデル3,7の非安定化下顎骨折のプロトコルを報告している著者はごくわずかで、ほとんどが大臼歯レベル8の前方を向いています。この技術を開発することにより、筋肉や骨膜の損傷を回避し、骨折部位での骨量減少を制限して、交絡因子なしに軟骨内骨修復のプロセスを最適に分析することを目指しています。また、マウス下顎骨折の新規技術を開発する目的は、小動物の術後疼痛や術後頻出する動物の死亡を最小限にすることでした。初めて、マウスのラムスレベルでの非安定化下顎骨折に対する低侵襲プロトコルについて説明します。このin vivoプロトコルは、骨折部位での過度の筋肉および骨膜の損傷または骨量の減少を回避し、術後の痛みのレベルと動物の死亡リスクを減らすのに役立ちます。

プロトコル

このプロトコルは、イマジン・インスティテュートの動物管理ガイドラインに準拠しており、倫理委員会とフランス省によって検証されています(APAFIS 26995)。

1. 動物たち

  1. グループごとの動物の数を決定します。グループごとに12匹の動物をお勧めします。マウスの性別と年齢を決定します。このプロトコルは、生後6週齢のC57BL/6Jマウス(雄または雌)に適合しています。
  2. 処置の少なくとも1週間前に、動物に順応のための栄養補助食品ジェルを与えます。

2.外科的処置

  1. 必要な材料を準備します。器具をオートクレーブします:はさみ、ニードルドライバー、鉗子、圧電骨手術装置のインサートとハンドピース、エレベーター。滅菌手袋、絹縫合糸(4/0)、シェーバー、綿ガーゼ、10%ポビドンヨード溶液、加熱テーブル、イソフルラン、およびイソフルラン吸入用の鼻マスクを準備します。
  2. ブプレノルフィンを0.1 mg / kgで調製し、滅菌注射可能な生理学的血清で希釈します。.手術の30分前に25G針による皮下注射によりブプレノルフィンを投与します。.
  3. ヒーティングプレート(37°C)を準備し、その上にフォームサポートを置き、鼻マスクを小さな針または粘着テープで固定します。
  4. マウスをイソフルランタンクに入れて誘導し、イソフルラン拡散(4%)します。つま先をつまむことによる麻酔の深さをテストします。十分な誘導の場合、ペダル反射の欠如が観察されます。
  5. 麻酔をかけたマウスを仰向けにして、全手順で37°Cに保たれた滅菌フィールドで覆われた加熱プレートに置きます。マスクを鼻に配置して、イソフルランを連続吸入します(2.5%に維持します)。マウスの四肢を粘着テープで固定します。
  6. 全身麻酔による目の乾燥を防ぐために、アイローションを両側に塗布します。顎下毛を剃り、滅菌手袋を着用し、10%ポビドンヨード溶液とアルコールを数回スワイプして皮膚を消毒します。
  7. 以下に説明するように、顎下皮膚アプローチを実行します。
    1. 下顎角から下顎骨の水平枝の1/3後部-2/3前接合部までの皮膚切開をマイクロハサミで行います。
    2. 皮下組織を解剖して、咬筋を露出させます。
  8. 下顎骨の下縁から骨膜エレベーターを使用して付着する咬筋を切断します。
  9. エレベーターで下顎枝に沿って骨膜下面の咬筋を持ち上げます。
  10. 圧電骨手術装置を使用して、下顎骨の下縁、下顎角の前方、下顎角の前方、凹面の後部で、圧電式骨手術装置を使用して、下顎骨下縁に小さな骨切り術(長さ3mm)を作成します(図1、 図2)。
  11. 下顎骨とコロノイドノッチの後縁を(マイクロハサミまたは鉗子で)特定し、下顎枝に沿って挿入された小さなまっすぐなハサミを使用して骨折を完了します。骨折の正しい向きを可能にするには、はさみを下顎骨の下縁に対して垂直に配置します。
  12. 骨折が完全に完全であることを確認します:鉗子による2つのセグメントのソフトモビライゼーション中に、2つの骨セグメント間の完全な可動性を観察する必要があります。
  13. 分離された縫合糸でシルク縫合糸(4/0)で皮膚アプローチを閉じます。骨膜に縫合糸は必要ありません。
    注:あるいは、皮膚アプローチは、他の非吸着性縫合糸(例えば、ポリプロピレン縫合糸)で縫合することができる。
  14. 頭部外X線検査を行い、骨折の方向を確認します(図3)。
    1. X線撮影を行う前に、マウスを再びイソフルランタンクに戻し、短時間再誘導します。次に、マウスを横側に伸展させ、X線分析のために頭をわずかに過伸展させます。
    2. 骨折が下顎臼歯のレベルで前方に配置されすぎている場合、または骨折が下顎角を剥離した場合(図4)は、骨カルスの体積の異常な増加を観察します。このような場合は、分析の偏りを避けるために、動物を研究から除外します。
  15. マウスが意識を取り戻すまでマウスをチェックしてから、ケージに戻します。

3. 術後のケア

  1. 咀嚼力を避けるために、キブルやハードエンリッチメントのないマウスケージを準備します。
  2. 皮膚が完全に治癒するまで、手術 したマウスを1つのケージに1週間隔離します。術後1週間で、同じケージ内で雌マウスを一緒に操作しました。
  3. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を、手順の4時間後、24時間後、48時間後、および72時間後に皮下注射で投与します。.
  4. 0日目から圧密期間の終わりまでのすべての術後期間(すなわち、28日間)にマウスにソフトダイエットジェルを給餌して、骨折の痛みと二次変位を避けます。
  5. 骨折後 0 日目から 4 日目まで、朝、ブプレノルフィン注射前、その後、動物が犠牲になるまで (骨折後 14 日)、マウスの体重を毎日測定します。
  6. 術後の動物の健康状態を評価して、術後の動物のケアを最適化します。 表 1 のスコア スケールを使用して、動物の術後状態を評価し、フォローアップを適応させます。スコアが 1 >の場合、ブプレノルフィン注射が行われ、スコアが 3 >の場合、および/または食物濃縮にもかかわらず術前の体重の 20% >体重減少の場合、安楽死について話し合う必要があります (表 1)。

結果

in vivo外科的処置に関しては、マウスモデルで非安定化下顎骨折のこの手順を最適に行うためには、特定の学習と訓練が必要です。

非安定化下顎骨折のこの技術は、軟骨内骨修復プロセスの研究を可能にします。安楽死後、下顎サンプルを4%パラホルムアルデヒド(24時間)で収集しました。EDTA pH 8で完全に脱灰した後、切片をパラフィンに包埋しました。矢状直切片を作製し、脱パラフィン溶液で脱パラフィンした後、標準プロトコルを用いてSirus Red/Alcian Blue染色の前に再水和しました。組織学的画像により、軟骨テンプレートを持つ柔らかいカルスの形成が確認されました(図5)。骨折後4週間で骨の治癒が完了することが、マイクロCT分析で示されています。カルス形成の開始(例:7日ごと(研究の目的に応じて7日ごと、14日目、21日目)以上)から骨治癒の終了(つまり、28日目)までのさまざまな重要なポイントで骨修復プロセスを、組織形態学的およびマイクロCT形態学的分析で研究することをお勧めします。

58匹の野生型マウス(C57BL/6Jバックグラウンド)で実施されたこの手順のレトロスペクティブ解析に基づくと、プロトコルの成功率は86.3%、除外率は13.7%です。除外は、術後早期の早期自然死(3%)、臨界スコアを示すマウスの安楽死の決定(1%、スコア>3および/または体重減少の場合>20%)、または骨切り術の異常な位置の場合、下顎角の異常な分割(5%)、または骨折が大臼歯レベル(n = 1/58)であった場合。後者の場合、感染が観察され、大臼歯レベルでの骨折の異常な分裂が認められました(n = 1/58; 表2)。

figure-results-1
図1:下顎上行枝の顎下皮アプローチの画像。 下顎骨の下縁はピエゾトームインサートで骨折し、骨量の損失を最小限に抑えます(矢印)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:マウスの下顎骨の染色。 6週齢の野生型マウスの下顎骨の側面図(アリザリンレッド/アルシアンブルー染色で染色):1.顆、2.コロノイド突起、3.コロノイドノッチ、4.角度突起、5.枝の後縁、6.下顎骨の基底(または下)境界。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:マウスの頭蓋骨のX線写真。 骨折していないマウスの下顎骨の側面を示す野生型6週齢マウスの頭蓋骨の側面(矢状図)と骨折したマウスの下顎骨の側面と、下縁から顆の前方に配置されたコロノイドノイドノッチまでの不安定な下顎骨折の方向(矢印)を示す野生型6週齢マウスの頭蓋骨の側面X線写真(矢状図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 4.最適でない条件下でのマウスの頭蓋骨のX線。 下顎角の異常な骨折を示す野生型6週齢マウスの頭蓋骨の側面X線(矢状図)(矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:代表的な結果。野生型マウス(C57BL/6J)の骨折後14日目の結果。 下顎骨折部位の再構成されたμCTスキャンの代表的な3D冠状図、骨カルス(白い矢印)を示しています。軟骨内骨修復プロセスの存在を確認する軟骨軟骨の代表的な画像(Sirus Red/Alcian Blue染色)。略語:B =骨、C =軟骨。スケールバー:200μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

012
動物の側面正常トイレの削減フリルの毛、アーチ型の背中
振舞い正常運動障害運動低下、食物摂取量の減少、体重減少>10%
臨床徴候正常瘢痕の炎症開いた傷跡、感染

テーブル 1.術後の幸福スコアスケール。

n = 58マウス
成功率86.3 %
除外率 :13.7 %
早すぎる自然死3%
クリティカルスコア<3、および/または体重減少>20%1%
下顎角への骨折の異常分裂5%
大臼歯レベルでの異常な骨折分割1.7 %

テーブル2.プロトコルの成功率と除外率。

ディスカッション

この技術により、マウスモデルにおける非安定化下顎骨折を、最小限のオープンアプローチで短時間(約10分以下)で実現することができます。この短時間の処置により、特にマウスなどの小動物における動物の罹患率や死亡のリスクが制限されます。軟骨内骨修復プロセスの分析で同等の結果を得るためには、下顎骨角の異常な分割なしに下顎骨折を同じ方向に行うために特別な注意を払う必要があります、この望ましくない影響は骨カルスの体積を異常に増加させ、圧密期間を遅らせる可能性があるためです。下顎骨折のこのプロトコルは、手術後の下顎切歯の成長に影響を与えません。このプロトコルの有効性を向上させるために、実験者には、まず同様の年齢の安楽死させた動物で運動し、必要に応じて下顎骨を骨折した直後に解剖して骨折方向を直接視覚化することをお勧めします。

隣接する筋肉からカルスに移動する間葉系前駆細胞は、骨の修復に寄与します6。骨膜および筋肉の損傷が骨固めに影響を与えることが実証されている5,6。さらに、筋肉切片が広範囲に及ぶと出血のリスクが高まり、術後感染につながる可能性があります。圧電手術は、主に頭蓋顔面骨手術の分野で開発されてきました。従来の骨切り術と比較して、軟部組織の損傷と術後の痛みの発生率が低いと報告されています7,9。咬筋と骨膜の損傷を最小限に抑えるために、圧電手術を使用して下顎骨の下縁で骨折を開始し、咬筋の広範な部分を避けるために枝の上部でハサミで骨折を完了しました。これは、ハサミでラムスの上部を骨折する前に、下顎骨とコロノイドノイドノッチの後縁の位置を制御することを意味します。下顎骨の下端で圧電手術を開始した後、小さなまっすぐなハサミを使用して骨折を完了するのに困難は発生しませんでした。この手順は、遺伝的背景が異なる成体マウス(C57BL/6J、CD1(結果は示されていません))、骨密度と下顎のサイズが異なる(予後、小顎症)成人マウスで経験しました。ただし、ハサミの長さが上部枝を一度だけ骨折するのに適していることを確認して、異常な骨折の裂け目を防ぐことをお勧めします。

この手順では、この最小限のオープンアプローチにより、出血のリスクが最小限に抑えられます。筋肉の挙上中に発生する可能性のある過度の出血が発生した場合、手術部位をガーゼで短く圧迫すると出血が止まります。下顎骨折が前方に偏りすぎていると、大臼歯骨折の場合、手術部位感染の潜在的なリスクが発生する可能性があります。この悪影響は、術後の横方向のX線で検出できます。この場合、動物は研究から除外されなければなりません。手術部位の術後感染は、血腫によるものでもあるかもしれません。これは、分離された皮膚縫合を行うことで防ぐことができ、術前に異常な出血が発生した場合に自発的な排出を可能にします。イソフルランと腹腔内注射による全身麻酔は、腹腔内注射の有害な外傷性影響に関連する過度の死亡率を回避します。.私たちの経験では、イソフルランによる全身麻酔に直接関連する動物の死は観察されませんでした。

マウスは、術後に食物摂取量の減少を示す場合があります。食物摂取量が不十分な場合や体重増加が不十分な場合は、ふるいにかけたキブルパウダーをゲルに加えることができます。術後の食物摂取を改善するために、宿泊手続きの少なくとも1週間前にキブル入りの栄養補助食品ジェルを与えることをお勧めします。フォローアップ中(毎週、フォローアップ中)および犠牲時に追加のX線撮影を行い、潜在的な骨折変位を評価することをお勧めします。非病理学的状態では、骨圧固めは骨折の4週間後に完了します。

何人かの著者は、マウス3,10,11の下顎骨の非安定化骨折に対する異なるプロトコルを記述している。骨切り術を行うために使用される器具は、ドリル、外科用ピンセットなど、さまざまです。ただし、ドリルを使用すると、骨量減少が大きくなり、軟部組織の損傷につながる可能性があります。私たちの知る限り、この非安定化下顎骨折の手順は、骨切り術を完了するための圧電手術とハサミを関連付けた最初のものです。この技術には、軟部組織を維持しながら、骨量の損失を最小限に抑えた正確な骨切り術を可能にするという利点があります。

すべての手法に関して、この方法にはいくつかの制限があります。圧電手術インサートで骨折を開始した後、はさみを使用して骨折を行うことを好みました。これは、潜在的な硬化遅延および/または偽関節症の形成を悪化させる可能性のある拡張された咬筋切片および骨膜損傷を回避します。しかしながら、この技術は、下顎枝を完全に可視化することなくコロノイドノッチの位置を制御して、同じ方向内で骨折を行うことを意味する。したがって、手術経験に応じて、学習曲線が予想されます。また、X線で下顎骨折の方向は、X線装置によっては可視化しにくい場合があります。骨折方向を確認するために in vivo マイクロCTは使用せず、全身麻酔の持続時間が長くなるためマウスの回復が損なわれる可能性があるためです。

軟骨内骨修復プロセスを研究することは、不安定な骨折の実現を意味し、したがって骨修復プロセスの理解を深めることができます。このステップは、骨修復欠損のあるマウスモデルでの前臨床試験を検討し、遺伝病の文脈で患者の欠陥性骨修復および偽関節症を治療するための新しい臨床応用を開発することを目的としている場合、または心的外傷後遺症または腫瘍後遺症の場合に必要です。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、Mutuelles AXAの慈善部門がHead and Heart ChairとANR BonyBrainを通じて部分的に支援しています。私たちは、プラットフォームSFR Necker INSERM US24、LEAT Imagine、パリ、フランスのすべてのメンバーに、手順の実現に貢献してくれたことを認めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブプレノルフィン:ブプレケア0.3mg / kgアニマルケア
エレベーターOBWEGESER幅6mm長さ17,5cm Collin MedicalHA 5905
鉗子 : パッド プレート MORIA 11 cm N°5MORIA9906
加熱台 Bioseblab 55 cm x 33 cmBioseblab707
ニードルホルダー : Micro Halsey ニードルホルダー - 金属 ラボダーム21,100
ネオクリアー Merck Millipore, Darmstadt, Germany109843 
Ocry Gel Tube 10 g (眼用潤滑剤)tvm lab  3.70045E + 12
ピエゾトーム2 ASS FINALACTEONX57402
エゾトームインサートピエゾチシオンPZ3ACTEONF87574
はさみマイクロ MORIAMC52
シルク縫合糸 PERMA HAND SEIDE  / MERSILKETHICONREF 18501G 
ストレートハサミMORIA4877A
ベトフルラン(イソフルラン)250mlVIRBACVET066(セントラベット)
ピ

参考文献

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