成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

サマリー

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。

要約

網膜色素上皮細胞(RPE)は、網膜の適切な機能にとって重要です。RPE機能障害は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症などの重要な網膜疾患の病因に関与しています。マウスの成人の目からRPEを分離するための合理化されたアプローチを提示します。これまでに報告された方法とは対照的に、このアプローチにより、成体マウスからの高純度RPEの単離と培養が可能になります。このシンプルで迅速な方法は、広範な技術的スキルを必要とせず、基本的な科学ツールと試薬で達成できます。一次 RPE は、眼の摘出術とそれに続く前眼部の除去により、3 週齢から 14 週齢の C57BL/6 バックグラウンド マウスから単離されます。酵素によるトリプシン処理と遠心分離は、RPEをアイカップから解離して分離するために使用されます。結論として、このアプローチは、網膜機能と疾患の研究におけるRPEの利用のための迅速かつ効果的なプロトコルを提供します。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、光受容体と^脈絡膜の間に位置するブルッフ膜の内側を覆う特殊な細胞単層です1。RPE細胞は、網膜の適切な機能に重要な役割を果たします。RPE細胞は、グルコースとビタミンAを光受容体に輸送し、全トランス網膜の11-cis網膜への再異性化によって視力を促進し、脱落した外側セグメントの食作用を通じて光受容体の外側セグメントを維持し、網膜下空間から水分を除去し、タイトジャンクションの存在を通じて外側の血液網膜バリアを形成し、神経向性成長因子(色素上皮由来因子など)を分泌します。 および基本的な線維芽細胞成長因子)は、光受容体^{をサポートします2}。RPE細胞の機能不全は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症など、さまざまな網膜症の病因に関与しています^3,4,5。RPE細胞を用いたin vitro研究は、これらの疾患の病因の理解を深めるために重要です。RPE細胞株は容易に入手可能ですが、初代RPE細胞の主要な特性を欠いているため、これらの研究には初代RPE細胞が非常に好まれます。

初代RPE細胞の供給源として様々な種が利用されてきたのに対し、マウスには遺伝子改変を利用して網膜症の病因を解明できるという利点があります。げっ歯類からRPE細胞を単離するための前述のプロトコルは、新生児動物の使用を必要とするか、時間がかかるか、技術的なスキルを必要とするか、または培養に適していないかのいずれかである6,7,8,9,10,11,12。私たちは、これらの細胞の高純度培養物を生成する成体マウスからRPE細胞を単離するための簡単で迅速な方法を説明します。

プロトコル

この研究での動物被験者の使用は、ケースウェスタンリザーブ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 試薬の調製

1. ハンク平衡塩溶液(HBSS)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない10 mM HEPES緩衝液を添加して、洗浄緩衝液を調製します。使用するまで溶液を4°Cに保ちます。
2. 4.5 g/L グルコース、1.25x GlutaMAX Supplement (ストック濃度 100x または 200 mM、最終濃度 2.5 mM L-グルタミン) を Dulbecco's Modified Eagle's Medium に 10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) を添加して RPE 培地を調製します。使用する前に、メディアをウォーターバスで37°Cに予熱してください。

2.マウスの眼の抽出

1. IACUCが承認した安楽死の方法(マウスの20 gあたり0.1 mLのケタミン/キシラジンカクテルを使用した麻酔下での子宮頸部脱臼[87.5 mg / kgケタミンと12.5 mg / kgキシラジン]は、この研究で使用された方法でした)。
   注:若いマウスから採取した眼は、時間の経過とともに網膜色素上皮細胞の収量の増加を促進し、連続継代の能力を拡張します。
2. 目を上に向けて、マウスを横向きに平らに置きます。
3. 人差し指と親指をそれぞれ目の上と下に置きます。目の周りの骨構造にやさしく圧力をかけ、眼球の突出を誘導します。
4. 少し開いたはさみの先を目の下に挿入し、目がソケットから離れるまで手首を目から90°ゆっくりと回転させます。
   注:アイカップの解剖がより困難になるため、目や視神経を切るためにハサミを閉じないでください。
5. すぐに眼球を70%エタノールに5秒以内入れて転がしてから、氷上に保持した洗浄緩衝液に移します。
6. 解剖顕微鏡下で、一度に片方の目を、洗浄バッファーと浸したガーゼのストリップで満たされたペトリ皿に移します。
7. ピンセットで視神経を保持して目を安定させます。3.00 mm 45°の外科用ナイフまたは0.009インチのカミソリの刃を使用して、オラセラータのレベルで静かに切開を行います。
8. バンナスのハサミを使用して、ハサミを切開部にそっと挿入し、前部と硝子体が取り外して廃棄できるようになるまで、オラセラータの周囲を切り取ります。
9. つながれた鉗子を使用して、RPE層を乱さないように注意しながら、アイカップから網膜をそっと剥がします。
   注意: 網膜を取り外しやすくするには、トランスファーピペットに洗浄バッファー培地を入れ、アイカップの端に注意深く適用して、網膜を優しく持ち上げます。
10. 最後に、ハサミを使用して視神経と余分な結合組織をアイカップから取り除きます。アイカップに穴を開けないように注意してください。

3. プライマリ RPE の分離

1. アイカップを1 mLの0.25%トリプシン+ 0.02%EDTAを含む1.5 mLの微量遠心チューブに移します。.
   注:トリプシン-EDTAの1つのアリコートに2つのアイカップを追加して、培養可能なRPEの収量を増やすことができます。
2. 微量遠心チューブを37°Cに設定したウォーターバスに移し、10分間インキュベートします。2分ごとにチューブをウォーターバスから取り外し、チューブの底をカウンタートップに40回しっかりとたたきます。
3. 10分後、P1000または2 mLの血清ピペットを使用して、3回以下のピペッティングでアイカップを機械的に穏やかに破壊します。
   注:RPEシートの断片化は、大きなシートが適切に接着しないため、不可欠です。
4. アイカップではなく、切り離したRPEシートを15 mLの円錐管内の0.5 mLのウシ胎児血清(FBS)に重ねて、トリプシンをすぐに中和します。.
5. さらに、FBSおよびRPEシートの層に3mLのRPE培地を滴下してトリプシンを希釈します。
6. RPEを340 x g で3分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、24ウェルプレート(1.9 cm²/ウェル)または48ウェルプレート(0.75 cm²/ウェル)のいずれかに適した量のRPE培地に細胞を再懸濁します。
   注:RPEは、細胞外マトリックスタンパク質、特にラミニン、コラーゲンIV、またはフィブロネクチンでコーティングされたウェルプレートに播種して、接着性を高めることができます¹¹。RPEは、1 mLのRPE培地に再懸濁し、40%密度の分離グラジエントに重ねて、純粋なRPE細胞をさらに単離することもできます。さらに、プレートを340 x g で3〜5分間回転させると、細胞接着が増加する^{可能性がある13}。
8. 37°C、5%CO₂でインキュベートします。

4. RPEの培養

1. 分離されたRPEを少なくとも3日間中断しないでください。72時間後、古いメディアをそっと取り出し、温めた新しいメディアと交換します。
2. 最初の3日後は48時間ごとに培地を交換してください。
3. 細胞がコンフルエントに達したら、0.25%トリプシン+ 0.02%EDTAを使用して細胞を継代し、RPE培地中のFBSを2%に減らします。
   注:一次RPEは、以前に報告されていたが、5〜7回の継代後に脱分化を開始し、それらの六角形の形状と色素沈着を失い始める¹⁴。

結果

記載されたプロトコルは、C57BL/6バックグラウンドマウスで使用されています。性別はRPEを培養する能力を変えるようには見えません。6週未満のマウスは、高齢のマウスと比較してRPEシートの収量が限られており、最適な合流点に到達するにはより多くの目が必要になる場合があります。単離後、RPE細胞が安定して細胞培養プレートに付着するまでに約3日かかります。単離の約24時間後、核形成に見える丸い色素沈着細胞が沈降し始めていますが、プレートに完全には付着していません(図1A)。次の48〜72時間にわたって、細胞は暗い色素沈着と透明な核を維持しながら付着し、広がり始めます(図1B、C)。5日後、RPEはコンフルエント性を高め、六角形の偏光単層を連想させる細胞間接触を形成し始めました(図1D)。

単離されたRPEは、培養6日後に純度およびタイトジャンクションの完全性について評価しました。RPEは、最初に、RPEに特異的なマーカーであるレチノイドイソメロヒドロラーゼまたは網膜色素上皮65 kDAタンパク質(RPE65)の存在について評価されました(図2、緑)。さらに、RPEが色素性細胞と六角形細胞の単層を形成するためには、細胞間接合部が無傷のままでなければなりません。タイトジャンクションタンパク質-1またはゾヌラオクルーデンス-1(ZO-1)は、個々のRPE細胞¹⁴間のタイトジャンクションの維持と完全性に不可欠な足場タンパク質である。コンフルエントに単離されたRPE培養物は、細胞の周辺に見られるZO-1の染色によって実証された細胞間結合タンパク質を維持しました(図2、赤)。これらの細胞が大きなシートでコンフルエントに達すると、最大2週間にわたって過度に増殖することなく、細胞間の接触を維持します。以前の研究では、ZO-1は培養¹⁵で最大9日間高発現することが示されています。一次RPEの培養で使用される追加のマーカーには、コラーゲンIV、CRALBP、およびOTX2が含まれます¹¹。

図 1.標準的なポリスチレン24ウェルプレートで培養したマウス一次RPEの形態。(A)C57BL/6マウスの両眼から単離し、単離直後にノンコート組織培養ポリスチレン24ウェルプレートのシングルウェルで培養した一次RPE。(B,C)48時間後と72時間後、一次RPEがプレートに付着し始め、色素沈着した二核細胞を形成します。(D)5日後、明視野顕微鏡検査では、色素沈着した六角形の細胞がコンフルエント性を高め、細胞間接触を形成し始めていることが示されています。スケールバー:100μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.RPE特異的マーカーRPE-65および細胞間接合マーカーZO-1は、単離された初代マウスRPEに保存されています。 3匹のC57BL/6マウスの一次RPEを6日間培養した後、4%パラホルムアルデヒドで固定しました。細胞をPBS中の0.1% Triton-Xで5分間透過処理し、5%正常ヤギ血清でブロックし、RPE-65(緑)またはZO-1(赤)に対する抗体とインキュベートしました。スケールバー:50μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.網膜色素上皮単離プロトコルの簡略化された概略図。 マウスから眼球を取り出した後、70%エタノールに短時間浸して眼球を滅菌してから、洗浄バッファーに移します。洗浄バッファーで、オラセラータに沿って切断し、前部セグメントを取り除きます。網膜を取り外し、アイカップをトリプシン/ EDTAの入ったチューブに入れます。カウンターのチューブを2分ごとに合計10分間軽くたたき、上清を15mLの円錐形チューブに移し、RPEのペレットを遠心分離します。細胞とプレートを24ウェルまたは48ウェルプレートに再懸濁します。BioRenderを使用して生成されたグラフィック。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、マウスの網膜色素上皮の単離と培養のための簡略化されたプロトコルを概説しました。成体マウスの眼から単離されたRPE細胞は、RPE特異的マーカーRPE65および細胞間接合マーカーZO-1を発現した。さらに、培養細胞は培養中に色素沈着した六角形のシートに成長しました。

げっ歯類におけるRPEの単離のためのいくつかの方法は、以前に発表されている6,7,8,9,10,11,12。多くのプロトコルは、ブルッフ膜からRPE層を剥離し、技術的なスキルを必要とし、RPE損傷または細胞死のリスクを高めます6,7,9,11,12,16。したがって、このプロトコルは、機械的解離ではなく、RPE層の酵素的剥離を利用して、培養中のRPEシートの生存を促進し、完全性を維持します。この方法は、タイトジャンクションタンパク質の発現を保存する高度に色素沈着した六角形の細胞でRPE形態を維持する培養物でマウスRPEをもたらします。さらに、このプロトコルは、透過性膜インサート、追加の細胞外マトリックスコーティングタンパク質、または特殊な組織解離試薬など、他のプロトコルで使用される複雑な試薬または材料の使用を欠いています。代わりに、このプロトコルでは、0.25% トリプシン-EDTA と組織攪拌を組み合わせて、RPE 層をブルッフ膜から解離させる単純な酵素消化を利用します。このプロトコルは、生後3〜14週齢のマウスで成功裏に実施されています。ただし、若いマウスでコンフルエントカルチャーを成功裏に獲得するには、より多くの目が必要になる場合があります。

このプロトコルの実行中に、いくつかの課題が発生する可能性があります。オラセラータの周りを正確に切断し、RPE層を壊さずに網膜を慎重に除去するには、技術的なスキルが必要です。強膜の周囲を切断すると網膜が乱れる可能性があり、RPEの生存率が変わる可能性があります。このテクニックの洗練は、反復的で継続的な練習によってのみ達成できます。さらに、RPEシートは、取り外し後も網膜層に付着したままになる場合があります。RPEの過剰な損失を避けるために、注射器または洗浄緩衝液で満たされたトランスファーピペットを使用して網膜の剥離を刺激し、網膜の端をアイカップから穏やかに持ち上げます。.ヒアルロニダーゼのインキュベーションもまた、分離を促進することができる¹⁶。RPEがブルッフ膜と脈絡膜から適切に剥離しない場合は、ウォーターバスでのトリプシンとのインキュベーション時間を長くします。.さらに、新鮮なトリプシンのアリコートを-20°Cで凍結し、使用直前に解凍して最適な酵素活性を維持します。単離後にRPEがウェルプレートに付着しないのは、細胞の密度が低すぎる場合、または単離プロセス中にRPEが損傷した場合に発生する可能性があります。さらに、私たちのプロトコルでは、培養のために細胞外マトリックス(ECM)タンパク質のコーティングは必要ありません。しかし、フィブロネクチン、コラーゲンIV、ラミニン、またはコラーゲンIなどのECMタンパク質は、細胞の接着を増加させることが示されており、アドヒアランスが不十分な場合は考慮する必要があります¹¹。

RPE培養単分子膜の収量を増やすには、同じ遺伝的背景を持つ年齢一致マウスの少なくとも2〜3個の目をプールします。細胞は、十分に高い密度で播種されていないと、時間の経過とともに六角形の形状と色素を失う可能性があります。生後8週齢以上のマウスの場合、最適なコンフルエンシーを得るには、24ウェルプレートあたり2眼で十分です。マウスが8週齢未満の場合、3〜4眼で順守と合流性が向上します。時間の経過とともに、細胞は上皮間葉転換(EMT)の影響を受けやすくなり、色素沈着が失われ、細長い形状を獲得する可能性があります。Rho-キナーゼ阻害剤およびTGFβR-1/ALK5阻害剤(Y27632およびRepsoxなど)の添加は、培養RPE細胞のEMTを予防することができる¹²。単離プロトコルは短く、2〜4眼の単離に1時間しか必要としませんが、一次培養物が完全に合流するまでに最大7〜10日かかる場合があります。さらに、継代RPEは限られており、その後の経過ごとにEMTのリスクが高くなります。

網膜色素上皮細胞は、眼の恒常性を維持するための重要な細胞です。RPEは、光受容体の維持を助ける食細胞として作用し、神経層が光による損傷から防止し、輸送を調節するための緊密な上皮バリアとして機能します¹⁷。加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症など、RPEに直接影響を与える疾患は、炎症を悪化させ、アポトーシスを増加させ、細胞接合部を破壊する可能性があり、網膜変性症と失明の可能性の増加につながります¹⁷。一次RPEの培養は、RPEに影響を与える眼疾患の病因の研究を容易にします。結論として、私たちのプロトコールは、高純度の細胞培養を維持しながら、単離の期間を短縮し、必要な技術と試薬を簡素化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.009 RD シングルエッジ ブレード	ペルソナ	941202
ダルベッコ モディファイド イーグルズ ミディアム (DMEM)	コーニング	10-013-CV	4.5 g/L グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム
シ胎児血清	コーニング	35010CV
グルタMAX、100x	ギブコ	35050061
ハンクス バランス塩溶液	ギブコ	14175095	カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド
HEPES バッファー溶液 (1M)	Gibco	15630106
MEM 非必須アミノ酸、100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution、100x	Corning	30-002-CI
ポリスチレンマイクロプレート	Falcon	08-772-1	24 ウェルまたは 48 ウェル
レギュラー フェ	Corning	35-010-CV
トリプシン-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	フェノールレッド
Vannas はさみ	ファイン サイエンス ツール	10091-12