方法論記事

げっ歯類モデルにおける経口強制経口投与の代替方法としてのマイクロピペットガイド下薬物投与の使用

4K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/66836

⸱

2024年7月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、マイクロピペットガイド下薬物投与(MDA)を経口強制経口投与の代替方法として説明し、研究動物がストレスや不快感を最小限に抑えて治療を容易に摂取するように促します。

要約

シリンジに取り付けられたカニューレを使用した経口強制経口(OG)は、研究動物の胃に化合物を正確に投与するために使用される最も一般的な方法の1つです。残念ながら、この方法はオペレーターと研究動物の両方にとって困難を伴います。研究によると、OGは食道炎、食道の穿孔、不注意による気管薬物投与などの合併症を引き起こす可能性があることが示されています。さらに、OGは血漿および糞便コルチコステロンレベルの上昇(ストレスによる)、血圧の変化、および心拍数の増加と関連しており、研究結果に悪影響を及ぼしたり、バイアスをかけたりする可能性があります。以前に開発されたマイクロピペット誘導薬物投与(MDA)と呼ばれる代替法は、動物が低侵襲な方法で治療を容易に摂取するように奨励します。ここでは、異なるビヒクルで再構成された処理によるMDA技術の使用例を示し、さまざまな処理を複数の異なるマウス系統に効果的に送達する方法を示します。さらに、MDAは、薬物投与のタイミングと侵襲性を低下させ、主要な腸内微生物種の定量分析によって評価されるように腸内細菌叢の組成に影響を与えない技術であることを示しています。全体として、MDAはOGに代わるストレスが少なく効果的な代替手段を提供する可能性があります。

概要

げっ歯類モデルへの薬物投与は、通常、溶液を含む注射器に取り付けられたカニューレを使用して液体製剤を直接胃に投与することからなる経口強制経口(OG)によって達成されます。この技術は、動物への治療の一貫した正確な投与量をもたらしますが、複数の欠点も伴います。OGは、人間の食事曝露を適切にモデル化していないとして精査されています1,2。さらに、OGは、上部消化器系への意図しない損傷(食道と胃の穿孔)、投与された治療の誤嚥、および気道病変のリスクを高めます3。OGは、不快感4、血圧と心拍数5の増加5、ストレス6,7、そして時には動物による強制経口摂取に対する耐性の低下による死亡8にも関連しています。これらの生理学的変化は、実験結果を妨げたり、混乱させたりする可能性があります。したがって、これらの副作用を回避するための新しい手順が検討されています。研究では、薬物媒体としてのゼラチンの使用9、経口溶解ストリップ(ODS)10、ショ糖被覆強制針11、フレキシブル栄養チューブ、小麦クッキー12、蜂蜜13、ピーナッツバターペレット14など、OGの代替手順が利用されています。残念ながら、OG技術に対するこれらの変更には、水不溶性薬物との非適合性、治療のためのより長い調製時間15、薬物の嗜好性、および安定性15、および動物が食物に慣れ親しむことなどの制限がある。さらに、動物がアドリブで餌を与えると、投与量の精度が低下する可能性があります。

Scarboroughら7 は、以前にマウスで代替の経口治療方法を開発し、マイクロピペットガイド下薬物投与(MDA)と名付けました。この投与方法は、薬理学的物質のビヒクルとしての加糖練乳溶液に基づいており、研究動物が調製されたビヒクルおよび/または薬物溶液を消費するように動機付けます シングルチャネルピペットとピペットチップで溶液を分注することにより。この技術を導入するために、げっ歯類は、取り扱い時間を短縮し、研究動物がピペットチップ4からの飲酒に慣れることができるようにするためのトレーニングセッション(最低2日間)を受ける。Scarborough et al.7 と Schalbetter et al.16 による初期検証研究では、MDA 手順は従来の経口強制経口法よりも実装が容易で、費用対効果が高く、侵襲性が低く、動物にとってストレスが少ないことが示唆されています。Scarboroughらは、神経発達障害の母体免疫活性化(MIA)のマウスモデルでMDA技術の使用を紹介しました7。この研究では、抗精神病薬リスペリドンをMDAを用いて投与したマウスの薬物動態プロファイルがOGの使用と同等であることが示されました。さらに、MDAはマウスのコルチコステロン(ストレスホルモン)レベルの上昇を誘発せず、MDA技術を用いたリスペリドンによる慢性治療は、MIA誘発性社会的相互作用障害およびアンフェタミン過敏症の用量依存的な減少をもたらした7。追加の研究では、マウス17 モデルとラット18 モデルの両方でMDAとOGの有効性が調査されています。MDAはまた、腹腔内注射と比較されており、マウス16にクロザピン-N-オキシドを送達するのに同程度に効果的であることが示された。MDAが動物のストレスを軽減し、治療効果を発揮することに成功したと報告されていることから、私たちは現在、追加のマウスモデルを用いた効果的な薬物送達方法として、MDA技術をさらに探求することを目指しています。ここでは、免疫コンピテントなFVB/NJ株とC57BL/6J株、免疫不全の NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)株など、さまざまなマウス系統を、生きた細菌、水不溶性溶液(コーン油)で送達される実験化合物、ビヒクルコントロールなどのさまざまな経口治療で治療するためのMDA法の実施について説明します。血清と糞便中のさまざまな治療の活性と存在を評価し、MDA法に関連してコア腸内細菌叢の変化を評価しました。

プロトコル

すべての動物実験は、施設のガイドラインに従い、ジョンズ・ホプキンス大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)が承認したプロトコルM021M197およびM023M195に基づいて実施されました。使用したマウス系統(雄マウス、7週齢)は、材料表に記載されています。雄マウスの使用は、進行中の前立腺癌の研究におけるマウスの使用によるものでした。MDA法は、以前に雌マウスでも有効であることが示されている7,17。マウスは、それぞれのケージ/治療グループに無作為に割り付けられました。マウスはケージ内で治療され、順不同で治療されました。治療を実施した実験者は、治療群を知らされませんでした。マウスに割り当てられた番号は、マウスが治療された順序ではなく、マウスのIDを参照していました。データは、研究のタイムライン全体を通じて収集され、バイアスを避けるために最後に分析されました。実験的アッセイは、すべてのデータが収集されるまで、治療群を知らされませんでした。

注:このプロトコルは、Scarborough et al.7から変更されています。

1.治療の準備

  1. 加糖練乳(成分:牛乳と砂糖)と分子生物学グレードの水の溶液を、牛乳と水の比率が3:10の状態で調製します。ミルクの粘度により、15mLの円錐形チューブを使用して加糖練乳を測定します。
  2. 50 mLのコニカルチューブを使用して、分子生物学グレードの水を加糖練乳に混ぜ、一度に5 mLの水をミルクとゆっくりと混合します。
    注:このステップは、バイオセーフティキャビネットを使用して無菌条件下で実行されます。
  3. 乳溶液のアリコート(500μLアリコートとして保存)を調製し、目的の処理と組み合わせるまでアリコートを4°Cで保存します。
  4. それぞれの車両で治療を動物の体重に基づく正しい濃度で再懸濁してから、加糖練乳/水溶液と組み合わせます。.

2. MDA研修会

メモ: このセクションでは、マウスのモデルについて説明します。ただし、MDA技術は、より大きなげっ歯類モデル用の大容量/ピペットチップを使用して、必要に応じてスケールアップできます。

  1. オプション:片手で首筋を持って、研究動物を優しく拘束します。
  2. シングルチャンネルピペットと口にガイドされる200μLのピペットチップを使用して、研究動物に100μLの加糖練乳/水溶液のみ(実験的治療を追加せずに)を提供します。
  3. 動物の口を逃さないように、ミルク/水溶液をゆっくりと分配します。動物が5〜15秒の間に乳溶液を容易に消費することを確認します。
    注:このトレーニングは、最低2日間連続して(1日1回のトレーニングセッション)行われ、投与される量に変更はありません。MDAのトレーニングセッションには、首筋による穏やかな拘束が必要でした。Scarboroughら7 は、MDAトレーニングの初日に動物を完全に拘束し、その後2日目に尻尾による拘束を推奨しています。拘束の方法は、より大きなげっ歯類のモデルでは異なる場合があります。対照的に、Vanheckeら17 は、訓練中にマウスをわずかに尾で保持しただけでした。

3. MDA法によるマウス治療

  1. 研究処理を加糖練乳/水溶液と組み合わせます(以下の検証実験の例[セクション4およびセクション5]を参照)。
  2. オプション:片手で首筋を持って、研究動物を優しく拘束します。
    注:Scarboroughら7 は、マウスが訓練期間を超えて拘束を必要としなくなり、ピペットの先端から容易に飲むようになると報告しています。対照的に、Vanheckeら17 は、軽度の味覚嫌悪感を持つ可能性のある一部の治療(例えば、タモキシフェン)では、MDAはすべての治療中に首筋を介してマウスを穏やかに拘束することによって最もよく実行されると報告しています。また、この研究では、動物を背中に乗せてやさしい首筋に置くと、治療の時間と効果が向上することもわかりました。
  3. トレーニングセッション中に行ったように、シングルチャンネルピペットと200μLのピペットチップを動物の口にガイドして100μLの治療を行います。
  4. 一度に1匹の動物を扱います。
  5. 治療後、各動物をそれぞれのケージに戻します。
    注:MDA法を使用した治療は、毎日または繰り返し行うことができます7,17。

4. 検証実験#1 - MDAを用いたマウスへの腸内細菌の経口送達

注:このセクションでは、マウスの腸内コロニー形成研究のために生きた細菌を経口送達するためのMDA法の使用について説明します。この代表的なパイロット実験では、グラム陽性菌 Clostridium scindens をC57BL/6Jマウスに送達します。マウスは、MDAを細菌に接種する前に、飲料水で2日間連続して抗生物質(セフォキシチン)で治療されました。

  1. 細菌培養
    1. C. scindens株ATCC 35704を強化クロストリジウムブロス(RCB)で凍結グリセロールストックを使用して培養し、500μLの細菌を7mLのRCBチューブに接種します。37°Cで一晩で嫌気的に成長します。
    2. 500 μLの一晩の細菌培養物を使用して、新しいRCBチューブに接種し、24時間嫌気的にインキュベートします。このチューブを嫌気性チャンバーから取り外し、MDAの細菌治療の準備に使用します。この同じチューブを使用して、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU / mL)を計算します。
  2. C. scindens CFU/mL の計算
    1. 7 mLのRCB培地に3.5 mLの培養物を接種して、 C. scindens培養 物を1:3に希釈します。この希釈液のサンプルを使用して、-80°Cで保存した20%1 mLグリセロールストック(1:1)を調製します。
    2. 1:3希釈液100μLを強化クロストリジウム寒天培地(RCA)プレートにプレートします。最初の希釈を使用して、次に段階希釈を行い、さらに合計3回プレート化します。
    3. RCAプレートのインキュベーション後、コロニーをカウントし、CFUを計算します。次の式を使用して、希釈したサンプルと元のサンプル中の細菌細胞の濃度を計算します。
      希釈サンプル中のCFU(細胞/ mL)=(RCAプレートでカウントされたコロニー数)/(RCAプレートに添加された希釈サンプルの量(mL))
      元のサンプル中のCFU(細胞数/mL)=(希釈したサンプル中のCFU)/(RCAプレートの希釈度)
  3. MDAに対する C.scindens 治療薬の調製
    1. 50 μL (この例では 1.265 x 106 CFU/mL) の C. scindens の溶液 + 50 μL の加糖練乳/水溶液を組み合わせます。
      注:特定のCFUが必要な場合は、600 nmでの光学密度(OD)測定値を使用して標準曲線を作成するなど、細菌細胞定量の代替方法を使用できます。
  4. MDAを用いた C. scindens マウスの経口治療
    1. 1〜3日目に、セクション2(MDAトレーニングセッション)で説明されているように、マウスにミルク溶液を慣れさせます。
    2. 4日目に、 C. scindens + 乳溶液または PBS (コントロール) + 乳溶液 100 μL を MDA 経由で C57BL/6J マウスに投与します。研究期間中、マウスを一度治療します。
  5. 糞便サンプル採取
    1. マウスをそっと首筋で保持し、糞便ペレットが排出されるのを待ちます。直腸から直接糞便ペレットを滅菌済みの1.5mLマイクロ遠心チューブに収集します。サンプルは使用するまで-80°Cで保存してください。
  6. C. scindens定 量PCR(qPCR)
    1. 以前に公開されたプロトコル19,20を使用して糞便DNA抽出を実行します。
    2. DNA蛍光光度計を使用してDNA濃度を測定し、高感度で検出します。DNAサンプルを10 ng/μLに正規化し、使用するまで-20°Cで保存します。
    3. (i)C. scindens株ATCC 35704のdesA遺伝子に対する保存されたプライマーを使用したC. scindens細菌、(ii)前に説明したように、細菌16S rRNA遺伝子のV6超可変領域に対して設計されたプライマーを使用した全細菌の存在量を調査するためにqPCRを使用します20,21。
      注:使用したqPCR条件とプライマーを 表1に示します。 C. scindens株 ATCC 35704 DNAを用いた標準曲線を用いて、desA+細菌のコピーを推定した。

5. 検証実験#2 - MDAを用いたマウスへの薬物送達実験

注:このセクションでは、MDA法を使用してマウスに実験化合物を送達する方法について説明します。この代表的なパイロット実験では、大豆代謝物エクオール(S-エクオール)をNSGマウスとFVB/NJマウスに送達します。

  1. S-エクオール治療薬の調製
    注:S-エクオールとジメチルスルホキシド(DMSO)は、使用するまで-20°Cで分注して保存します。
    1. S-エクオールをコーン油と組み合わせたDMSOで再構成します(90%)。コーン油(220 μL)に分注したS-エクオールを、480 μLの加糖練乳/水溶液と混合します。この溶液を動物の部屋で混ぜ合わせて混合し、牛乳から油が分離するのを防ぎます。
      注:溶液の分離が観察された場合は、処理前に溶液を混合してください。S-エクオールの投与量は25 mg/kg/dayです。この研究で使用されたマウスはすべて体重が似ていたため、同じ用量を投与されました。治療の用量を調整し、研究動物の体重に基づいて複数の製剤にする必要がある場合があります。
    2. DMSOビークルとコーン油を組み合わせる(90%)。コーン油(220μL)に分注したDMSOを、480μLの加糖練乳/水溶液と混合します。この溶液を動物の部屋で混ぜ合わせて混合し、牛乳から油が分離するのを防ぎます。
      注:溶液の分離が観察された場合は、処理前に溶液を混合してください。
  2. MDAを用いたS-エクオールによるマウスの経口治療
    1. 1日目と2日目に、セクション2(MDAトレーニングセッション)で説明されているように、マウスにミルク溶液を慣れさせます。
      注:検証実験#1では、Scarboroughらに記載されているトレーニング時間に従い、3日間の順応時間を示唆しました。この実験では、より短いトレーニング時間(2日間)がテストされ、関心のある治療の投与を変更しないことがわかりました。
    2. 3〜43日目に、マウスを(i)PBSコントロール、(ii)DMSOビヒクル、または(iii)S-エクオールで処理し、すべて加糖練乳/水溶液と組み合わせます。溶液のマスターミックスを作成して、すべての研究動物に治療の均質な溶液を提供します。各マウスに合計100μLを1日1回、週5日、合計43日間投与します。
  3. 採血
    1. 安楽死(二酸化炭素の過剰摂取)後に心臓穿刺によって血液を採取します。血液をマイクロテーナー血清セパレーターチューブに移し、混合し、さらなる処理まで室温(RT)で保存します。
    2. 血液サンプルを遠心分離して、254 x g で5分間完全に分離します。血清(分離の最上層)を採取し、使用するまで-20°Cで保存します。
  4. S-equol 液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析(LC/MS/MS)アッセイ
    1. この実験に使用した化学物質と試薬については、 Table of Materials ファイルを参照してください。
    2. キャリブレーション標準と品質管理:S-エクオールと内部標準物質(ラセミエクオール-d4)のストック溶液をDMSOで1 mg/mLの濃度で調製し、-20°Cで保存します。
    3. ストック標準溶液をアセトニトリル:水(50:50)で希釈し、濃度の異なる混合作業溶液を調製します。酢酸エチルに内部標準液を抽出溶液として 100 ng/mL で調製します。ストック溶液と作業溶液は4°Cで保存し、毎日、希釈して、または直接使用してください。
    4. サンプル抽出
      1. 抽出溶液(酢酸エチルと内部標準液、セクション5.4.3を参照)によるタンパク質沈殿を使用してサンプルを調製し、続いて遠心分離して乾燥窒素(50°C)下で上清を蒸発させます。
      2. サンプルを 100 μL の 50% アセトニトリルに溶解し、オートサンプラーバイアルに移して LC/MS/MS 分析を行います。
    5. サンプルの分離
      1. C18 カラム (2.1x50 mm、1.7 μm) で分離を行い、移動相 A には 0.1% ギ酸を、アセトニトリル移動相 B には 0.1% ギ酸を使用します。
      2. グラジエントを使用し、移動相 B を 40% で 0.3 mL/分の流速で 0.5 分間保持します。その後、流量を100%まで1分間増やし、2分間保持した後、40%Bまで1分間戻します。
      3. ネガティブモードで動作しているエレクトロスプレーイオン化を使用した質量分析検出器を使用して、カラム廃液をモニターします。S-エクオールの 241 → 119.1、内部標準物質である equol-d4 の 245 → 123 の多重反応モニタリング(MRM)遷移をモニターするように分光計をプログラムします。
      4. 分析の面積比ピークと内部標準試料を使用して、5 〜 500 ng/mL のキャリブレーション範囲を使用し、1/x2 重み付け関数を持つ二次方程式を使用して、S-equol の検量線を計算します。

6. MDA治療が腸内コア微生物叢に及ぼす影響の測定

注:このセクションでは、qPCRを使用してMDA治療後のコア腸内細菌叢のレベルを測定する方法について説明します。

  1. 手順4.5.1および4.6.1で説明されているように、糞便サンプルの収集とDNA抽出を実行します。
  2. DNA蛍光光度計を使用してDNA濃度を測定し、高感度で検出します。DNAサンプルを10 ng/μLに正規化し、使用するまで-20°Cで保存します。
  3. (i)Akkermansia muciniphila、(ii)Bifidobacterium spp.、(iii)Streptococcus salivarius、(iv)Lactobacillus spp.、および(v)前述したように、細菌の16S rRNA遺伝子のV6超可変領域に対して設計されたプライマーを使用して、腸内細菌叢のメンバーの存在量を調査するためにqPCRを使用します20,21,22。
    注:使用したqPCR条件とプライマーを 表2に示します。

結果

MDAは、マウスモデルにおける細菌株の経口送達に使用できます。 C57BL/6Jマウスを抗生物質(飲料水中のセフォキシチン)で2日間治療し、MDAトレーニングセッションを開始する前に、共生微生物群集を除去しました。加糖練乳/水溶液は、治療投与前の3日間、1日1回連続して投与されました。.マウスは、MDA治療投与中に穏やかな首筋によって一時的に拘束されました。.4日目に、マウスをPBS(ネガティブコントロール、n = 4)または C.scindens (desA +細菌、n = 4)の嫌気性培養物で1回処理しました。すべてのマウスは、通常、数秒以内に治療を受け、全用量(100μL)を飲みました。嫌気性細菌の送達と存在を検証するために、抗生物質治療後に採取した糞便サンプルと、PBSまたは C.シンデンス 治療の24時間後に採取した糞便サンプルを比較しました(図1)。糞便DNAを単離し、定量し、10 ng/μLに正規化して、 C. scindens ATCC 35704 desA遺伝子特異的プライマーを使用してqPCRを実施しました(表1)。抗生物質で処理したマウスには、desA+細菌が最小限またはまったくないことが観察されました。予想通り、 C. scindensを投与したマウスでは、PBS対照群とは有意に異なるdesA+細菌の量が大幅に増加しました(p = 0.0286、 図1)。

MDA法による実験化合物(S-エクオール)の送達 NSG(n = 15)およびFVB/NJ(n = 18)マウスは、治療投与の2日前に加糖練乳/水溶液による訓練を受けました。NSGマウスは、エクオール産生腸内細菌、すなわち内因性エクオール産生を排除するために、抗生物質治療(飲料水中のセフォキシチン)を受けました。FVB/NJマウスには、内因性エクオール産生を排除するために大豆を含まない食事を与えました。すべてのマウスは、治療を施すために、穏やかな首筋で短時間拘束されました。対照群はコーン油と組み合わせた加糖練乳・水溶液を、DMSO群(S-エクオールのビヒクル対照群)はコーン油中の加糖練乳・水溶液とDMSOを、エクオール群はコーン油中の加糖練乳・水溶液とエクオールを投与しました。マウスは、MDA技術を用いて週5日、合計43日間治療されました。マウスは通常、数秒以内に治療を受け、全用量(100μL)を飲みました。全体として、すべてのマウスは、特定の日に用量の少なくとも半分を消費しました(特定の日に部分的な用量を消費しましたが、前日または翌日に完全な用量を投与しました)。研究の過程を通じて治療を完全に拒否したマウスはいません。首筋を絞った後、マウスを仰向けに配置することで、治療の消費時間が改善され、動物が全用量を摂取することが保証されることを観察しました。

循環エクオールレベルは、効果的なMDA薬物送達を示しています。 研究終了時に安楽死後のNSGマウスから血液サンプルを採取し、エクオールのMDA送達が研究動物のエクオール濃度の循環につながったことを確認しました。エクオール処理マウスの1つからは、LC/MS/MSアッセイを実施するのに十分な血液が回収されませんでした。血清エクオールレベルは、ジョンズ・ホプキンス大学医学部のAnalytical Pharmacology Shared ResourceでLC/MS/MSによって測定されました。対照群とDMSO(エクオールビヒクル)群では循環エクオールは観察されませんでしたが、エクオール処理マウスでは血中エクオールが検出されました(図2)。重要なことは、この実験では動物が犠牲にされた日時が異なるため、エクオールを投与したマウスの循環エクオールレベルに多少の変動が生じることが予想されることです。

腸内微生物群集は、MDA治療後も変化しません。 MDA乳溶液(エクオールの有無にかかわらず)が腸内細菌叢に及ぼす影響は、FVB/NJマウスを用いて評価しました。ベースライン時(無処理/MDAなし)に採取した検体と、治療開始7日後(MDA開始9日後、研修日を含む)に採取した検体の微生物組成を定量した。前述したように、種特異的なqPCR分析(図3)によって評価されたように、コア腸内細菌叢(Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium spp.、Streptococcus salivarius、Lactobacillus spp.)の総細菌量または全体的な微生物組成に有意な変化は観察されませんでした21,22。1つのケージは、ベースラインとMDA治療後との間に乳酸桿菌に有意差を示しました。ただし、この結果は DMSO 車両制御で観察され、すべてのケージで一貫しているわけではありませんでした。

figure-results-1
図1:MDAは、糞便qPCRによって定量化できる嫌気性細菌をマウスの腸に送達します。 C57BL/6Jマウスを2日間連続して飲料水中で抗生物質で治療した。次に、マウスをMDA法を使用して嫌気性細菌C.scindensで処理しました。糞便C.シンデンス(desA +)の細菌負荷は、抗生物質治療後とMDA治療後24時間(PBSまたはC.シンデンス)の両方でdesA遺伝子のqPCRによって測定されました。(A)抗生物質治療後およびMDA治療後24時間後のPBSおよびC.シンデンス処理マウス間で、C.シンデンス特異的desA遺伝子の定量が示されています。(B) (A) の MDA 後 24 時間について示されたのと同じデータを縦棒グラフとして示しています。統計的有意性は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して決定されました。(*) p = 0.0286、エラーバー = SD。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:MDA法によるエクオール投与を受けたNSGマウスの循環エクオール濃度の解析。 血清エクオールレベルは、コントロールマウス(n = 5)、DMSO(ビヒクル、n = 5)、およびエクオール(n = 4)で処理したマウスでLC/MS/MSを介して定量しました。エクオール処理マウスの1つからは、LC/MS/MSを実施するのに十分な血液が回収されませんでした。これらの治療は、MDA法を用いて実施しました。血清エクオールは、エクオール治療群でのみ検出されました。定量限界< 5 ng/mL です。統計的有意性は、多重比較を伴うノンパラメトリック一元配置分散分析(ダン補正)を使用して決定されました。(**) p = 0.0053, error bars = SD. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:MDA処理後のFVB/NJマウスでは、コア腸内細菌と総細菌負荷レベルは変化しません。 MDA法を用いた治療投与前後の標的微生物群集のqPCR Cq値に有意な変化は認められませんでした。 ラクトバチルスは 、ベースラインとMDA治療の間でケージ3でのみ有意差(*、p = 0.0321)を示しました。この結果はケージ間で一貫していなかった。ケージ番号はC1-C4とマークされています。統計的有意性は、多重比較(テューキー補正)による一元配置分散分析(ANOVA)を用いて決定した。エラーバー = SD。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プライマー名プライマー配列PCR条件
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93°C 3分、34サイクル(95°C30秒、54°C30秒)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

表1:desA +細菌(C.scindens)のプライマーとqPCR条件。

プライマー名プライマー配列PCR条件
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95°C、3分
36サイクル
95 °C、30 秒
53 °C、30 秒
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50°C、5分
95°C、10分
40サイクル
95 °C、15 秒
60°C、1分
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95°C、3分
36サイクル
95 °C、30 秒
53 °C、30 秒
S.salivarius_F
S.salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95°C、10分
44サイクル
95 °C、15 秒
60°C、1分
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50°C、2分
95°C、10分
40サイクル
95 °C、15 秒
62°C、1分

表2:コア腸内細菌叢に対するMDAの効果を測定するために使用されるプライマーとqPCR条件。

ディスカッション

OGは、研究動物におけるストレスの大きな原因となり得ることがあり、以前に複数の研究で評価されたように、交絡変数を作り出す可能性がある7,9,11,12,13,14,15,23。OGの侵襲性のため、OG 9,10,12,13,14,15に関連する課題を最小限に抑えるために、別の技術が採用されてきた。マイクロピペット誘導薬物投与(MDA)は、シングルチャネルピペットと目的の薬物と加糖練乳溶液との混合物を使用して、低侵襲的な方法で薬物送達を可能にする新しい技術です7。このテクニックの重要なステップは、動物がピペットチップと加糖練乳の風味により慣れ親しむことができ、全体的に取り扱い時間と苦痛を軽減するためのトレーニングセッション(最低2日間)です。また、このトレーニングセッションにより、マウスは他の技術よりもはるかに速く、正確な投与量で、加糖練乳溶液に組み込まれた薬物を容易に摂取することができます。

私たちの研究は、Scarborough et al.7で提示された加糖練乳/水溶液の調製と送達を綿密に追跡しました。研究期間中、マウスは投与前に水や食物を奪われませんでした。彼らはそれぞれのハウジングケージに入れられ、治療のタイミングは1分未満でした。私たちの研究の主な違いの1つは、おそらく私たちが使用したアルビノマウス系統の視覚障害の可能性と、薬物治療によるわずかな味覚嫌悪の可能性のために、すべてのマウスがトレーニングと治療プロトコルの一部として穏やかな首筋による短時間の拘束を必要としたことです。MDA治療に対するこの変更は、Vanheckeらによって推奨されています.16。やさしい首筋は、マウスを背中に配置するとともに、マウスが熱心にミルク溶液を消費するように促しました。トレーニングと治療のステップの一部としての穏やかな首筋の必要性はオプションであり、研究に依存すると結論付けています。治療の投与(該当する場合は動物の体重を補正)は標準化された量で行われ、マウスは行動の変化を示さなかった。最初の研究7に対するその他のわずかな変更には、トレーニングセッションの数と各セッションで実施される量の減少が含まれていました。この研究で遭遇した制限には、一部のマウスがトレーニングの初日および研究中の時点で全用量(100μL)のミルク溶液を飲むことの抵抗が含まれます。これは、マウスを拘束された状態で背中に配置することで克服されました。この研究では、薬物と加糖練乳溶液との相互作用、マウスの性別間の消費量の違い(ただし、MDAは以前に雌マウスでも有効であることが示されている7,17)、またはOGに関連するコルチコステロンレベル7,11,14などのストレスマーカーの上昇は評価されていません。

この研究では、MDA技術が正確な用量の実験的治療を提供する能力に焦点を当て、次に研究動物で関心のある治療の糞便および/または循環レベルを評価しました。同様に、MDA治療が腸内細菌叢を変化させるかどうかを評価し、研究動物のコア糞便微生物叢または総糞便細菌量に最小限のまたはまったくの変化が観察されませんでした。同様に、MDA治療による動物への怪我は観察されませんでした。結論として、MDAは、げっ歯類モデルにおける短期および長期の治療提供の代替方法として役立つことができます。全体として、MDAはOG関連の傷害のリスクを減らすことにより、動物福祉にプラスの影響を与える立場にあります。MDAは、他の技術のいくつかの限界を克服し、多くの異なるげっ歯類モデル24のトランスレーショナルリサーチに広く使用できることを提案します。

謝辞

Department of Defense Prostate Cancer Research Program Award W81XWH-20-1-0274およびProstate Cancer Foundation Challenge Award 16CHAL13からの研究支援に感謝いたします。ジョンズ・ホプキンス大学分析薬理学共有リソースのMichelle Rudek博士、Noushin Rastkari博士、Nicole Anders博士、Linping Xu氏に、エクオールLC/MS/MSのご協力に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
200 µL ピペットチップメトラー・トレド17005860
AB SCIEX トリプル QTRAP 5500 質量分析検出器Sciex N/A
アッカーマンシア ムシニフィラ菌 株 muc ゲノム DNAアメリカンタイプ カルチャーコレクションBAA-835D-5
酢酸アンモニウムSigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J miceJackson LaboratoriesStrain# 000664
C. scindens 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
コーン油MedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
エタノールフィッシャー サイエンティフィAC611050040
ギ酸Sigma –Aldrich5.33002
FVB/NJマウスJackson LaboratoriesStrain# 001800
Glycerol Sigma–AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
LC-MS グレードの水Fisher Scientific14-650-357
メタノールFisher Scientific02-003-340
Microtainer 血清セパレーターチューブBecton Dickinson02-675-185
分子生物学グレードの水Corning46-000-CI
NSG マウスJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
強化クロストリジウム寒天Anaerobe SystemsAS-6061
強化クロストリジウムブロスAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
Cayman Chemical10010173用 S-equol 参照標準
チャンネルピペットレイニン 17008652
Streptococcus salivarius ゲノム DNAアメリカンタイプカルチャーコレクションBAA-1024D-5
加糖練乳CaliforniaFarms B09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
&β;-グルクロニダーゼ Helix pomatiaSigma–アルドリッチG7017
ック LC-MS Single

参考文献

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事