ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

Summary

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。

Abstract

健康および疾患における抗原特異的T細胞の同定と特性評価は、免疫病態生理学の理解を深めるための鍵であり続けています。内因性T細胞レパートリー内の抗原特異的T細胞集団を追跡するという技術的課題は、ペプチド:MHCテトラマー試薬の開発によって大幅に進歩しました。抗原性ペプチドエピトープに複合体を形成したMHCクラスIまたはクラスII分子のこれらの蛍光標識可溶性マルチマーは、対応するT細胞受容体(TCR)特異性を持つT細胞に直接結合するため、 ex vivo によって誘導される機能的応答を必要とせずに、天然状態の抗原特異的T細胞集団を同定できます刺激。非常にまれな集団の場合、四量体に結合したT細胞を磁気的に濃縮して、検出の感度と信頼性を高めることができます。

組織に常在するT細胞免疫の研究が深まるにつれ、非リンパ組織に輸送され、非リンパ組織に存在する抗原特異的T細胞の同定が急務となっています。このプロトコルでは、マウスの肺内に存在する抗原特異的T細胞の単離と特性評価のための詳細な指示を提示します。これには、消化された肺組織からのT細胞の単離と、フローサイトメトリー分析とソーティングのための一般的なT細胞磁気濃縮ステップとテトラマー染色が含まれます。このプロトコルで強調されているステップは、一般的な技術と容易に利用可能な試薬を利用しているため、マウスT細胞免疫学に従事するほぼすべての研究者がアクセスでき、肺内に存在している低頻度抗原特異的T細胞集団のさまざまなダウンストリーム分析に非常に適応性があります。

Introduction

適応免疫系の中心には、T細胞が特定の抗原を認識して応答する能力があります。T細胞がいつ、どこでその同族抗原に応答するかによって、感染と自己免疫、恒常性と癌、健康と病気のバランスが決まります¹。したがって、免疫の特定の状況におけるT細胞の研究は、関心のある関連抗原に対する特異性を持つ細胞に焦点を当てるべきです。抗原特異的T細胞集団を特徴付ける能力を大幅に向上させた技術的進歩の中には、「ペプチド:MHC四量体」としてよく知られている抗原性ペプチドエピトープに複合体化された主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII分子の蛍光標識可溶性多量体(通常は四量体)があります2,3,4,5 .ペプチド:MHCクラスIおよびクラスII四量体は、T細胞抗原受容体(TCR)の天然リガンドを発現することにより、免疫系のT細胞の内因性レパートリー内の抗原特異的CD8⁺およびCD4⁺ T細胞をそれぞれ直接同定する手段を提供します。四量体は、抗原特異的T細胞の研究において、TCRトランスジェニックT細胞養子導入モデル⁶よりもエレガントなアプローチであり、実験マウスモデルと^{ヒト疾患4,5}の両方で、外来および自己抗原特異的T細胞集団を同定するためにますます使用されています。

四量体は、抗原刺激に応答して増殖したT細胞の高頻度集団を容易に同定できますが、ナイーブT細胞、自己抗原特異的T細胞、またはメモリーT細胞への使用は、これらの集団の頻度が非常に低いために制限されます⁷。私たちのグループと他のグループは、マウスリンパ組織^8,9,10,11におけるこれらの細胞集団の研究を可能にするために、検出の感度を高める四量体ベースの磁気濃縮戦略を開発し、普及させました。

この分野での組織常在性T細胞の出現により、非リンパ性領域のT細胞を調査する新しい方法の開発にますます重点が置かれています。他の多くの粘膜表面と同様に、肺のT細胞は、宿主上皮、共生微生物および感染性微生物、およびアレルゲンを含む環境実体に由来するさまざまな自己抗原および外来抗原に遭遇します。非リンパ組織(NLT)から採取されたT細胞の転写解析は、しばしば人身売買と組織恒常性に向けられた、独特の組織特異的な運命と機能を持つ記憶のような表現型を示しています¹²。さらに、組織に常在するメモリーT細胞(Trms)は、循環中のT細胞よりもクローン性が制限される傾向がある¹³。NLTにおいて、抗原がどのように、そしてなぜT細胞の居住を促進するのかを明らかにすることは、免疫系がどのように感染から保護し、組織の恒常性を維持し、時には自己免疫に進化するかを理解するために重要です。しかし、肺からの組織常在性T細胞の消耗は、他のNLTと比較して大きいようです¹⁴。したがって、特定の抗原特異性を持つ肺の内因性T細胞を同定し、特徴付ける能力は、その固有の希少性によって制限されます。

磁気ビーズを用いた細胞濃縮技術とペプチド:MHC四量体染色を組み合わせることで、マウス肺において増殖しているがまれな自己抗原特異的T細胞を検出することに成功しました^15,16。ここでは、マウスの肺に存在する希少な抗原特異的T細胞集団を確実に単離し、特性評価するために最適化したプロトコールについて詳しく説明します(図1)。このプロトコールは、組織常在T細胞と血管T細胞を区別するためのin vivo抗体染色ステップ¹⁷と、それに続くリソースの利用可能性に対応するための肺組織処理のための2つの異なる方法を組み込んでいます。その後、一般的なT細胞磁気濃縮ステップ、四量体染色、フローサイトメトリーによる解析が行われます。このプロトコールでは、誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)を介したT細胞活性化誘導性アポトーシスを阻害するアミノグアニジン¹⁸とTCRのダウンレギュレーションを制限するダサチニブ¹⁹を添加することにより、細胞生存率と四量体染色がさらに強化されます。このプロトコールで強調されているステップは、一般的な技術とすぐに利用できる試薬を利用しているため、マウスT細胞免疫学に従事するほぼすべての研究者がアクセスでき、さまざまなダウンストリーム分析に非常に適応性があります。ナイーブT細胞が肺に見つかる可能性は低いですが、このプロトコルは、肺の自己抗原特異的T細胞とTrmsの研究に特に役立つと考えています。

図1:プロトコルワークフローの概要。 肺はマウスから採取され、単一細胞に解離されます。その後、サンプルをT細胞に濃縮してから、ペプチド:MHC四量体および蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

このプロトコルに記載されている手順は、米国実験動物ケア認定協会(AAALAC)認定の動物管理プログラムであるマサチューセッツ総合病院の動物管理委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従って承認および開発されています。実験は、MGH動物施設で特定の病原体のない条件下で飼育および維持されたC57BL / 6遺伝的背景で、8〜12週齢の雄および雌マウスで行われました。

1. 原液の調製

1. 10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、150 mM NaCl、および1 mM MgCl₂を溶解してHEPES緩衝液を調製し、pH 7.4に調整します。
2. 700 μg/mL のリベラーゼサーモリシン培地(TM)( 材料表を参照)を Ca⁺⁺ および Mg⁺⁺ を含む Hank's Balanced Salt Solution ( 材料表を参照) に溶解し、10x リベラーゼストック溶液を調製します。
3. 100 mMアミノグアニジン半硫酸塩( 材料表を参照)をCa⁺⁺ およびMg⁺⁺ ( 材料表を参照)を含むハンク平衡塩溶液に溶解することにより、10xアミノグアニジンストック溶液を調製します。
4. EHAA培地( 材料表を参照)と10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、50 μg/mLゲンタマイシン、2 mM L-グルタミン、および55 μM 2-メルカプトエタノールを混合して、完全なイーグルハムアミノ酸(EHAA)培地を調製します。
   注:RPMIやDMEMなどの他の一般的なT細胞培地も使用できます。
5. 1x PBSを2% FBSおよび0.05%アジ化ナトリウムと混合して、ソーターバッファーを調製します。
6. 精製した抗マウスCD16/32抗体( 材料表を参照)をソーターバッファー中で1:100 v/vで希釈することにより、Fcブロックを調製します。
7. L-グルタミンを含まないRPMI 1640培地に100 μg/mL Liberase TMと50 μg/mL DNase I( 材料表を参照)を加えて、Liberase TM/DNase消化溶液を調製します( 材料表を参照)。
8. 生理食塩水(0.9%NaCl)に10 mg / mLケタミン( 材料の表を参照)と1 mg / mLのキシラジン( 材料の表を参照)を加えて、ケタミン/キシラジン混合物を準備します( 材料の表を参照)。

2. 自動組織解離器による肺組織からの単一細胞懸濁液の生成

1. 各マウスについて、4 mLの氷冷HEPESバッファーを特殊な組織解離チューブ( 材料の表を参照)に調製し、氷上に保ちます。
2. 150-200 μL のケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。100 μLの生理食塩水で希釈した1〜3 μgの蛍光色素標識抗マウスCD45抗体( 材料表を参照)を麻酔した各マウスに静脈内注射します。抗体投与の3分後に、ケタミン/キシラジン混合物500〜600μLの腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。
3. 肺を切除し、氷の上で冷やしたそれぞれの組織解離チューブに入れます。チューブを自動組織解離器( 材料の表を参照)に置き、肺組織の最初のプログラム(プリセットプログラム)を実行します。
4. 解離した肺組織を含む各チューブに、500 μLのリベラーゼストック溶液と500 μLのアミノグアニジンストック溶液を加えます。ニューティングミキサーで37°Cで30分間インキュベートします。
5. チューブを解離器に戻し、肺組織用の2番目のプログラム(プリセットプログラム)を実行します。
6. 組織解離チューブからの単一細胞懸濁液を100 μmのセルストレーナー( 材料の表を参照)を通し、50 mLのコニカルチューブに注ぎます。組織解離チューブを5 mLの完全EHAA(または同等のT細胞培地)ですすぎ、ストレーナーを通過して50 mLチューブに入ります。
7. ストレーナーを取り外し、細胞懸濁液の容量を完全なEHAAで50mLに増やします。細胞懸濁液を400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に吸引し、約100 μLの上清と細胞ペレットを残します。
8. 約100μLのFcブロック溶液を加えて総容量を200μLまで上げ、激しく渦巻いてペレットを再懸濁します。

3.代替プロトコル:手動解離により肺組織から単一細胞懸濁液を生成する

1. 各マウスについて、1.5 mLのマイクロチューブに1 mLの完全EHAAを調製し、氷上に保ちます。
2. 150-200 μL のケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。100 μLの生理食塩水で希釈した1〜3 μgの蛍光色素標識抗マウスCD45抗体を、麻酔をかけた各マウスに静脈内注射します。抗体投与の3分後に、ケタミン/キシラジン混合物500〜600μLの腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。
3. 肺を切除し、氷上で冷やしたそれぞれの1.5mLマイクロチューブに入れます。
4. すべての肺を採取したら、細胞培地を含まない新しいマイクロチューブに各肺を移します。
5. マイクロチューブ内のハサミを使用して、肺を小さな断片(~2〜3 mmの塊)に切ります。
6. 各チューブに1 mLのLiberase TM/DNase I消化カクテルを加えます。
7. 水浴中で37°Cで30分間インキュベートします。その後、サンプルを氷に戻して、過剰消化を防ぎます。
8. 50 mLのコニカルチューブの上に置いた100 μmのセルストレーナーにサンプルを注ぎます。滅菌済みの1mLシリンジからプランジャーのゴム端でメッシュに対して組織をつぶします。
9. ストレーナーをコールドソーターバッファーですすぎ、チューブ内に最終容量7mLを収集します。細胞懸濁液を400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に吸引し、約100 μLの上清と細胞ペレットを残します。
10. 100 μLのFcブロック溶液を加えて総容量を200 μLまで上げ、激しく渦巻いてペレットを再懸濁します。

4. 磁気ビーズ濃縮によるT細胞の肺サンプルの濃縮

1. 50 μL の抗マウス CD90.2 マイクロビーズを添加します ( 材料の表を参照)。ボルテックスし、4°Cで10分間インキュベートします。
   注:CD90.2は、C57BL/6マウスのT細胞によって発現される対立遺伝子に対応します。マウスの他の系統が使用されている場合は、対立遺伝子の遺伝子型を確認してください。
2. それまでの間、常磁性細胞分離カラム( 材料の表を参照)を1ポジションまたは4ポジションの細胞分離磁石( 材料の表を参照)の上に置きます。開いた15 mLコニカルチューブを各カラムの下に配置して、流れを捕捉します。3 mLのコールドソーターバッファーでカラムをプライムし、重力によってカラムを下の円錐形チューブに排出します。
3. 細胞をマイクロビーズと10分間インキュベートしたら、コールドソーターバッファーを1 mLの容量に加え、カラムの上に置いた100 μmの細胞ストレーナーに移します。カラムの流れを、カラムの下に配置された新しい15 mLコニカルチューブに集めます。
4. 細胞懸濁液が重力によってカラムを完全に排出したら、元のチューブを追加の3 mLのコールドソーターバッファーですすぎ、メッシュを介してカラムに適用してカラムを洗浄し、ストレーナをすすぎます。ストレーナを取り外します。
5. サンプルが再びカラムに完全に排出され、カラムからそれ以上のフロースルーが出なくなったら、カラムを磁石から取り外し、新しい15 mLコニカルチューブの上に置きます。
6. 5 mLのコールドソーターバッファーをカラムに加えます。
7. カラムプランジャーを1回の連続動作で上部に押し込み、ソーターバッファーをカラムの底部から新しいチューブに押し込むことにより、カラムに結合した細胞をすぐに溶出します。
8. 溶出したサンプルを400 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 上清を慎重に吸引し、約100 μLの上清と細胞ペレットを残します。
9. 100 μLのコールドソーターバッファーを加えて総容量を200 μLまで上げ、激しくボルテックスしてペレットを再懸濁します。
10. 必要に応じて、非結合細胞画分を含むフロースルーサンプルを分析します。

5. 抗原特異的T細胞のペプチド:MHC四量体による染色

1. 10 μM ダサチニブ 1 μL ( 材料表を参照) を各サンプルに加え、ボルテックスでボルテックスし、室温で 5 分間インキュベートします。
2. PEまたはAPC標識ペプチド:MHC四量体を最終濃度10 nM(または特定の四量体に対して経験的に最適化された濃度)まで添加します。
3. ボルテックスし、室温(または経験的に最適化された時間と温度)で1時間暗闇でインキュベートします。

6. フローサイトメトリーによる四量体標識T細胞の解析

1. サンプルをペプチド:MHC四量体で染色している間に、抗体のマスターミックスを調製して細胞の表面マーカーを染色します(表1)。
   注:静脈内投与されたCD45抗体または四量体と競合する蛍光色素は避けてください。
2. テトラマー染色のインキュベーション期間が残り15分になったら、表面抗体マスターミックスを1:100(または経験的に最適化された濃度)で各サンプルに加えます。
3. 1時間のインキュベーション期間の残りの間、RTで暗闇でインキュベートを続けます。
4. 50,000個のフローサイトメトリーカウントビーズ( 材料表を参照)を添加し、コールドソーターバッファーを最終容量約5 mLまで追加します。染色したサンプルを400 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 上清を慎重に吸引し、約100 μLの上清と細胞/ビーズペレットを残します。
5. サンプルを200 μLのソーターバッファーで再懸濁し、サンプルを5 mLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移します。
6. フローサイトメーターでサンプルを分析します。できるだけ多くのセルを、最大で合計2,500,000のイベントまで集めましょう。少なくとも 20,000 個のビーズ イベントが収集されていることを確認します。取得レートを毎秒 5,000 イベント以下に維持します。
7. すべてのデータをFCSファイルとして保存します。

  

蛍光色素	抗体
BUV395	CD90.2の
パシフィックブルー	CD45(点滴注入により先に添加)
パシフィックオレンジ	CD8
ブリリアントバイオレット785	CD4の
フィッツ	CD3
パーCP-Cy5.5	ダンプ(B220、CD11b、CD11c、F4/80)
PEの	pMHC四量体または表現型マーカー
PE-Cy7	表現型マーカー(例:CD44、PD-1、CD69など)
APCの	pMHC四量体または表現型マーカー
アレクサフロー 700	表現型マーカー(例:CD44、PD-1、CD69など)
APC-Cy7の	ライブ/デッドステイン

表1:サンプル染色マトリックス。 抗原特異的T細胞の同定と特性評価に利用される蛍光色素標識フローサイトメトリー抗体の典型的なパネルです。

7. データの分析

1. 適切なフローサイトメトリーソフトウェアを使用してFCSデータファイルを解析します。
   1. 1)リンパ球様、2)単一、3)ライブ、4)血管外、5)ダンプ陰性、および6)CD4またはCD8陽性のいずれかであるCD90.2陽性イベントを特定するために、連続するインクルージョンゲートのシーケンスを設定します(図2)。
   2. これらの集団内の四量体陽性T細胞を同定します。
2. サンプル分析中に収集されたビーズの数に添加されたビーズの比率(50,000)を計算し、その値に収集されたテトラマー陽性細胞の総数を掛けることにより、絶対的なテトラマー陽性細胞数を決定します。
   

Results

図2 は、ペプチド:MHCクラスII四量体を用いた肺内の希少抗原特異的CD4⁺ T細胞の同定に使用される代表的なゲーティング戦略を示しています。同じプロセスを、ペプチド:MHCクラスI四量体(データは示さず)を持つ抗原特異的CD8⁺ T細胞にも適用できます。

肺には非リンパ系細胞が多数存在するため、四量体による希少抗原特異的T細胞の信頼性の高い検出には、目的のT細胞に対する何らかの事前の濃縮が必要であり、シグナル対ノイズ比を改善する必要があります。 図3 は、このプロトコルで説明した肺組織からの総T細胞のCD90.2抗体ベースの磁気濃縮の有効性を示しています。平均して、この濃縮プロセスにより、肺からすべてのCD90.2⁺ T細胞の99%以上を90%以上の純度で回収しています。 図4 は、この濃縮により生じる希少な四量体陽性CD4⁺ T細胞の検出が改善されたことを示しています。これは、濃縮なしまたは直接的な四量体ベースの細胞濃縮戦略と比較してのものです。

図5 は、ダサチニブで処理された抗原特異的T細胞の四量体標識の改善、特にまれな集団を示しています。

図2:フローサイトメトリー解析のゲーティング戦略。 逐次インクルージョンゲートおよび排除ゲートは、急性組織損傷後に肺に蓄積するまれな自己抗原特異的CD4+ T細胞を同定するために使用されます。カウントビーズは、FITCチャネルに沿った蛍光に基づいて直接同定できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CD90.2抗体を用いた肺の全T細胞の磁気濃縮。 代表的なフローサイトメトリープロットは、濃縮後の肺サンプルの非結合画分(左)と結合画分(右)について示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:肺内の希少抗原特異的T細胞の検出を支援するための細胞濃縮戦略の比較。 肺上皮にモデル自己抗原を発現する3匹のマウスを、Complete Freund's Adjuvant(CFA)で乳化した自己抗原のペプチドエピトープで皮下免疫した。7日後、マウスの肺を採取し、組み合わせ、3つの等しいサンプルに分割して、細胞濃縮なし(左)、CD90.2抗体ベースの細胞濃縮(中央)、または四量体ベースの細胞濃縮(右)に続いて、四量体染色を行いました。サンプルは、フローサイトメトリーにより、合計1,500,000件以下のイベントについて分析しました(CD4⁺ ゲートイベントが示されています)。四量体陽性のイベント数は黒で示され、肺サンプル中の抗原特異的T細胞の計算された総数は赤で示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ダサチニブ処理は四量体染色を強化します。 野生型マウス(左)または肺上皮にモデル自己抗原を発現するマウス(右)を、CFAで乳化した自己抗原からペプチドエピトープで皮下免疫しました。マウスの脾臓とリンパ器官を採取し、組み合わせて、ペプチドで標識するための2つの等しいサンプルに分割しました:ダサチニブ前処理の有無にかかわらずMHCクラスII四量体。テトラマー染色のヒストグラムを重ね合わせ、ダサチニブ(赤)とダサチニブなし(青)で処理したサンプルを比較します。各サンプルの蛍光強度の中央値が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

肺からの抗原特異的T細胞の以前の特性評価は、鼻腔内免疫や感染などの急性プライミングイベント後に増殖する抗原特異的T細胞の強力な数の恩恵を受けてきました20,21,22。しかし、自己抗原特異的T細胞や組織常在メモリーT細胞など、肺内のまれなT細胞集団は、目的のT細胞15,16,23に対する何らかの形のサンプル濃縮なしには検出が困難である。我々は、生存可能なリンパ球^24,25を高い割合で得るために以前に述べた肺組織解離技術と、実質T細胞から血管内T細胞を区別する戦略、および一般的なT細胞ベースの濃縮プロセスとそれに続く四量体染色¹⁷を組み合わせることによって、この目標を達成した。このプロトコルを使用して、外因性ペプチドによる直接免疫または組織損傷中の抗原放出からの間接活性化に応答して生じる肺の自己抗原に対して特異的なまれなT細胞を同定し、特徴付ける能力を実証しました^15,16。この議定書の開発では、いくつかの考慮事項がなされました。

私たちは、うまく機能した2つの異なる肺組織処理プロトコルについて説明しました。1つは自動組織解離装置の使用を含み、もう1つは手動プロセスに依存しています。重要なのは、どちらの方法も、メタロプロテアーゼサーモリシンを含むコラゲナーゼIとIIのブレンドであるリベラーゼTMを利用していることです。この酵素ブレンドは、単一のコラゲナーゼカクテルよりも消化活性を高めることが実証されており、肺組織からの白血球の回収に良好に作用することが実証されている²⁶。

自動化された組織解離プロトコルは、装置と特殊な組織解離チューブに多額の初期費用を必要としますが、チューブは洗浄してセルストレーナーと一緒に再利用することができ、これも一般的に再利用可能です。手動解離プロトコルは、特殊な機器の初期費用はかかりませんが、労働集約的であり、各サンプルが個別に切り刻まれるため、収穫が長くなります。アミノグアニジンまたはDNase Iを使用して細胞死と細胞凝集を制限することに関しては、プロトコル間には他にも違いがありますが、これらの添加剤の影響を慎重に比較したわけではありません。どちらのプロトコルを使用するかは、実施する研究の種類における個人的な経験と、コストの最大の要因となる自動組織解離装置の利用可能性に依存する必要があります。実際、2つのプロトコルの要素を組み合わせて、研究の特定のニーズに最適なパフォーマンスを提供することができます。

上記のプロトコルは、組織解離から調製された単一細胞懸濁液からリンパ球を単離するための密度勾配の使用を特に除外する。私たちは、希少抗原特異的T細胞の同定に必要な磁気T細胞濃縮ステップが、このステップを省略することを発見しました。しかし、抗原特異的T細胞の頻度が十分に高く、T細胞の濃縮ステップを完全に排除する場合には、多数の非リンパ性細胞を除去することにより、かなりの量の標的細胞の濃縮が得られるため、密度勾配が推奨される。さらに、肺のシングルセル調製物が特に大きい場合や乱雑な場合は、磁気濃縮の前に密度勾配ステップを使用して、後でカラムを詰まらせる可能性のある過剰な細胞破片を除去することができます(ステップ4.4〜4.7)。

より直接的な四量体ベースの細胞濃縮戦略ではなく、CD90 pan T細胞マーカー(C57BL/6マウスで発現する対立遺伝子のCD90.2)に基づくすべてのT細胞の一般的な濃縮を選択しました。これにはいくつかの利点があります。(1)CD90ベースの濃縮は、濃縮されていないまたは四量体ベースの濃縮サンプルよりも、フローサイトメトリーで検出される抗原特異的イベントの数が多くなります(図4)。これにより、サンプル収集時間が長くなり、S/N分解能が悪化する過剰な総イベント数(>2,500,000)を収集することなく、希少抗原特異的T細胞の頻度をより適切に推定することができます。(2)四量体ベースの濃縮とは異なり、CD90ベースの濃縮では、CD4⁺ およびCD8⁺ T細胞、血管内T細胞と血管外T細胞、抗原特異的T細胞と抗原非特異的T細胞など、肺のT細胞コンパートメント全体を1つのサンプルで評価できます(図2)。(3)CD90ベースの濃縮ステップはテトラマー染色の前に行われるため、テトラマー標識細胞がフローサイトメーターで解析されるまでの時間を最小限に抑え、テトラマーの剥離によるシグナルの損失の可能性を抑えることができます。

このプロトコールのT細胞濃縮プロセスは、CD90.2磁気ビーズによるポジティブセレクションに基づいていますが、CD4、CD8、またはpan T細胞単離キットが提供するネガティブセレクション戦略でも同様の結果を得ることができます。ここでは、特定のブランドのマイクロビーズ、カラム、磁石の使用について説明していますが、他の磁気濃縮システムも機能するはずです。繰り返しになりますが、決定は、実施されている特定の研究のパフォーマンスと、かなりの費用がかかる可能性のある全体的なコストに基づいて行われるべきです。濃縮プロトコルに関する私たちの経験では、標的細胞の収量と純度の間には一般的なトレードオフがあり、非常に限られた数の抗原特異的T細胞を検出する目的では、収量が優先されます。

代表的な結果は、CD4⁺ T細胞とペプチド:MHCクラスII四量体を用いた実験を示していますが、このプロトコールはCD8⁺ T細胞とペプチド:MHCクラスI四量体にも同様に効果的です。このような場合、クラスIテトラマー染色に必要な条件(濃度、時間、温度)が異なる可能性があることを考慮する必要があります。さらに、適切な蛍光色素標識B細胞抗原試薬²⁷を用いた抗原特異的B細胞研究での使用を妨げる理由は見当たらない。

最後に、ここで説明するプロトコルは、テトラマー染色の前にプロテインキナーゼ阻害剤であるダサチニブをサンプルに添加することを含む。ダサチニブはTCRのシグナル伝達と内在化を阻害し、T細胞の四量体標識を改善するとともに、四量体によるT細胞死を減少させる可能性がある¹⁹。ダサチニブ治療の利点は、希少な自己抗原特異的集団の検出に最も顕著に現れていることがわかりました。これは、自己抗原特異的T細胞が、中枢耐性^28,29,30,31中のネガティブセレクションの影響により、より低い親和性TCRを発現するという事実によるものと考えられる。

ここで使用したプロトコールは、細胞内染色プロトコールとうまく組み合わされており、まれな肺に常在する抗原特異的T細胞における転写因子およびサイトカイン発現を解析しています。また、これらの希少な集団をフローソーティングして、シングルセルトランスクリプトミクスやTCRシーケンシングなどのダウンストリーム解析を行うことにも成功しています。このプロトコルの継続的な使用と開発は、肺の病態生理学における適応免疫の研究に大いに役立つはずです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm セルストレーナー	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS Ca++ または Mg++
1x PBS Ca++ または Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
アミノグアニジン半硫酸塩	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 マイクロビーズ、マウス	Miltenyi	130-121-278
細胞分離磁石 (MidiMACS セパレーター)	Miltenyi	130-042-302	シングル LS カラムを保持
細胞分離磁石 (QuadroMACS セパレーター)	Miltenyi	130-090-976	LS カラム
を保持 ダサチニブ	シグマ・アルドリッチ	CDS023389
DNase I	ロシュ	10104159001
イーグル」ハム's アミノ酸 ミディア	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	自動組織解離剤
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	自動組織解離チューブ
ハンクのバランスの取れた塩溶液 Ca++ または Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue 抗マウス CD45 抗体 (クローン: 30-F11)	Biolegend	103126
常磁性細胞分離カラム (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	プランジャー付属
精製抗マウスCD16/32 抗体 (クローン: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 培地 L-グルタミンなし	Corning	15-040-CM
塩化ナトリウム 0.9% (生理食塩水)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02