微小電極を用いた三次元消化管オルガノイドの管腔pHプロファイリング

サマリー

本プロトコルは、管腔内生理学の時空間特性評価のための微小電極を使用したヒト組織由来胃オルガノイドのpH測定について説明しています。

要約

消化管オルガノイドモデルの最適化と詳細な特性評価には、その管腔環境を解析するための高度な方法が必要です。この論文では、マイクロマニピュレータ制御の微小電極を介して、3Dヒト胃オルガノイドの細胞腔内のpHを正確に測定するための再現性の高い方法を紹介します。pH微小電極は市販されており、直径25μmの面取りガラスチップで構成されています。測定では、pH微小電極をマトリゲルに懸濁したオルガノイド(>200 μm)の内腔に進め、参照電極を培養プレート内の周囲の培地に沈めます。

このような微小電極を使用してヒト胃体に由来するオルガノイドをプロファイリングすると、管腔pHが各培養ウェル内で~7.7 ± 0.037と比較的一貫しており、最低15分間の連続測定が得られることが実証されます。一部の大型オルガノイドでは、測定により上皮表面と内腔との間にpH勾配が明らかになり、オルガノイドのpH測定を高い空間分解能で達成できることが示唆されました。以前の研究では、微小電極を使用してオルガノイドの管腔酸素濃度を測定することに成功しており、この方法のオルガノイド分析の多様性が実証されています。要約すると、このプロトコルは、3Dオルガノイド内の複雑な管腔空間の機能特性評価のための重要なツールを説明しています。

概要

オルガノイド(幹細胞に由来する超小型の多細胞構造)は、ヒトの生理学を研究する能力に革命をもたらし、規制環境においても動物モデルに取って代わり始めています¹。2009年に佐藤らが腸管オルガノイドを初めて報告して以来、オルガノイド技術は非常に人気があります²。オルガノイドモデルの細胞組成と機能については、多くの研究が詳細に特徴づけられています3,4,5,6。しかし、これらの3D多細胞構造の管腔空間は、ほとんど未定義のままです^7,8。内腔は、粘膜組織に由来するオルガノイドの中央空洞で、分極した上皮細胞の頂端部分に囲まれています。細胞の分泌と吸収は主に頂端上皮表面で起こるため、オルガノイドの管腔微小環境はこれらの重要な生理学的プロセスによって制御されています。現在使用されているオルガノイドモデルは、細胞シグナル伝達パターン、全体的な幹細胞性、代謝物濃度勾配、および環境条件の変動を示しています⁹。したがって、オルガノイド管腔生理学を理解することは、臓器機能と病理の正確なモデリングに必要です。残念ながら、内腔が比較的アクセスしにくいため、3Dオルガノイド¹⁰の管腔生理学の機能解析が大幅に妨げられます。

pHプロファイルを調べる能力は、体内で最も急なプロトン勾配を持つことで悪名高い胃で特に重要であり、内腔の約1〜3から上皮^11,12,13で中性に近い範囲にあります。胃のpH勾配のミクロスケールの維持に関する理解と、この動的な環境を胃粘膜層全体で再現するオルガノイドモデルの関連性については、依然として大きなギャップがあります。オルガノイドのpH分析における従来のアプローチでは、蛍光または比色指標となるpH感受性色素を使用してきました。McCrackenらは、オルガノイドにSNARF-5F-aレシオメトリックpHインジケーターを管腔注射して、ヒスタミン治療に応答した管腔pHの低下を分析しました。このような色素は培地に組み込むことができるため、pHの非侵襲的なモニタリングをリアルタイムで行うことができます。pH感受性色素は、測定の信頼性と精度の低下に寄与する複雑なキャリブレーションステップを必要とするだけでなく、そのような色素は、目的の微小環境^14,15内の全pH範囲を代表していない可能性のある特定の検出範囲内で動作する傾向があります。しかし、確認実験にはインジケーター色素を使用することは合理的であると考えられる。蛍光オプトードベースのpHセンシングアプローチを使用する光学ナノセンサーも開発されています。しかし、このようなセンシング技術は顕微鏡イメージングを必要とし、また、光退色、光毒性、ならびにイメージングバイアス^16,17の影響を受けやすい。さらに、Brooksらは、その上にオルガノイドをプレーティングすることができる微小電極を含む3Dプリントされたマルチウェルプレートを有する¹⁸。ただし、このアプローチでは、オルガノイド内腔内を直接測定することはできません。

電極ベースのpH測定は、他の方法と比較して精度が向上するだけでなく、リアルタイムのpHモニタリングも実現できます。また、マイクロマニピュレータに搭載されたpH電極は、電極先端の正確な位置を細かく制御できるため、pH測定の空間分解能に優れています。これにより、オルガノイドモデルの解析において可能な限り高い柔軟性と再現性が得られます。ここで使用している電極は、細い白金線を囲む選択的なpHガラスを介してプロトンを拡散させることで作動する小型のpH微小電極です。微小電極は、外部のAg-AgCl参照電極に接続され、次に高インピーダンスのミリボルトメーターに接続されます。同じ溶液に浸されたときの2つの電極先端間の電位は、溶液¹⁹のpHを反映する。このようなマイクロプロファイリングシステムは、バイオフィルム^20,21、プランクトン性藻類²²、ヒト喀痰サンプル²³、さらには間葉系幹細胞スフェロイド²⁴の代謝分析に使用されてきた。私たちの研究室とMurphyらは、これまでにマイクロマニピュレーター制御のO₂微小電極を使用して、オルガノイドの管腔内の酸素濃度を評価してきました。Murphyらは、この方法を数学的モデリングと組み合わせて、スフェロイド内の酸素勾配を明らかにしました。私たちのグループは、組織由来の胃オルガノイドにおいて、周囲の細胞外マトリックスと比較して管腔酸素レベルが低下していることを発見することができました²⁵。

ここでは、球状消化管オルガノイドの管腔pHの手動微小電極プロファイリングの詳細な方法を提供し、複雑な管腔微小環境の生理学的理解を深めることができます。この手法は、マイクロスケールでのpHレベルのリアルタイムかつ高分解能の測定を通じて、オルガノイド生理学の探求に新たな次元を追加すると期待しています。さらに、以下のプロトコルは、様々なタイプのオルガノイドモデルにおけるO₂、N₂O、H₂、NO、H₂S、酸化還元、および温度の分析に容易に適合させることができる。生理学的プロファイリングは、オルガノイド培養条件を最適化して in vivo 環境をよりよく模倣するための貴重なツールとして機能し、生物医学研究におけるオルガノイドモデルの関連性と有用性を高めます。

プロトコル

このプロトコールでは、直径200 μm以上の3Dオルガノイドが必要で、それらは明確な内腔を持ち、人工細胞外マトリックス(ECM、例えば、Matrigel)に埋め込まれています。オルガノイド由来のヒト胃組織は、モンタナ州立大学の治験審査委員会の承認を得て、ボーズマンヘルスで上部内視鏡検査を受ける患者からのインフォームドコンセント(プロトコル#2023-48-FCR、D.B.へ)または全胃またはスリーブ胃切除術の免除標本として、National Disease Research Interchange(プロトコル #DB062615-EX)から取得されました。この研究に使用したオルガノイド系統と通路番号に関する情報を表1に、培地組成を表2に示します。胃腸オルガノイド系統^6,26,27の生成および維持について以前に発表されたプロトコルを参照されたい。

1. pHプロファイリングのためのヒト胃オルガノイドの調製

1. 標準的なプロトコルを使用して胃オルガノイド培養を開始および維持します。オルガノイドをウェルあたり500 μLの拡張培地中の24ウェルプレートに保持します(表2)。Passageは5-7日ごとにオルガノイドラインを確立し、pHプロファイリング実験の準備として35 mmガラス底皿に移しました。
   注:私たちの実験のためのオルガノイド培養物は、上記のように成体組織から得られる胃腺調製物に由来します。コラゲナーゼ組織消化法を使用して、前述の25,28,29のように、これらの腺がECMに懸濁される前にこれらの腺を分離します。
2. 継代1〜15で活発に増殖しているオルガノイド培養物から、直径200〜700μmのオルガノイドを少なくとも100個(約200万細胞)含むウェルを選択し、3.5 mmのペトリ皿に移して増殖させます。
3. プレーティング用のオルガノイドを調製する間(ステップ1.4-1.8)、細胞外マトリックス(ECM)アリコートを氷上で少なくとも45分間解凍します。ゲル化を防ぐために、このプロトコル全体を通してECMを氷上に維持します。細胞培養プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに入れて温めます。
4. ウェルから培地を取り出し、氷冷したPBSを各ECM液滴にピペッティングし、P1000ピペットの先端でゲルを引っ掻いて、胃オルガノイド培養物を回収します。オルガノイドを含むECMフラグメントを含むPBSを15 mLのコニカルチューブにピペットで移します。
5. チューブを200 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。オルガノイドを含むECMフラグメントは、チューブの底に層として見えます。上清を慎重に吸引し、0.25%トリプシン-EDTAを350μLで各チューブにピペットで移し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。チューブを37°Cの水浴で2〜5分間インキュベートします。
6. トリプシン-EDTAとインキュベートした後、ペニシリン/ストレプトマイシンを含む氷冷DMEMを600 μLを各チューブに加え、少なくとも40倍激しくピペットで上下させます。200 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引します。pH測定用の培養物をセットアップするには、細胞ペレットを氷冷した液体ECMにオルガノイドペレットとECMの1:4 v/vの比率で再懸濁してプレーティングします。
7. 各サンプルについて、オルガノイド/オルガノイドフラグメントを含む液体ECM40 μLを、35 mmガラス底皿の直径に沿って細い水平線でプレートします。
   注:ゲルを丸い液滴ではなく一列に並べてプレートに分注すると、培養物を薄くすることで個々のオルガノイドへのアクセスが容易になります。
8. ゲルを15〜30分間重合させます。次に、ゲルの乱れを避けるために、ウェルの端に沿ってピペッティングして、2 mLのオルガノイド増殖培地をプレートに慎重に加えます。
9. メディアは一日おきに交換してください。最低10個のオルガノイドが最小直径400μmまで成長するのに4〜8日かかります。
10. pHプロファイリング実験を進めるには、各培養物に以下の基準を満たすオルガノイドが少なくとも10個含まれていることを確認してください:直径>200 μm、健康な外観(明視野顕微鏡で観察されるオルガノイド内に暗い物質がほとんどまたはまったく見えない)、他のオルガノイドによって過密になっていないこと。

2. 微小電極の開梱と校正

注:マイクロスケール測定を可能にするために、pHセンサーの微小電極に加えて、統合された(したがってかさばる)設計を使用するのではなく、別の参照電極が使用されます。pH微小電極と参照電極はどちらも濡れた状態で保管する必要があります。一度に10分以上空気にさらさないでください。アプリケーションに適したチップサイズを決定します。ここでは、先端径が25μmの電位差pH微小電極を使用しました。

1. 微小電極を保護チューブに入れたまま、先端に損傷がないか目視検査します。
2. 参照電極をコネクタを介してpH電極ケーブルに接続します。次に、マイクロ電極をアンプに接続し、アンプをソフトウェアを使用して接地されたPCにUSBケーブルで接続します(図1A)。
3. 2本の50 mLコニカルチューブ2/3に70%エタノールと脱イオンH₂O(diH₂O)を充填します。微小電極と参照電極をdiH₂Oチューブに入れ、両方の先端が液体に少なくとも1 cm沈んでいるように見えることを確認します。
   注意: 背の高いビーカーは、この手順や同様の手順にも使用できます。
4. 電極を~10分間平衡化させます。
   注:この手順は、このステップで一時停止し、電極がdiH₂Oに保存されるため、後で再開することもできます。
5. 電極が平衡化している間に、コンピューターワークステーションでソフトウェア(赤いアイコン)を開きます。[設定]タブで、微小電極の横にあるボックスがチェックされていること、つまり、ソフトウェアによって正しく接続および認識されていることを確認します。ウィンドウの左上にある[ 実験の開始 ]をクリックし、目的のファイル名と保存先を入力します。 Sensor calibration & experiment settings ウィンドウで、Clear all points をクリックして、新しいキャリブレーションのためにソフトウェアを準備します。
6. 2本の50 mLコニカルチューブ2/3にpH 4.01およびpH 9.21のキャリブレーションバッファーを充填します。保護チューブと参照電極を繊細な実験室用ワイプで静かに拭き取り、乾かします。
7. pH 4.01 バッファーの電極から始めて、既知の pH 値として 4.01 を入力します。mVの読み取り値が安定したら、[ ポイントの追加]を選択します。信号が~380mVで安定していることを確認します。ポイントを追加したら、両方の電極をdiH₂Oに戻し、すすぎ、再度ブロットして乾燥させます。
8. 9.21 バッファで前の手順を繰り返し、信号が安定したら (~83 mV) ポイント を追加します 。微小電極がpH 4.01と9.21の間で直線的に応答することを確認します。したがって、必要なのは2点の検量線だけです。これらのポイント間の結果の線が50〜70 mV / pH単位の負の傾きを持つことを確認します。 [Save & use calibration] をクリックします。
   注意: これで、測定値の記録を開始する準備が整いました³⁰。

3. ヒト胃オルガノイドのpHプロファイリング

注: 次のプロトコルは、右利きのユーザー向けに説明されています。注意: PCがスリープモードに入ると進行中の測定が中断されるため、PCのすべての省電力オプションを無効にしてください。

1. 実体顕微鏡の左側にクランプ付きのリングスタンドを組み立てて、参照電極を保持します。顕微鏡の右側にある重いラボスタンドに取り付けられたマイクロマニピュレーターを配置します(図1A)。
2. 微小電極をベンチに平らに置き、ケースを素早く素早く引き抜くことで、保護ケースから慎重に取り外します。
   注意: 微小電極は非常に壊れやすいため、先端が硬い固体材料に接触しないように注意する必要があります。最良の結果を得るには、ベンチの振動や電極の不要な動きを引き起こす可能性のある機器のない頑丈なベンチトップで測定を実行してください。
3. 微小電極をマイクロマニピュレータに取り付け、顕微鏡の対物レンズや他の部分に当たらずに微小電極が培養皿に向かって進むように、ステレオスコープとマイクロマニピュレータを配置します。
4. オルガノイドを含む培養皿を、プロファイリングする最初のオルガノイドを適切に視覚化するように配置します(図1B)。
5. 参照電極をclに固定しますamp ステレオスコープの左側にあるリングスタンドの。ECMを囲む媒体に静止するように参照電極を配置します。測定の合間にステージが動き回る際にオルガノイドを乱さないように注意してください。
6. (顕微鏡ではなく)培養プレートを直接見て、微小電極の先端を培地に十分に沈めるまで進めます。ソフトウェアの[データロガー]タブで、[開始]ボタン(右を指す単一の三角形)をクリックして記録を開始します。画面の右側にある「キャリブレーション済み」チェックボックスが選択されていることを確認します。
   注意: 次の領域に進む前に、各読み取り値が安定するまで ~10 秒待ちます。
7. ECMに入る前に、電極先端が顕微鏡で見えること、および電極先端が目的の最初のオルガノイドに向かって直線的に前進するように配置されていることを確認してください。オルガノイドと接触することなく、電極をゆっくりとゲル内に進めます。少なくとも 3 つの pH 測定値を記録し、平均を計算します。
8. 微小電極は、表面に垂直な軸に沿って目的の最初のオルガノイドに向かって進むように準備されるように配置します。電極が貫通せずに上皮表面に小さなくぼみを作るようにします(図1C)。
   注:このステップでは、オルガノイドが所定の位置に留まるかどうか、またはECM内でより自由に動き回ることができるかどうかについての洞察も得られます。
9. 1回の素早い動きで、微小電極をオルガノイドに進めます。オルガノイドが微小電極の周りを移動したり遠ざかったりする場合は、少し角度を変えてみるか、別のオルガノイドまたは皿のカバーガラス底を囲むプラスチックの縁にオルガノイドを戻します。各実験条件について、10種類のオルガノイドの管腔pH(3回)を測定します。測定値の記録が終了したら、四角い停止ボタンをクリックします。
   注意:オルガノイドの直径を推定して、電極をオルガノイド内腔にどれだけ進めるかを決定し、電極を貫通しないように注意してください。精度を向上させるには、顕微鏡のカメラソフトウェア(利用可能な場合)で直径を測定します。注:1回または複数回の測定後に微小電極の先端が破片で著しく覆われるようになった場合は、細胞解離溶液、PBS、EtOH、次にdiH₂Oで微小電極を洗浄してから続行してください。

4. 電動プロファイリング (オプション)

(注)このオプションには、機械式モータステージに取り付けられたマイクロマニピュレータが必要であり、これは最終的にモータコントローラ³¹を介してコンピュータソフトウェアによって制御される。

1. プロファイリング ソフトウェア (茶色のアイコン) を開き、[プロファイリング] タブで新しい実験を開始します。
2. Z軸の設定は、モーター機器が正しく接続されていると、 モーター を自動的に認識します。
   注:x方向とy方向への移動は、この設定でも手動で制御されます。
3. [プロファイル]インタラクションタブ³⁰を見つけます。開始する前に、顕微鏡の接眼レンズを見るようにすばやく移行して、目的の距離でオルガノイドが入ることを確認してください。[プロファイル設定] に移動し、次の操作を行います。
   1. 開始距離が0μmであることを示します。
      注意:上皮殻が特定のオルガノイドに対して特に硬い場合、オルガノイドは貫通するのではなく、押しのけられたり変形したりすることがあります。押す場合は、電極を前進させ続けますが、ソフトウェアは自動的に記録できないため、入力が発生するポイントに注意してください。
   2. プロファイルするオルガノイドのサイズを判断し、オルガノイドの推定直径の3/4以下の 端点 距離を示します。
      注意: この特定のステップは、電極チップの損傷を防ぐように設計されています。
   3. 目的の ステップサイズ( 図2Eに示すように100 μm)を示します。最小ステップサイズが電極チップのサイズと一致していることを確認してください(たとえば、pH-25 μmの電極チップが25 μmの場合は25 μm)。
   4. モーターが電極チップをプロファイル間で返す 安全な 位置を示します。
      注:これは、手動マイクロマニピュレーターを使用してセンサーをx方向とy方向に安全に移動できるサンプル上(オルガノイドの外側)の快適な高さである必要があります。 センサーの角度 はデフォルト設定のままにします。
   5. 電極を平衡化させるには、 測定前に待機する前に少なくとも3秒を示します。
   6. 測定期間を少なくとも1秒に設定します。この期間の測定値は平均化されます。
      注意: 電気ノイズの多い環境で測定を行う場合は、より長い期間を示すと役立つ場合があります。
   7. [Delay between(s)] を 1 秒以上に設定します。
   8. 各深さで測定する Replicate の優先数を設定します。
   9. Startボタンを押して測定値の記録を開始します。

5. 電極の洗浄

1. 清掃する電極を保護チューブに戻します。
2. 測定後、電極をdiH₂Oで洗い流します。
3. 電極を70%エタノールで数分間洗い流します。
4. 電極をpH 4.01の緩衝液ですすいでください。
5. 測定を進める前に、電極をdiH₂Oでもう一度すすいでください。

6. 電極の保管

注意: 両方の電極は、偶発的な損傷から安全に、放射能の低い場所に室温で保管する必要があります。

1. pH微小電極を使用した後、慎重に水平にスライドさせて保護チューブに戻します(水平支持のためにラボベンチに沿ってスライドさせます)。
2. 微小電極を直立させ(先端を上に向け)、保護チューブに滅菌水を静かに満たします。電極に付属のストッパーで保護チューブを差し込みます。保護チューブの穴が電気テープで塞がれていることを確認してください。飛散防止の箱に保管しておいて、次回の使用までお使いください。
   注意: 電極が入っていた元の箱には、保管時に電極を所定の位置に保持するように設計された保護インサートが含まれているため、使用することをお勧めします。
3. 参照電極は、3M KCl溶液で満たされたビーカーまたはメスシリンダーに保管します。ビーカー/メスシリンダーをパラフィルムで覆い、溶液の蒸発を防ぎます。
   注意: メスシリンダーを使用する場合は、偶発的な動きを防ぐために、テープでラボベンチに固定することをお勧めします。

7.メチルレッドインジェクション(オプション)

注:メチルレッドは、微小電極の測定を検証するために使用できる比色インジケーター色素です。

1. 2 μL のガラスキャピラリーに滅菌鉱物油を埋め戻し、マイクロマニピュレーター制御の nL オートインジェクターにロードし、続いて 0.02% の赤色メチルと 150 mM HCl を含む溶液で満たします。
   注:溶液は、HClの酸性度により、毛細血管内では赤/ピンクに見えるはずです。
2. 直径300μm以上のオルガノイドに9.2μLの溶液を注入します²⁵。
3. 実体顕微鏡に適合したカメラを使用して画像またはビデオをキャプチャします(図2G)。

結果

酸の分泌は、人間の胃の重要な機能です。しかし、オルガノイドで酸分泌をどの程度モデル化できるかは、まだ議論の余地があります6,32,33,34。したがって、胃オルガノイドの酸産生を正確に測定するために、上記のプロトコルを開発しました。特に、数回継代した標準的な増殖条件下で培養した非刺激の成体幹細胞由来オルガノイドを使用したため、壁細胞の喪失につながった³⁵。したがって、酸分泌性壁細胞の存在と活性酸放出は、私たちのモデルシステムでは予想されませんでした。

実験では、ガラス底の皿に直径200μmから1,000μmのオルガノイドを播種しました。まず、微小電極の2つの異なるチップサイズ(チップ径25μmのpH-25とチップ径50μmのpH-50)を試験しました。 図2Aに示すように、小さい方の先端と大きい方の先端で得られた測定値の間には有意差はありませんでした。興味深いことに、オルガノイドのベースラインpHは、~pH 8でわずかにアルカリ性になる傾向がありました。次に、25 μm pH-25チップを使用して、同じ培養プレート上に保持された異なる10個のオルガノイド内の管腔pHの変動を評価し、各オルガノイドから3つの測定値を取得しました(図2B)。1枚のプレート内で、個々のオルガノイドの管腔pHは、わずかな有意でない変動(8.16 ± 0.12;p ≥0.0445-0.99)のみを示しました(図2B)。また、3 から 16 までの継代を持つ 5 つの異なるオルガノイド系統内の管腔内 pH 測定値も比較しました(図 2C)。ここでも、各培養物内で一貫したpH測定値が得られましたが、オルガノイドライン間では大きなばらつきがありました。しかし、管腔のpHは一般にpH 7.3とpH 8.2の間にとどまり、1桁以内であり、早い通過数と遅い通過数を比較すると、平均pHの明らかな傾向はありませんでした(図2C)。次に、オルガノイド内腔のpHがオルガノイド増殖培地および細胞外マトリックス(ECM)のpHに直接関係しているかどうかを調べました。培地、オルガノイドを囲むECM、およびオルガノイド内腔を比較すると、pHに大きな違いが見られ、オルガノイドの管腔pHはECMの管腔pHよりも低く、ECMのpHは周囲のオルガノイド増殖培地のpHよりも低く、オルガノイドの管腔pHは培養環境によって直接決定されるのではなく、生理学的に関連性があることが示唆されました。6つの独立した実験で、7.13±0.09と中性に近い管腔の平均pHを測定しました。

電動マイクロマニピュレーターを使用して、オルガノイド内腔のpH測定値をより高い空間分解能で取得しました。このアプローチは、粘液で満たされたオルガノイド内腔²⁹ 内のpHまたはその他の勾配を記録する必要がある場合に関連します。 図2E は、大型オルガノイド(直径>1,000 μm)における2つの代表的な一連のpH測定を示しており、各オルガノイドへのエントリーポイントと~800 μmの深さで終了することを示しています。プロファイルされた2つのオルガノイドの直径は同じではなかったため、測定値はすぐには比較できません。いずれにせよ、上皮表面とより深いオルガノイド内腔との間には、Δ0.6のわずかなpH勾配の証拠が示されています(図2E)。オルガノイドのpH測定を経時的に実施し、治療反応をリアルタイムで測定できるようにする可能性を判断するために、代表的なオルガノイド内の管腔内pHを約20分間記録したところ、最初の適応期間後も測定値が非常に一貫していることがわかりました(図2F)。).独立した方法で管腔のpH測定を検証するために、pH感受性比色色素(メチルレッド)を使用し、マイクロマニピュレーターに取り付けられたナノリットルオートインジェクター(図2G)を使用してオルガノイド内腔に注入しました。色素の黄色の着色により、オルガノイド内腔のpHが>6.2であることが確認され、これはほぼ中性のpHを示した微小電極測定値と一致していました。全体として、これらの代表的な結果は、オルガノイド培養における微小電極ベースのpH測定の実現可能性と再現性を示しています。

図1:方法の概要(A)プロファイリング設定の概略図。図1Aの微小電極は、UnisenseのWebサイトから取得しました。³⁶ (B) プロファイリングの準備ができているオルガノイド培養、周囲のECM、および周囲の培地の代表的な画像 (スケールバー = 5 mm)。(C)オルガノイドプロービングの準備における微小電極の正しい位置決めの例(スケールバー= 500μm)。略語:ECM = 細胞外マトリックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ヒト胃オルガノイドにおけるマイクロセンサープロファイリングの検証 (A)25 μm(pH-25)と50 μm(pH-50)の微小電極チップを使用したミッドルーメンpH測定の比較。10 の個々のオルガノイドからのデータで、それぞれが 1 つの代表的な実験から得られたものです。(B)10の個々のオルガノイドについて、3回の反復pH測定が得られました。多重比較による一元配置分散分析 (p = 0.1229)。(C)pH-25電極で得られたpH測定値は、異なるパッセージ番号で分析された5つのオルガノイドラインのそれぞれで一貫しています。4-10オルガノイドは、サイズと可用性に基づいてラインごとに測定されます。多重比較による一元配置分散分析 (p < 0.0001)。(D)胃オルガノイドおよび周囲のマトリゲルおよび培地内のpH測定(n = 6つの独立した実験)。pH-25で胃上皮オルガノイドを貫通することによって得られる測定値。各データポイントは、1つのオルガノイド内の10回の個別のpH測定の平均です。一元配置分散分析 (p < 0.0001)。(E)電動マイクロマニピュレーターを使用した2つの代表的なオルガノイドの上皮から内腔へのpHプロファイル。(F)1つの代表的なオルガノイドにおける経時的なpHの安定性(~19.8分)。(G)メチルレッドpH指示色素とHClを胃オルガノイド内腔にマイクロインジェクションします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

			寄贈者
像	線	通路	性	年齢	エスニシティ
2Aの	35	6	F	40	B
2Bの	7	15	F	26	B
	7	4	F	26	B
	1	16	F	45	C
	34	3	F	44	不明
	35	6	F	40	B
2C	7	15	F	26	B
2Dの	36	1	不明
	7	5	F	26	B
	37	1	不明
	31	3	F	45	H
	7	9	F	26	B
	7	4	F	26	B
2E	10	15	F	43	不明
2階	34	3	F	33	C
2Gの	7	5	F	26	B

テーブル 1.

ヒト胃オルガノイド拡張培地(L-WRN)
L-WRNコンディション媒体	50%
アドバンスドDMEM/F12	37%
ウシ胎児血清	10%
ペニシリン/ストレプトマイシン	1%
L-グルタミン	1%
ゲンタマイシン	0.10%
アムホテリシンB	0.10%
HEPESバッファー	0.40%
Y-27632	0.10%
SB-431542	0.10%

テーブル2.

補足図S1:ヒト胃オルガノイドにおけるイオントランスポーターの発現。 相対コピー数は18S rRNAに正規化されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:pHマイクロセンサープローブによる穿刺後に構造が変形したヒト胃オルガノイド。 スケールバー = 1 mm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオS1:胃オルガノイド培養でのプロファイリングの試みの失敗。 pH 25 μmの微小電極を、目的のオルガノイドに向かって手動で進めます。角度の誤判定による試みが失敗した後、別の角度が試みられ、オルガノイドがプロファイルされるべき構造的完全性を欠いていることが明らかになりました(球形構造は頑丈ではなく、電極を貫通すると変形します)。その後、ユーザーは別のオルガノイドを試みるようにリダイレクトします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

オルガノイドの管腔へのアクセスが限られているため、この微小環境の生理学的ダイナミクスの理解は著しく制限されています。管腔生理学の機能解析のための信頼性の高いツールにより、生理学、薬理学、疾患研究のためのin vitroモデルとしてオルガノイドを活用する能力が広がります。オルガノイドは、高度に調整可能で生理学的に関連性のあるモデルであり、ヒト集団内の遺伝的多様性を再現する可能性が加わります。オルガノイド内腔内のpH測定のための既存の方法は、pH感受性色素またはナノ粒子を使用しており、多くの場合、蛍光顕微鏡法または分光法16,17,37と組み合わせる必要がある方法である。上述のマイクロセンサーベースのプロファイリング法は、消化管オルガノイドの管腔内pHを新たな空間精度で測定するための新しいルートを提供します。私たちの方法は、消化管オルガノイド管腔 pH の一貫した信頼性の高い測定と、pH 勾配の証拠を示しています。未発表の実験では、重炭酸塩分泌に関与することが知られているSLCファミリー遺伝子SLC4A2および26A7、および陽子交換を担うSLC9A3、9A4、および9A8の発現を確認しました（補足図S1）^38,39,40,41 .私たちの研究は、オルガノイドに重炭酸塩の分泌が優勢で、壁側細胞が不足していることを示唆しており、これがアルカリ性を説明している可能性があります。

使用する微小電極がオルガノイドのマイクロプロファイリングに適していることを確認することが重要です - これには、正しいチップ径の選択も含まれます。25 μm と 50 μm の両方のチップを試し、同様の結果が得られました (図 2A) が、ベベルされたチップ領域全体で測定値が平均化されるため、侵襲性が低く、より高い空間分解能が得られると期待されていたため、メーカーのアドバイスに従って、より小さなチップサイズで進めることにしました。ただし、欠点として、先端が小さいと壊れやすくなります。オルガノイドのサイズは、目的の空間分解能を決定する際に考慮する必要があります。

プロトコールの重要なステップは、オルガノイド管腔内pHとECM内のpH、そしてその後の周囲の培地中のpHを区別する能力を確保することでした。オルガノイド⁴²に出入りする代謝物フラックスの適度な量が期待されます。オルガノイドのpHは環境によって影響を受けると予想され、6つの独立した実験で、オルガノイドは周囲よりも一貫してアルカリ性が低いことがわかりました(図2D)。さらに、プロファイリングでは、センサーのキャリブレーション中と同様に安定性が重要です。

組織由来オルガノイドは、ドナー間である程度のばらつきを示すことが予想されるため、薬物治療などの実験的介入を適用する前に、ベースラインでオルガノイドラインをプロファイリングすることが不可欠である⁴³。私たちは、任意の1つのオルガノイド培養内のpHの変動は、マイクロスケールでの局所的なイオン勾配と、免疫蛍光染色および免疫組織化学的染色によって決定される管腔粘液の不均一な分布によるものである可能性があると仮定しています(未発表のデータ)。個々のオルガノイド系統と継代間で観察されるpHの変動は、オルガノイドの細胞組成と分泌活性の個人差によるものと考えられます。また、一部のオルガノイド系統は、他のオルガノイド系統よりも本質的に貫通しにくいこともわかりました。同様に、電極の挿入時に構造的完全性が失われ、崩壊するものもあります(補足図S2 および 補足ビデオS1)。これはオルガノイドの通過とは関連していないようですが、直径~1.5mmを超えるオルガノイドで最も一般的に観察されています。以前の研究では、オルガノイド内の粘液が不均一に分布していることを示しました²⁹。この不均一性により、粘液の分布が測定に影響を与えたかどうか(またはどの程度影響したか)を判断することが困難になります。

マイクロセンサーは、オルガノイド管腔内生理機能を高速かつ高空間分解能でプロファイリングできる低侵襲ツールです。また、このようなセンサーは化学勾配を乱さず、関心のある微小環境の乱流に対する感度も最小限に抑えられます。センサー電極を基準電極から分離することで、小型設計が可能になり、これら2つの電極を組み合わせたラボ用pHプローブは、より大きなサイズにつながります。細胞内測定用の光学式pHおよびO₂ ナノセンサーは、コロラド鉱山大学のキャッシュグループによって開発され、マウスモデルとバイオフィルムモデルの両方で代謝物を測定することに成功しています。しかし、オルガノイド内腔の不均一性のために、そのようなセンサーは解釈できない結果をもたらす可能性がある¹⁷。McCrackenらは、SNARF-5Fを注入し、リアルタイムの共焦点顕微鏡でpH感受性色素を視覚化することにより、胚性幹細胞由来胃オルガノイドの管腔pHを分析しました³⁷。特に、McCrackenによって報告された測定値は、現在の研究で得られたpH値と非常に類似していました(図2B、C)。我々の技術は、おそらく、バイオフィルムプロファイリングのような垂直的なセットアップで、単層アーキテクチャに適用できるかもしれないが、これは電極⁴⁴を損傷するリスクをもたらすかもしれない。将来の研究では、細胞発生に関連する変化を評価するために、数日間にわたってpHを連続的に測定することも含まれる可能性があります。中型のオルガノイドは一般に、プローブ後に回復して治癒するため、理論的には、培養物の無菌性を維持できる限り、1つのオルガノイドを複数回プローブできます。オルガノイドモデルにおけるpHダイナミクスの理解を深めるにつれ、複雑で歴史的にアクセスできない3D微小環境を正確にマッピングするためには、空間分解能を優先する必要があります。

要約すると、このプロトコルは、マイクロマニピュレータと実体顕微鏡に取り付けられたpH微小電極を使用して、高い時空間分解能でpHを正確に測定するための詳細な方法を提供します。この分析法は、ヒト成体幹細胞由来オルガノイドで検証されており、明確な内腔を持つ直径200 μm以上の上皮オルガノイドに適しています。代替の微小電極を選択することで、この方法を他のタイプのオルガノイドや、NOやO₂などの代替化合物の測定に容易に適応できると期待しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3 M KCl	Unisense
5 mL ぐらつき-血清学的ピペットではない、個別包装、紙/プラスチック、バッグ、滅菌済み	CellTreat	229091B
10 mL ぐらつきなし、紙/プラスチック、バッグ、滅菌済み	CellTreat	229092B
15 mL 遠心分離チューブ - フォームラック、滅菌	済み CellTreat	229412
24ウェル組織培養プレート、滅菌	CellTreat	229124 25
mL ウォブル-ノット血清ピペット、個別包装、紙/プラスチック、バッグ、滅菌	CellTreat	229093B
35 mmディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |ガラス径20 mm |コーティングされていない	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL遠心分離チューブ-フォームラック、滅菌	CellTreat	229422
70%エタノール	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm セルストレーナー、個別包装、滅菌済み	CellTreat	229483
1,000 & マイクロ;L Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
バイオセーフティキャビネット	Nuaire	NU-425-600	クラスIIタイプA/B3
ウシ血清アルブミン	フィッシャーバイオ試薬	BP1605-100
細胞回収溶液	コーニング	354253	細胞解離溶液
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
ダルベッコのイーグルス培地の改変 (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
ウシ胎児血清	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 硫酸塩	コーニング	30-234-CR
ゲンタマイシン硫酸	IBI Scientific	IB02030
HEPES, 遊離酸	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" ラップトップ Intel Core i3	HP	M03840-001
塩酸	フィッシャーScientific	A144C-212
インキュベーター	フィッシャー サイエンティフィ	11676604
iPhone 12 カメラ	アップル
L-グルタミン	Cytiva	SH3003401
大型 Kimberly-Clark プロフェッショナル Kimtech Science Kimwipes 繊細なタスクワイパー、1 層	ッシャー サイエンティフィ	34133
M 205 FA 実体顕微鏡	ライカ
マトリゲル膜マトリックス354234	コーニング	CB-40234
MC-1 UniMotor	コントローラーUnisense
メチルレッド
MM33マイクロマニピュ	レーターMarzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	利き
MS-15電動ステージ
	Drummond	3-000-204	ナノリットルオートインジェクター
ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH 微小電極	Unisense	50-109158、25-203452、25-205272、25-111626、25-109160	SensorTrace ソフトウェアは Apple コンピュータと互換性がありません
参照電極	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace ソフトウェアは互換性がありませんアップルコンピュータ
SB 431542	トクリスバイオサイエンス	16-141-0
スマートフォン カメラアダプター	ゴスキー
仕様 実験室スタンド LS	ユニセンス	LS-009238
トリプシン-EDTA 0.025%、フェノールレッド	ギブコ	25-200-056
ユニアンプ	ユニセンス	11632
ユナイテッドバイオシステムズ株式会社 ミニセルスクレーパー200 / PK	フィ	ッシャーMCS-200
Y-27632二塩酸塩	トクリスバイオサイエンス	12-541-0
&マイクロ;センサ校正キット	Unisense/ メトラー・トレド	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 および 9.21, 20 mL パケット