Histoflow Cytometryによるハイパラメーター組織像の生成と解析

サマリー

ここで説明するのは、免疫蛍光顕微鏡法により5つ以上の蛍光パラメータを画像化するために使用できる方法である。これらの画像から単一細胞を抽出し、フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を通じて単一細胞解析を実施するための解析パイプラインについて概説し、これにより組織切片の細胞サブセットを同定することができます。

要約

中枢神経系(CNS)に由来する組織切片などの免疫細胞の多様性を調査するための組織学の使用は、一度に画像化できる蛍光パラメータの数によって非常に制限されます。ほとんどの免疫細胞サブセットは、タンパク質マーカーの複雑な組み合わせを使用してフローサイトメトリーを使用して定義されており、最終的に同定するには4つ以上のパラメーターが必要になることが多く、これは従来のほとんどの顕微鏡の能力を超えています。フローサイトメトリーは組織を解離し、空間情報を失うため、複雑な細胞タイプの役割を調査しながら空間情報を保持できる技術が求められています。ここでは、スペクトル的に重なり合う蛍光色素のシグナルを収集し、スペクトルアンミキシングを使用して個々の蛍光色素分子のシグナルを分離することで、イメージングできる蛍光パラメーターの数を増やす方法を作成することで、これらの問題に対処します。次に、これらの画像を解析パイプラインを使用して処理し、ハイパラメーターの組織像を撮影し、これらの画像から単一細胞を抽出して、各細胞のユニークな蛍光特性を単一細胞レベルで分析できるようにします。フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を使用して、細胞をサブセットにプロファイリングし、組織学セクションにマッピングして、その存在量を定量化するだけでなく、組織環境とどのように相互作用するかを確立することができます。全体として、組織学切片の複雑な免疫集団を研究するためにヒストフローサイトメトリーを使用することの単純さと可能性が実証されています。

概要

免疫系の細胞とグリア細胞によって引き起こされる炎症は、各集団^{が他の1,2,3}の活性を促進することができるCNSの慢性障害に寄与する可能性があります。免疫系がCNSのこれらの要素とどのように相互作用してCNSの炎症を促進するかを理解することは、現在主要な関心事であり、シングルセルRNAシーケンシングなどのハイパラメーター技術によって大幅に促進されています。シングルセルRNAシーケンシングを通じて、いくつかのCNS疾患において、グリア細胞と免疫系との間に広範なコミュニケーションが起こっていることを発見しました^4,5,6。これらの相互作用がこれらの疾患にどのように影響しているかを理解することは、これらの疾患の生物学を解明するために非常に重要です。

シングルセルシーケンシング解析の問題点の1つは、これらの技術では、シングルセルまたは核を得るために組織を破壊する必要があり、その結果、空間情報が完全に失われることです。細胞が組織内のどこに存在するかを知ることは、炎症を引き起こす細胞の役割を理解するために重要です。例えば....

プロトコル

このプロトコルは、組織学のための切片組織を対象としていません。組織学のための組織切片の作り方の説明については、Jain et ^al.18 または¹⁹ を参照してください。このプロトコールは、スライドガラス上の任意の切片組織に使用できます。この記事では、前に説明したように、免疫化された動物から分離された鼠径リンパ節を使用します¹⁸。このプロトコルの手順とタイムラインを 図 1 にまとめます。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 組織切片の染色

注:研究者が関心のあるすべての抗体標識で組織を染色することに加えて、研究者は、隣接するまたはそれ以外の同一の組織スライド上に単一カラーコントロール(使用を意図した蛍光パラメータごとに1つ)も調製する必要があります。そこでは、各単一カラーコントロールが1つの蛍光パラメータのシグナルを生成するために必要な試薬で染色されます。

1. PermおよびブロッキングバッファーおよびPermおよび染色バッファーを調製します(組成については 表1 ....

結果

図1:Histoflowサイトメトリーのワークフロー。 組織切片は、スペクトル的に重なり合う色素で染色されます(ステップ1)。画像は、蛍光色素間のスペクトルブリードスルーを最小限に抑えるために、調整可能なバンドパスフィルターと組み合わせた個々の励起レーザーで収集されます(ステップ2)。チャンネル間のスペクトルブリードスルーは、単色染色組織コントロールを使用して生成されたコンペンセーションマトリックスに基づいて補正されます(ステップ3)。次に、画像中の核と細胞をilastikを使用して同定し(ステップ4)、ソフトウェア3で単一細胞に分割します(ステップ5)。ソフトウェア3からソフトウェア4にすべてのデータをエクスポートする前に、フローサイトメトリー解析を行うために追加のパラメータが組み込まれてい.......

ディスカッション

ここでは、以前に検証された技術である組織流サイトメトリーの使用について説明します¹⁸。スペクトル的に重なり合う色素で組織切片を染色すると、スペクトル補償を使用してチャネルをまたいだブリードスルーを除去できるため、従来の方法よりも多くの蛍光パラメータが明確に分離されることが実証されています。従来の方法ではハイパラメータの組織像の解析が難しいため、これらの画像から個々の細胞をセグメント化するための解析パイプラインが提供されています。これらの個々の細胞から蛍光シグネチャーをエクスポートすることにより、フローサイトメトリーで行われるようなシングルセル解析を組織像にも同様に適用できることが実証されています。フローサイトメトリーには空間解析は含まれていませんが、組織切片にゲーティング戦略によって同定された集団をマッピングし、その空間的局在を評価できることが実証されています。全体として、ヒストフローサイトメトリーはフローサイトメトリーと組織学の長所を兼ね備えていることが実証されています。

ヒストフローサイトメトリーには空間情報を保持する利点がありま.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100% エタノール	Σ	676829-1L
4% PFA	電子顕微鏡科学	157-4
アナコンダ	N/	A N/A
ウシ血清アルブミン	Σ	A4503-50G
冷たい魚の汚れゼラチン	Sigma	G7765
Imaris.ipynb スクリプト	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Convert
FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey
anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch からのマルチチャネルデータ	712-605-153	1:300 濃度
ロバ 抗ラット DyLight 405	ジャクソン免疫研究	712-475-153	1:200 濃度
ドンキー血清	ジャクソン免疫研究	017-000-001
F(ab')2-ヤギ抗マウス IgG PerCP-eFluor 710	サーモフィッシャー	46-4010-82	1:25 濃度
フィジー	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
	FlowJo FlowJo LLC		ソフトウェア 4
蛍光スペクトルビューア
https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
新鮮凍結ヒト扁桃腺切片	amsbio	HF-707
ガラスカバースリップ	VWR	48393 106
ヤギ抗ヒト IgA アレクサフルオア 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 濃度
ヤギ抗ヒト IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 濃度
ヤギ抗ヒト IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 濃度
ヤギ抗ウサギ A546	サーモフィッシャーScientific	A-11035	1:250 濃度
ヤギ 抗ウサギ IgG PE-Alexa Fluor 610	サーモフィッシャー	A-20981	1:250 濃度
馬 血清	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A
Ilastik FIJI プラグイン	N/A	N/A
Imaris ファイルコンバータ	オックスフォード・インスツルメンツ		・ソフトウェア 2
セルモジュール付きイマリス	オックスフォード・インスツルメンツ		・ソフトウェア 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX ライフサイエンスソフトウェア	ライカ		ソフトウェア 1
マウス反ヒト CD20	VWR	CA95024-322	1:40 濃度
マウス反ヒト CD38APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 濃度
正常ヤギ血清	JacksonImmunoResearch	005-000-001
正常マウス血清	JacksonImmunoResearch	015-000-001
正常ウサギ	JacksonImmunoResearch	011-000-001
正常ラット血清	JacksonImmunoResearch	012-000-120
核	イエローAbcam	ab138903	DMSOに2 mg / mlの濃度で溶解し、4°Cで保存します。C 暗闇の
PAPペン	シダーレーン	MU22
PBS	Gibco	10010-023
ウサギ 反ヒト Ki67	アブカム	ab15580	1:500 濃度
ウサギ 抗マウス Iba1	和光	019-19741	1:500 濃度
ラット 反ヒト Blimp1	サーモフィッシャー	14-5963-82	1:40 濃度
ラット抗マウス B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 濃度
ラット抗マウス CD138	Biolegend	142502	1:200 濃度
ラット抗マウス CD3 PE-eFluor 610	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61-0032-82	1:40 濃度
ラット抗マウス CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 濃度
抗マウス CD45allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 濃度
ラット抗マウス IgD PerCP-eFluor 710	サーモフィッシャーサイエンティフィック	46-5993-82	1:50 濃度
SP8 共焦点顕微鏡	ライカ
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	シグマ	P7949-500ml
ウルトラコンプ イード	サーモフィッシャー	01-2222-42

https://www.anaconda.com/download https://www.ilastik.org/ https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin血清 ラット