方法論記事

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

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DOI:

10.3791/66866

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2024年6月14日

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1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

この記事について

サマリー

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。

要約

過去10年間で、シングルセルアプローチは、遺伝子発現ダイナミクス、細胞の不均一性、およびサンプル内の細胞状態を研究するためのゴールドスタンダードになりました。シングルセルが進歩する前は、発生初期に動的な細胞状況と急速な細胞遷移を捉える可能性は限られていました。この論文では、原腸陥入の開始と完了に対応する、胚のE6.5日目からE8までのマウス胚の単一細胞および核分析を実行するための堅牢なパイプラインを設計しました。胃腸形成は、器官形成に不可欠な中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの胚葉を確立する発達中の基本的なプロセスです。野生型の腹陥陥胚に適用されたシングルセルオミクスに関する広範な文献が入手可能です。しかし、変異胚のシングルセル解析はまだ少なく、多くの場合、FACSで選別された集団に限定されています。これは、ジェノタイピングの必要性、時限妊娠、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数、およびこれらの段階での胚あたりの細胞数に関連する技術的な制約に一部起因しています。ここでは、これらの制限を克服するために設計された方法論を示します。この方法は、望ましい遺伝子型との同期妊娠の可能性を高めるために、繁殖と時限妊娠のガイドラインを確立します。胚単離プロセスの最適化ステップと同日ジェノタイピングプロトコル(3時間)を組み合わせることで、微小液滴ベースのシングルセルを同日に実施することができ、細胞の高い生存率と堅牢な結果が保証されます。この方法には、胚からの最適な核単離のためのガイドラインがさらに含まれています。したがって、これらのアプローチは、原腸陥入期における変異胚のシングルセルアプローチの実現可能性を高めます。この方法により、突然変異が原腸の細胞ランドスケープをどのように形成するかの解析が容易になると期待しています。

概要

生殖は、正常な発達に必要な基本的なプロセスです。この急速でダイナミックなプロセスは、多能性細胞が臓器の形成方法を定義する系統特異的な前駆体に移行するときに発生します。長年にわたり、原腸陥入は、中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの大部分が均質な集団の形成と定義されてきました。しかし、高解像度技術と新たな数の胚性幹細胞モデル1,2により、初期の胚細胞層3,4の間に前例のない不均一性が明らかになりました。このことは、原腸の異なる細胞集団を調節するメカニズムについては、まだ解明されていないことがたくさんあることを示唆しています。マウスの胚発生は、原腸陥入中の初期の細胞運命決定を研究するための最良のモデルの1つです3,5。マウスの胃腸陥入は急速で、原腸陥入の全過程は胚の日E6.5からE85までの48時間以内に起こります。

近年のシングルセル技術の進歩により、野生型マウスの胚発生の詳細なマッピングが可能になり、原腸陥入中の胚の細胞および分子ランドスケープの包括的な概観が得られました3,4,6,7,8。しかし、これらの段階での変異胚の解析はあまり一般的ではなく、しばしばFACSで選別された集団に限定されている9,10。この希少な文献は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の操作と単一細胞調製に関連する技術的な課題を反映しています。原腸陥入のダイナミックな過程を捉えることは、特に変異胚を理解するために、その急速な性質のために課題を引き起こす可能性があります。妊娠のタイミングと同期は不可欠であり、妊娠のタイミング間のわずかな違いでさえ、突然変異遺伝子に起因する発生表現型と誤解される可能性があります。これは、突然変異遺伝子が原腸陥入のプロセスに影響を与える場合に特に重要になります13,14。この研究では、膣栓(つまり、交尾後に女性の膣内に形成される凝固した精液の塊)の視覚化を通じて同期妊娠を取得するためのガイドラインが確立されています。さらに、E6.5からE8までの突然変異原腸陥入胚から堅牢な単一細胞データを取得する戦略が設計されています。この戦略は、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数が少ないこと、および凍結融解する胚または細胞によって引き起こされる生存率の低下に関連する制約を克服するために考案されています。

この論文では、膣プラグによる時限妊娠の確立から、単一細胞/核の最終的なシーケンシングまで、最適化された方法論について説明します。この方法は、所望の遺伝子型を持つ胚の数を増やすために同期妊娠の数を増やす方法、細胞の生存率を改善するための細胞/核の単離、および同日のジェノタイピングプロトコルを説明する。この原稿では、さまざまな原腸陥入の時点での胚分離のプロセスについても説明しています。この方法論は、シーケンシングのための最終生存胚細胞/核の数を増やすのに役立ち、高品質のシーケンシングデータを確保します。したがって、この方法は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の単一細胞研究への扉を開くことになります。

プロトコル

このプロトコルおよび記載されているすべての動物実験は、正式に承認され、テンプル大学施設動物管理・使用委員会によって確立された施設ガイドラインに従っており、これはAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの国際ガイドラインに従っています。記載されているすべてのマウスは、C57/BL6Nバックグラウンド系統を使用していました。これらの研究では、動物の健康に関する懸念は観察されませんでした。

1.繁殖コロニーと時限妊娠

  1. 膣栓の視覚化により、妊娠の時間を計ります。プラグの日の正午はE0.5と見なされます。
  2. 欠けた広葉樹の寝具と紙の巣材を含む寝具材料を備えたケージ内のイエネズミ。
    1. 各ケージには、ネズミの餌、淡水、濃縮物(トンネルや巣材など)が含まれています。時間指定の繁殖中に毎日コロニー情報を追跡し、収集します。
    2. マウスの年齢、メスのマウスの妊娠数、オスのマウスが挿入したプラグの数、メスのマウスの発情期(図2)など、すべての情報を記録します。
      注:すでに1〜2回出産した女性は、将来の妊娠でより大きな同腹児サイズを提供します。
  3. 時限妊娠を開始する前に、繁殖の1週間前に雄のマウスをケージに一人で収容してください。繁殖開始の週に、ケージにオス1匹あたり少なくとも1匹のメスを導入します。
    注:承認された動物のプロトコルによっては、繁殖ケージに2〜3匹の雌を追加することが許可されている場合があり、プラグの生成を増やすために好まれます。
  4. ケージ全体での同期妊娠の可能性を高めるために、少なくとも4つの繁殖トリオ(2匹の雌マウスと1匹の雄)を設定します(つまり、同じ日に複数のプラグを使用します)。これにより、同じ発生段階で単離される胚の数が増えます。
  5. 午後5時前の午後または夕方に理想的な交尾を手配し、雌は雄のケージに入れられるか、またはその逆です。繁殖が4〜5日で起こらない場合は、交配パートナーを1日おきに切り替えることを検討してください。
    注:翌朝に膣栓を確認できない場合は、前日の夜(つまり、週末/休日)に繁殖ペアを分離してください。
  6. 毎日早朝に膣栓を確認してください。午前9時前が望ましいです。
    1. 膣栓の有無を調べるには、雌マウスの尾の付け根をそっと持ち上げ、膣口を観察します。白またはクリーム色のゼラチン状の塊を探します。多くの場合、膣栓は明らかですが、はっきりしない場合は、ピンセットを取り、膣口をそっと探ります。絶縁のためのより明白なプラグのみを検討してください。 図 2C を参照してください。
      注:妊娠の可能性を見逃さないように、早朝に膣栓を確認することが重要です。プラグは12時間後に脱落または溶解する可能性があります。
      注意: プラグが観察された場合でも、雌のマウスが妊娠することを保証するものではありません。プラグが部分的であるかまったく観察されないが、雌マウスの膣口付近に発赤がある場合は、プラグが固着する可能性が低いため、これらの雌を隔離対象と見なさないでください。交配後の妊娠の可能性はマウス系統によって異なり、交配中の発情周期の段階によって異なります(図2)。
  7. 膣栓が観察されたら、その日を記録します。膣栓が観察されたのと同じ日の正午はE0.5と見なされます。雌マウスを繁殖ケージから分離し、所望の原腸陥入の段階に応じて胚を分離します。
    注:この方法では、嵌合の正確なタイミングは提供されません。従来、交配は前夜の真夜中頃に起こると想定されていました。したがって、胚は膣栓が観察された日の正午までに半日齢(E0.5)であると見なされます。

2. 原腸陥入期におけるマウス胚の単離

  1. 胚の単離を開始する前に、必要なすべての試薬と機器を準備してください。
    1. 70%エタノールでその領域を完全に清掃します。すべての解剖ツール(鉗子とハサミ)が洗浄され、滅菌されていることを確認してください。無菌の5 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/10%ウシ胎児血清(FBS)と20mLのDPBSを取り出し 、氷上に置きます。
    2. 透過光ステージとカメラを備えた実体顕微鏡を使用してすべての分離を行い、全体的な発達表現型形成を支援します。
  2. 妊娠中のマウスダムを安楽死させ、すぐに隔離を開始します。
    1. 妊娠中のダムをCO2 チャンバーに入れ、CO2 の流量がケージ容積の20%/分を変位するように調整します。マウスを注意深く監視し、呼吸の動きがないことを観察して死を確認します。
    2. 呼吸運動がない場合、さらに2分間CO2 の流れを維持します。頸部脱臼を行うことにより、安楽死を確認します。
    3. マウスを通常の立位にして、しっかりとした平らな面に置きます。次に、片方の手の親指と人差し指を頭蓋骨の付け根にある首の後ろに当てて、もう一方の手で尾の付け根を持って後ろに引っ張りながら、前方と下に押します。
    4. 脱臼の効果を頚椎の分離を実感して検証します。脊髄が切断されると、後頭顆と最初の頸椎との間に2〜4mmの空間が触知可能になります。
      注:細胞の生存能力が影響を受けるため、一度に複数の妊娠中の母親を安楽死させないでください。イソフルオランは、施設動物管理および使用委員会(IACUC)または同等の機関によって承認された場合、代替麻酔薬として使用できます。
  3. 妊娠中のダムを背中に置き、膣口付近をエタノールで滅菌します。
    1. 解剖ハサミとピンセットを使用して、膣口近くの皮膚のひだを持ち上げ、小さなV字に切り込みを入れ、妊娠中の母の子宮をゆっくりと露出させます(図3 [黄色の矢印])。
    2. 妊娠中の母の子宮角の一端をピンセットで保持し、それに沿って切断し、子宮頸部を確実に取り除くことにより、子宮角を解剖します。子宮角をDPBSが入った10cmのシャーレに入れます-/- 氷上(図3)。
      注:胚の分離段階に応じて、子宮は小さいまたは大きい着床部位(つまり、ひも上の「真珠」)に似ています。
  4. 解剖ハサミとピンセットで、内部の脱落膜膨潤を含む各移植部位(「真珠」)を切断し、氷上の6cmのシャーレに新鮮なDPBSに入れ ます(図3)。
    注:平均的な妊娠中の母は、約6〜8個の胚を移植します。
  5. 移植部位を 1 つ取り、実体顕微鏡ステージの上にある新しい 6 cm シャーレに置き、その上に 500 μL の DPBS-/- を追加します。顕微鏡と光源の焦点を調整します(図3)。
    注:移植部位のサイズによっては、DPBSの量が異なる場合があります。目標は、移植部位が水没するのに十分なDPBSを確保することです。
  6. 先端の細い解剖ピンセットを使用して、移植部位から子宮筋を取り出します。片方の手でピンセット1組で移植部位を押さえ、もう片方の手で子宮角から切り取った移植部位の端にもう1組の鉗子をゆっくりと挿入すると、脱落膜の腫れがゆっくりと現れます(図3)。
    注:子宮表面を強く引っ張ったり引っ張りすぎたりしないでください、脱落膜腫脹の破裂や胚の溶解につながる可能性があるためです。
  7. 脱落膜腫脹が分離された後、胚の露出に進みます。
    1. 脱落膜腫脹の抗中間膜端を一方の鉗子で保持し、もう一方のペアで、中間膜腫脹から脱乳膜腫脹の約1/4のサイズ(つまり、多くの場合、脱落膜腫脹のより尖った端)に水平にゆっくりと切り込みを入れます。
    2. 次に、両方の鉗子を使用して、脱落膜腫脹の抗中間体側からゆっくりと押すと、胚が切りたての中質側端から飛び出します(図3)。
      注:脱落膜の腫れに引き裂かないでください、これは胚を壊します。必要に応じて、脱落膜腫脹の中層端に沿って小さな切り込みを入れます。
  8. 胚が明らかになったら、付着している胚外組織をすべて取り除きます。
    1. 頭頂胚葉嚢と外胎盤円錐は、露出プロセス中に胚から自然に剥がれる可能性がありますが、そうでない場合は、一対の鉗子を使用して、関連する母体血液と一緒に取り除きます。次に、2つの鉗子を使用して、1つのペアで胚を押さえ、もう一方のセットを使用して胚から内臓の卵黄嚢をゆっくりと剥がします。
    2. P20ピペットを使用して、ディッシュから10μL以下のDPBSを含む 卵黄嚢を氷上の8ストリップポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに入れます。
      注:卵黄嚢サンプルが妊娠中の母からの組織で汚染されていないことが重要です。汚染は、胚の誤った遺伝子型の割り当てにつながる可能性があります。
  9. 分離されたばかりの胚の明るい野写真を撮って、同腹仔のステージングが類似していることを確認します。P200ピペットを使用して、50 μLのDMEM/10% FBSで胚をゆっくりとピペットで培養し、氷上の1.5 mLチューブに入れます。遺伝子型が確認されるまで、胚を氷上に残します。
    注:胚は3〜4時間氷上に保持され、明らかな劣化はありませんでしたが、細胞生存率の低下が起こるため、この時間を超えないようにしてください。それに応じて胚とジェノタイピングチューブを標識します。胚間の総表現型の違いを特定し、注釈を付けるために、明視野画像を撮影することが推奨されます。
  10. 残りのすべての脱落膜腫脹について、これらの手順を繰り返します。すべての解剖ツールを清掃し、すべての分離に新しいプラスチックを使用して、以前の分離による汚染がないことを確認します。
    注:解剖手順が、妊娠中のダムからの移植部位の収集の瞬間から1時間に制限されていることを確認してください。
  11. 次の妊娠母から胚を分離することに進みます(複数の同時妊娠が特定された場合)同日のジェノタイピングステップに進む前に。

3. 同日ジェノタイピング(図4)

  1. 各内臓卵黄嚢を8ストリップPCRチューブで消化します。P20ピペットを使用して、19.3 μLのPCRテンプレートDNA溶解バッファーと0.7 μLの0.2 μg/mLプロテイナーゼKを各卵黄嚢サンプルに加えます。
  2. サンプルを10秒間ボルテックスし、ストリップアダプター付きのミニ遠心分離機とストリップアダプターを使用して10秒間スピンダウンしてサンプルをチューブの底に配置します。8ストリップPCRチューブを85°Cのヒートブロックに45分間入れ、5分ごとに5秒間ボルテックスします。
    注:消化中にサンプルをボルテックスして、45分で細胞溶解を最大化することが重要です。
  3. 45分後、ストリップアダプター付きのミニ遠心分離機とストリップアダプターを使用してチューブストリップを10秒間回転させ、PCRを進めて目的の遺伝子同定を行います。参考までに、Cre-loxシステムのサンプルプロトコルが提供されています。以下は、CreジェノタイピングのPCR条件の例です。ターゲットCreサイトの5'および3'領域を増幅するプライマーを設計します。
  4. CreジェノタイピングのためのPCR反応を行うには、10 μLのTaq DNAポリメラーゼミックス、0.5 μLの0.5 μMフォワードCreプライマー、0.5 μLの0.5 μM逆Creプライマー、5 μLのPCR認証水、および4 μLの卵黄嚢ゲノムDNAを含む各卵黄嚢について、8ストリップPCRチューブあたりのPCRマスターミックスを調製します。
    注:マウステールジェノタイピング用に最適化されたプロトコルを使用する場合は、よりクリーンな結果を得るために通常使用される量の2倍のDNAを追加してください。
  5. PCRマスターミックスが作成されたら、PCRサーマルサイクル増幅プログラムを実行します。Creジェノタイピングの場合、サイクルは次の通りです:(1)95°Cで3分間、(2)95°Cで30秒、(3)55°Cで30秒、(4)72°Cで30秒、ステップ2-4を34サイクル繰り返し、(5)72°Cで10分間、(6)4°Cホールド。PCR産物を1%アガロースゲル上で分析し、ジェノタイピングの結論を導き出します。
    注:遺伝子同定に複数のPCRが必要な場合は、PCR反応を同時に実行してタイミングを最適化してください。プロセスを迅速化するために、実験当日の前日にアガロースゲルを調製し、4°Cで一晩保存します。明確な遺伝子型のないサンプルは考慮しないでください。サンプルでは、遺伝子型と発生段階の両方を考慮に入れてください。なぜなら、同腹仔は原腸陥入の異なる段階にあり、結果を歪める可能性があるためです。LoxP対立遺伝子のジェノタイピングを行う場合、ゲルで予想されるPCRバンドは、使用するCreドライバーによって異なる場合があります。例えば、Creドライバーが内臓卵黄嚢で発現している場合、LoxpバンドはCre陽性(Cre+)胚でCre陰性(Cre-)と比較してシフトして見えます。ただし、Creが内臓卵黄嚢で発現していない場合、LoxpバンドのサイズはCre +胚とCre-胚で同じサイズになります(つまり、Loxp対立遺伝子は卵黄嚢系統でフロックスされません)。1つのCre+対立遺伝子と2つのLoxp対立遺伝子を持つ胚は、条件付きKO胚と見なされます。しかし、フロックス遺伝子の欠失を確認するためには、ジェノタイピングプロトコルを繰り返すか、フロックス遺伝子のmRNAレベルのqPCR解析によって、Creドライバーを発現する細胞上の遺伝子のノックアウトを確認することが推奨される(図4D、E)。
  6. 残りの消化された卵黄嚢サンプルは、-20°Cの冷凍庫に保管して長期保存してください。

4. 胚の細胞解離と細胞生存率

  1. 遺伝子型が確認されたら、P200ピペットと50μLのDMEM / 10%FBSをピペットします。同じ遺伝子型の胚を新しい1.5 mLチューブにプールし、チューブを氷上に置きます。
    注:グループあたり少なくとも5つの胚(E7-E7.5)または3つ(E7.75-E8)がない場合は、細胞数と生存率が大幅に減少するため、実験を続行しないでください。
  2. 遺伝子型に基づいて胚をプールした後、チューブの底に沈殿させます。プールされた胚を50μLのDPBS-/-を加えて洗浄し、胚が落ち着くのを待ってから、チューブから胚を取出さずにできるだけ多くのDPBSを 取り出します。この手順を 2 回繰り返します。
    注:1.5mLチューブを光源または窓に向けて保持すると、胚がチューブの底に沈殿するのを見やすくなります。
  3. プールした胚に100 μLのトリプシンを加え、ヒートブロック中で37°Cで5分間インキュベートします。1.5 mLチューブを30秒ごとに静かにフリックして、細胞が解離するのを助けます。
    注:トリプシン化プロセス中にボルテックスやピペットは、細胞に損傷を与えるため、使用しないでください。5個以上の胚(E7-E7.5)または3個(E7.75-E8)がプールされている場合は、等量のトリプシン(1胚あたり~20μL)で別のチューブでトリプシン消化を行います。胚あたり~20 μLのトリプシン(E6.5-E7.5)、胚あたり35 μL(E7.75)、および胚(E8)に40 μLを使用します。
  4. 5分後、トリプシンを300μLのDMEM/10%FBSで中和します。プールした胚を100 x g で室温(RT)で4分間遠心分離します。遠心分離後、すべてのサンプルに小さなペレットが現れます。ペレットを40 μLのDMEM/10% FBSに再懸濁し、氷上に置きます。
    注:ペレットのサイズは、プールされる胚の数によって異なります。ペレットが見えていない可能性がありますが、次のステップに進みます。トリプシンを中和するために必要なDMEM / 10%FBSの量は、追加されたトリプシンの量によって異なります。.トリプシン量にDMEMの3倍/ 10%を追加します。.
  5. 自動セルカウンターを使用して、再懸濁した細胞(40 μL)の濃度を測定します。5 μLの細胞と5 μLのトリパンブルーを新しい1.5 mLチューブで混合します。ピペットで十分に混合し、スライド上にピペットで移動して、細胞数と細胞生存率を測定します。細胞の最適濃度は700-1200細胞/μLで、細胞生存率は90%以上です。
    注:濃度が200細胞/μL未満で、生存率が50%未満の場合は、実験を続行しないでください。細胞濃度が高すぎる場合は、細胞懸濁液を希釈し、細胞を再カウントします。細胞の凝集が観察された場合は、細胞ストレーナーを使用して単一細胞懸濁液を確保します。
  6. マイクロ流体チップを用いたシングルセル分割に進み、マイクロ流体チップメーカー11のプロトコルに従う。

5. 核分離マウス胚(E8以降のより大きな胚の時点のオプション)

  1. 表1に概説した新鮮な溶解バッファーと洗浄バッファーを調製し、氷上に置きます。
    注:核の単離は、新鮮サンプルまたは凍結サンプルで実行できます。サンプルが凍結している場合は、氷上で2〜5分間解凍します。
  2. 実験を開始する前に、すべての遺伝子型を確認し、明確な遺伝子型の胚のみをプールします。
  3. P200ピペットを使用して、1.5 mLチューブ内のプールされた胚に50 μLの核溶解バッファーを加え、変異体グループごとに最低3つの胚を目指します。サンプルを溶解バッファーで氷上に5分間置いておき、30秒ごとにボルテックスします。
  4. 5分間のインキュベーション後、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 P200ピペットを使用して上清を取り除き、ペレットを50 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。再懸濁したら、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  5. 上清を取り除き、40 μL の DPBS-/- に再懸濁します。自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。新しい1.5 mLチューブで、5 μLの核と5 μLのトリパンブルーを混合します。混合物を完全にピペットで動かし、スライドにロードして細胞数と生存率を決定します。
    注:核膜はトリパンブルーを透過します。したがって、単離された核染色はトリパンブルーに対して陽性です。自動セルカウンターでは、死細胞の割合を使用して、単離された核の割合を推定します(図5A)。
  6. 無傷の核の割合が90%より大きい場合(つまり、核の少なくとも90%がトリパンブルーで染色され、丸みを帯びた形状と隆起した様相を示す;図5B、Cを参照されたい; 図5B、Cを参照)、マイクロ流体チップの利用に進み、マイクロ流体チップメーカー11からのプロトコルに従う。

6. シングルセルパーテーション(cDNA増幅、ライブラリー構築を含む)

  1. 最適な結果を得るためには、マイクロ流体チップメーカーのプロトコル11 に従って、シングルセルRNAシーケンシングプロトコルを直ちに進めてください。ターゲットセルの回収率を6000セル以上に設定します。

7. シーケンシング

  1. ライブラリを構築した後、自動電気泳動アナライザーを使用してサンプルのフラグメントサイズ分布と濃度を測定します。
    注:最適なフラグメントサイズ分布は300〜1000 bpです。
  2. サンプルをシーケンサーにロードする準備が整いました。異なるサンプルのライブラリを一緒にプールします。プールされたライブラリの最終的なローディング濃度は、総容量24 μLで750 pMです。シーケンシングメーカーのプロトコル12に従って、プールされたライブラリを試薬カートリッジにロードします。
  3. 事前に組み立てられたフローセルとカートリッジにロードされたライブラリを、ペアエンドのデュアルインデックスを使用して、目的のシーケンシング深度に従ってシーケンスします。マイクロ流体チップメーカーが概説したプロトコルに準拠したシーケンシングリードは、次の通りです11:リード1:28サイクル、i7インデックス:10サイクル、i5インデックス:10サイクル、およびリード2:90サイクル。シーケンシングの完了後、データはバイオインフォマティクス分析を受けます。
  4. バイオインフォマティクスの手法を使用して、品質管理を行います。これには、配列決定された細胞の数、細胞あたりの読み取り数、および細胞ごとにマッピングされた遺伝子の数の評価が含まれます。
    注:最適な結果を得るためには、シーケンシングされた細胞の数は、標的細胞の少なくとも80%です。細胞あたりのリード数は少なくとも30,000であり、検出される遺伝子の数は3000を超えることが推奨されます(マウスサンプルの場合)。

結果

この論文で設計された方法論は、E6.5からE8までのシングルセルオミクス用の胚サンプルの調製を強化することを特に意図しています。この堅牢なパイプラインは、同期した妊娠、胚の分離、即日ジェノタイピング、細胞解離、細胞生存率の評価という5つの主要なステップで構成されています(図1A)。提示されたデータはE7からE7.5までの時点に焦点を当てていますが、手順にわずかなバリエーションがあるE8(図1B)までの胚にも適用できます(プロトコル全体の注を参照)。同期した時限妊娠は、2匹の雌マウスを雄のマウスと一緒にケージに入れることによって達成されました。膣栓は毎朝午前10時前にチェックされ、栓が観察された場合は、その日の正午までにE0.5と見なされました(図2A)。この研究では、プラグの最適な条件として、発情期または発情促進期の雌マウスを、以前の繁殖中に複数のプラグを成功裏に配置した履歴を持つ雄とペアにする必要がありました(図2B)。胚の分離には、明らかなプラグのみが考慮されました(図2C)。

発生時期は、図2Aのタイムテーブルに従って推定した。E7.5では、プラグ検出日の翌日7日目の午後12時に胚解剖が開始されました。図3は、E7.5での胚の単離の成功例です。妊娠中の母を安楽死させた後、子宮角を解剖し、脱落膜の腫れを個別に切開して胚を明らかにし、卵黄嚢をジェノタイピングのために分離しました(図3)。

同日ジェノタイピングは、図4Aのステップに従って、胚単離から3時間以内に行った。胚は、その完全性を維持するために、ジェノタイピングの過程で氷上に保管されました。胚を凍結すると、胚あたりの生存細胞の数が減少するため、凍結しないでください。図4B、Cは、内臓卵黄嚢、頭頂内胚葉嚢、および関連する母体血液を伴う外胎盤円錐を示しています。内臓卵黄嚢をジェノタイピングに利用しました(図4C)。卵黄嚢を消化した後、PCRミックスを調製し、PCR反応を実行しました。次いで、得られたPCR産物をアガロースゲル上で分離した。図4Dは、LoxPおよび野生型対立遺伝子(それぞれ597 bpおよび498 bp)およびCre対立遺伝子(650 bp)の予想されるフラグメントサイズを示しています。図4Eでは、CreおよびLoxP(flox)対立遺伝子を運ぶ育種ペアから得られた6つの胚からの卵黄嚢ジェノタイピングの例が示されている。ゲルは、分析した6つの胚のCreおよびLoxP対立遺伝子のPCR産物を示しています。胚番号2と5番は、2つのflox対立遺伝子と1つのcre対立遺伝子を持っています。したがって、それらは条件付きKO胚と見なされます(図4E、赤い点)。胚1と3は2つのflox対立遺伝子を持っていますが、Creに対して陰性です。したがって、それらはFLOXコントロールと見なされます。胚4には2つのflox対立遺伝子とCre対立遺伝子のかすかなバンドがあり、遺伝子型は「不明瞭」です。この胚は、さらに処理されませんでした(あるいは、実験家は、ジェノタイピングを繰り返すか、Creを発現する細胞を用いた条件付きKOの二次検証を行うことを検討してもよい)。この実験で使用されたCreドライバーは、内臓卵黄嚢15で発現されていないことに注意することが重要です。したがって、LoxP対立遺伝子は、Cre陽性胚と比較して、Cre陽性胚のゲル上でシフトしているようには見えません。

シングルセル実験を成功させるには、細胞数と良好な生存率が必要です。細胞生存率が低い、死細胞の割合が高い、凝集している、または大きな破片がある懸濁液は、さらなる処理には適していません。最適な条件は、マイクロリットルあたり700〜1200個の生細胞と>90%の生存率です。 図5A は、良好な細胞生存率と最適でない細胞生存率の両方を示すパネルを示しています。 図5Bに示すように、同じ基準を核の単離にも適用できます。ただし、トリパンブルーの評価は細胞や核とは異なることに注意することが重要です:生存細胞はトリパンブルーを取り込まないのに対し、生存核は取り込む。細胞/核懸濁液が最適(生存率>90%)の場合は、メーカーの手順に従ってマイクロ流体チップを使用したシングルセル分割を進めてください11。 図5Cに示すように、細胞/核の生存率が60%〜89%の懸濁液に対して、トラブルシューティングオプションが提供されています。細胞の総数に関係なく、生存率が60%を下回った場合は、実験の中止を検討してください。

妊娠中のダムの淘汰から図書館の建設までの全パイプラインは、同じ日に合計8時間かかります(つまり、プロトコルステップ2から6は同じ日に実行する必要があります)。シングルセルメーカーの手順11で概説されている手順に従って、E7胚から得られた細胞を用いたシングルセルRNAシーケンシングのためのライブラリー構造を調製し、細胞生存率は最適でない状態から最適な状態までの範囲であり、2000細胞の推定標的回収率を目指した(図6)。 図6A は、最適でない条件と最適な条件の両方におけるscRNAseqライブラリの代表的なフラグメントサイズ分布を示しており、細胞生存率がシングルセル分割プロセス全体に大きな影響を与えないことを示しています。フラグメントサイズ分布は400〜500bpの範囲でした。これは、最適でない条件がライブラリ調製のプロセスに影響を与えないことを示しています。 図6B は、成功したシングルセルRNAseq実験と最適でないシングルセルRNAseq実験の両方の結果を示しています。シーケンシング後、サンプルの品質管理チェックが行われ、細胞生存率が最適でない場合、細胞の10%のみが成功裏にシーケンシングされたことが観察されました。対照的に、最適なサンプルはより高い割合を示し、全細胞の91%がシーケンシングされました。これはバーコードプロットによってさらに証明されており、最適でない条件は最適な条件と比較してバックグラウンドノイズが大きいことを示しています。両方の実験でクラスタリング分析が行われ、最適な条件で9つのクラスターと最適でない条件で4つのクラスターが明らかになりました。既知のマーカー3 を用いたクラスターのアノテーションは、E7胚における予想される細胞型、すなわち、胚盤葉上および原始線条を含む(図6B)を明らかにした。最適でない実験では、各クラスターの既知のマーカーに濃縮がなかったため、クラスターアノテーションは不可能でした。このことは、これらの開発段階でデータを適切に表現するために必要な高品質の細胞の重要性を浮き彫りにしています。

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図1:シングルセルRNAシーケンシングのための原腸陥入型マウス全胚の最適化。 (A)原腸陥入胚から高品質の細胞および/または核を得るためのワークフロー概略図。(B)E7からE8への原腸陥入中のマウス胚の代表的な明視野画像と適応スキーム3 。スケールバー:125μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:原腸陥入中の胚分離のための効率的な同期時限妊娠のための戦略。 (A)時限妊娠のパイプラインを示す概略図と、特定の原腸陥入期の分析のためのプラグ検出から胚分離までの時間を説明するタイムテーブル。(B)雌マウスの発情周期の段階の代表的な画像。繁殖に最も受容性の高いフェーズが示されています。(C)膣プラグのチェック方法を示す概略図と、プラグのない膣口、部分プラグ、または胚分離のために考慮すべき適切なプラグの例。膣口は各画像の下に拡大されています。プラグ(膣口の凝固した精液)は、赤い矢印で強調表示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:シングルセルRNAシーケンシングのためのE7.5胚の解剖とジェノタイピング。 E7.5胚を分離し、内臓卵黄嚢を解剖するプロセスの概略図と画像。黄色の矢印は妊娠中の母の子宮を示し、黄色の破線の円は胚の位置の輪郭を示しています。破線は、解剖中に切断された領域を表します。「M」は中間体末端を示し、「AM」は反中間体末端を示します。ステレオスコープ画像のスケールバーは400μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:原腸陥入マウス胚からの卵黄嚢の同日ジェノタイピング (A)卵黄嚢の同日ジェノタイピングのワークフロー概略図。(B)頭頂内胚葉嚢と外胎盤円錐体と関連する母体血液の代表的な画像。(C)破線で強調表示されたE7.5胚の内臓卵黄嚢。スケールバー:200 μm. (D) 野生型(+/+)、ヘテロ接合型(Flox/+)、ホモ接合型flox(Flox/Flox)、およびCreジェノタイピング(Mesp1cre15)の代表的なゲルと観察されたDNA断片サイズ。(E)6つの胚(1〜6)の卵黄嚢からのCreおよびflox対立遺伝子の同日ジェノタイピング結果が提供されます。flox/flox と Cre 陰性 (-) ジェノタイピングの 2 つの胚は flox コントロール (青い点) であり、flox/flox と Cre 陽性 (+) のジェノタイピングを持つ胚は条件付き KO (赤い点) です。胚4は、かすかなCreバンド(flox/floxおよびCre-unclear)のために最適ではなく、したがって、さらなる処理から除外されます。同じ遺伝子型の胚をプールし、シングルセルRNAシーケンシングのためにプロセシングします。卵黄嚢中のCre対立遺伝子の存在は、使用されるCre(Mesp1cre)が卵黄嚢で発現されないため、floxバンドのサイズに影響を与えないことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:細胞の品質と核の生存率の評価 (A)E7.5胚からの最適な細胞生存率条件と最適でない細胞生存率条件の代表的な画像。(B)E8胚からの最適および準最適の核生存率条件の代表的な画像 (C)単一細胞分割を開始する前に、細胞の生存率を向上させるのに役立つ可能性のある解決策を示すトラブルシューティングスキーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:E7マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング (A)E7マウス胚からのシングルセルRNAシーケンシングライブラリのフラグメントサイズ分布の代表的なトレースで、細胞生存率の最適条件と最適条件の両方について、メインピークが400-500 bp付近。これらの条件間でトレースは類似しており、細胞生存率がライブラリの品質管理に影響を与えないことを示しています。(B)E7マウス胚の単一細胞RNAシーケンシング結果を、最適でない条件と最適な条件の両方で解析し、観察されたターゲット回収率、バーコードランキング、およびUMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)分布による細胞タイプのクラスタリングを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

溶解バッファー
試薬名ストック濃度最終濃度総容量 1 mL
トリス-HCL (Ph7)1メートル10 mM10 μL
NaClの5メートル10 mM2 μL
MgCl20.1メートル3メートル3 μL
Tween-20 (トゥイーン 20)20%0.10%5 μL
ノンディードP4010%0.10%10 μL
ジジトニン5%0.01%2 μL
DTTの1メートル1 mM1 μL
RNase阻害剤40 U/μL1 U/μL25μL
ヌクレアーゼフリー水----924μL
ウォッシュバッファー
試薬名ストック濃度最終濃度総容量 1 mL
PBSのBSA10%1%100μL
PBSの----900μL

表1:核単離溶解バッファーおよび洗浄バッファーの組成。

ディスカッション

この論文では、原腸陥入マウス胚から高品質の単一細胞および核懸濁液を得るための堅牢なパイプラインが紹介されており、特に初期発生における細胞運命の特異性メカニズムの研究を促進するために設計されています。この方法は、性別や体細胞遺伝子などの遺伝子型を必要とする胚の解析を最適化することにより、原腸陥入の分野における重大なギャップに対処します。このパイプラインは、遺伝子突然変異マウスモデルを利用し、マウス胚全体に対して高解像度のシングルセルシーケンシングを採用することにより、初期のマウス原腸の遺伝子発現プロファイルの理解を深めることができます。この方法は、Creリコンビナーゼシステムによる遺伝子変異マウスモデルを使用して、シングルセルオミクスの初期発生時点で高品質の細胞と核を得ることの実現可能性を示しています。この方法は、何度も試行を重ねて進化してきましたが、その間、サンプルはライブラリの調製とシーケンシングに必要な品質基準を満たしていませんでした。説明された方法論は、(1)胚の数を増やすための同期した時限妊娠、(2)凍結/融解を回避するための即日ジェノタイピング、(3)死にかけている細胞のシーケンシングを回避するための細胞/核の生存率の評価という3つの重要なステップの最適化を通じて、E8より若い胚から十分な細胞/核を生成します。このプロトコルは、シングルセルRNASeqで良好な結果をもたらしますが、このプロトコルで得られた細胞または核懸濁液は、細胞生存率が制限要因である他のシーケンシングプラットフォーム(smart-seq、drop-seq、cel-seq16など)で処理できます。

E7胚では、細胞の数は株や変異体の遺伝子型によって異なります。通常、E7胚は数百から数千の細胞に及ぶことがあり、目的の遺伝子型の胚を得ることは困難であり、基準を満たすのは妊娠中の母体ごとに1つまたは2つしかありません。このプロトコルにより、E7胚あたり約300個の生細胞を捕捉し、シングルセル解析を行うことができます。妊娠中の母動物から採取した胚を異なる日に急速冷凍することで胚プールのサイズを大きくする試みは、融解後に凍結保存剤を添加しても細胞の生存能力が著しく損なわれたため、失敗に終わった。この課題に対処するために、妊娠中の母犬の繁殖戦略と同期が最適化されました。複数の分離の可能性を高めるために、繁殖前に1〜2回出産した雌マウスを分離に使用することをお勧めします。女性の発情周期を監視することは非常に重要です。交配は、発情前期と発情期に発生する可能性が高くなります。繁殖に問題が発生した場合、プラグが生成されない場合は、4日後に繁殖パートナーを切り替えることも役立ちます。

この方法には制限があることに注意することが重要です:観察されたプラグに依存しており、プラグが観察されたとしても、妊娠を保証するものではなく、性行為を示すだけです。したがって、1日に観察されるプラグの数を増やすと、1日に複数の妊娠した母を持つ可能性が高くなり、遺伝子型が陽性になる可能性が高くなります。このプロトコルは、原腸陥入中の概念実証として、E7 から E7.75 までの胚期を使用することの実現可能性を実証しました。ただし、このパイプラインはE6.5からE8胚に適用できます。E6.5胚の場合、プールする目的の遺伝子型を持つ少なくとも7つの胚を得るために、同期妊娠の数を増やすことをお勧めします。代わりに、E8胚については、各胚の解離に使用されるトリプシンの量を20μLではなく~40μLに増やします。目標は、分配を進める前に、1μlあたり700〜1200細胞の濃度範囲で細胞/核懸濁液を得ることです。

良好な細胞生存率を持つことは、シングルセルシーケンシングの成功に不可欠です。製造業者によって提供されたマイクロ流体チップ設計では、単一細胞は、既知のバーコード化されたゲルビーズ11を含むチップ内のゲルビーズインエマルジョン(GEM)に分割される。ただし、このプロセスの顕著な制限は、高品質の単一細胞と低品質の単一細胞の両方を分割できることです。十分な数の生細胞(すなわち、1000細胞/μL)であっても、懸濁液の生存率が低い場合(すなわち、1000個の細胞が生きていて、1000個の細胞が死んでいるため、生存率は50%)、シーケンシング実験は失敗する可能性があります。最適な結果を得るには、約90%の生存率を目指すことをお勧めします。細胞の生存率が約60%〜89%の間にある場合、実験の生存率を高めるための特定の対策を講じることができます。ただし、細胞生存率が60%未満の場合は、実験を続行しないことを強くお勧めします。これは、死にかけている細胞が分配ゲルに「捕捉」され、その後のライブラリ調製と品質管理が目立った問題なしに通過するためです。しかし、実際のシーケンシング実験では、ほとんどのシーケンシングリードがミトコンドリア、リボソーム、またはアポトーシス遺伝子をマッピングし、最初から細胞生存率の低下の兆候を示しているため、完全に失敗する可能性があります。この論文で紹介されているデータは、高品質の細胞を持つ原腸陥入型マウス胚のシングルセルシーケンシングのパイプラインを示しています。この方法論は、開発中の多くの異なる遺伝子変異マウスモデルの理解に適用することができます。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

Fox Chase Cancer CenterのGenomics Coreと、Dr. Johnathan Whetstineの研究室メンバーであるZach Gray氏、Madison Honer氏、Benjamin Ferman氏には、シーケンシング実験の技術サポートに感謝いたします。私たちは、Estaras博士と、シングルセル研究の初期分析に貢献したローテーション大学院生のAlex Morrisの研究室メンバーに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01HD106969およびConchi EstarasへのR56HL163146によって資金提供されています。さらに、エリザベス・エイブラハムは、T32トレーニング助成金5T32HL091804-12の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 cmシャーレジェネシーサイエンティフィック25-202
1000 & マイクロ;L リーチ バリア チップジェネシー サイエンティフィック23-430
20 & マイクロ;Lリーチバリアチップジェネシーサイエンティフィック24-404
300 µLリーチバリアチップジェネシーサイエンティフィック24-415
37 µm リバーシブルストレーナー、小さな幹細胞27215
6 cm ペトリ皿ジェネシー・サイエンティフィック25-260
8ストリップPCRチューブジェネシー・サイエンティフィック27-125U
アガロースアペックス・バイオリサーチ 製品20-102
ベンチマーク・サイエンティフィック BSH300 MyBlock ミニ・ドライバスジェネシー31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle 冷蔵微量遠心分離機Genesee33-759R
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA2153
Chromium Controller10XPN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogen
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 ReagentsAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR 卵黄嚢Viagen201-Y
ジチオスレイトール (DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF鉗子ファインサイエンスツール11252-00
エタノールKoptecV1401
EVOS M7000イメージングシステムInvitrogenAMF7000
ファインハサミ-シャープファインサイエンスツール14060-11
GoTaq G2グリーンマスターミックスプロメガM7823
フ鉗子ファインサイエンスツール11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
ニコン SMZ 1000 実体顕微鏡ニコン
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
ヌクレアーゼフリー 水GenClone25-511
光学管 8x ストリップ (401428)Agilent401428
光学管キャップ 8x ストリップ (401425)Agilent401425
ポセイドン 31-511、HS24 微量遠心分離機、1.5/2.0 mL ローター 24 個、遠心分離機/単位1 個 ジェネシー31-511
プロテイナーゼ KSigma-AldrichP6556
量子ビット dsDNA 定量アッセイキットInvitrogenQ32851
量子ビット Flex 3Invitrogen
RNase 阻害剤フィッシャー・サイエンティフィック12-141-368
標準パターン鉗子ファインサイエンスツール11000-12
テープステーションローディングのヒントアジレント5067-5598
テープステーション4150ジレントG2992AA
トリスHCL(Ph7)品質生物学的351-007-101
パンブルーステイン0.4%セロモフィッシャーサイエンティフィックT10282
トライプルエクスプレスGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vortex ミキサー IKA MS3 96 ウェルサンプルプレートアダプターIKA3617000
AMQAX2000グレーアトリ付き

参考文献

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