方法論記事

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

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DOI：

10.3791/66954

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2024年5月31日

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1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in vitroで血管新生を研究するための適切なアッセイとして提示されます。

要約

血管新生は、腫瘍の増殖や血管新生性眼疾患など、体内の生理学的および病理学的プロセスの両方で重要な役割を果たします。根底にある分子メカニズムの詳細な理解と信頼性の高いスクリーニングモデルは、疾患を効果的に標的とし、新しい治療オプションを開発するために不可欠です。血管新生をモデル化するために、制御された環境が提供する機会を利用して、血管新生ドライバーを分子レベルで解明し、治療標的をスクリーニングするために、いくつかの in vitro アッセイが開発されています。

この研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を使用して in vitro で血管新生を調査するためのワークフローを示します。2D設定で内皮細胞移動を測定するライブセルイメージングシステムを利用したスクラッチ創傷移動アッセイと、コラーゲンマトリックスによって提供される3D設定で内皮細胞の発芽を評価するスフェロイド発芽アッセイについて詳しく説明します。さらに、トランスクリプトミクス、特に3DセッティングでのRNA抽出や免疫細胞化学などのさらなる分子解析を可能にするためのサンプル調製戦略について概説します。全体として、このフレームワークは、科学者が in vitro 血管新生アッセイにおける科学的調査を追求するための信頼性と汎用性の高いツールセットを提供します。

概要

血管新生は、既存の血管から新しい血管を形成することを指します1、生理学的発達および病理学的状態における重要なプロセスです。これは、網膜2や発生中の中枢神経系3などの代謝活性の高い組織にエネルギーを供給するため、および損傷した組織4の治癒中に不可欠です。一方、異常な血管新生は、多くの病気の基礎となっています。結腸直腸癌や非小細胞肺癌などの固形腫瘍は、血管新生を促進することにより、その成長と必要なエネルギー供給を促進します5。がん以外にも、糖尿病性網膜症や加齢性黄斑変性症などの眼の血管新生疾患は、先進国における失明の主な原因であり、血管の異常な成長に起因します6,7。根底にある病態メカニズムを詳細に理解することは、例えば、血管増殖性眼疾患などの病的状態をより良く制御しながら、創傷治癒において生理学的血管新生をどのように強化できるかを理解するために重要です。

細胞レベルでは、血管内皮細胞は血管新生においてさまざまなシグナル伝達分子によって活性化され、細胞の増殖と移動を開始します8。その後、細胞は階層に組織化され、非増殖性の先端細胞は、発生中の血管分岐8の前縁で糸状仮足を形成する。それに加えて、急速に増殖する茎細胞が先端細胞をたどり、出現する血管の形成に寄与します。続いて、周皮細胞または平滑筋細胞などの他の細胞型が動員され、新生分岐9をさらに安定化させる。

血管内皮細胞レベルでの分子プロセスを探求するために、数多くの in vitro プロトコルが開発され、最近レビューされています10。これらのアッセイは通常、より単純でスケーラブルな2Dアプローチと、より精巧な3Dプロトコルの2つのカテゴリに分類されます。最近のプロジェクトでは、2Dスクラッチ創傷移動アッセイと3Dスフェロイドスプラウティングアッセイ11 との間の包括的な比較分析を実施して、それらの違いの程度と血管新生のさまざまな側面をモデル化する能力を評価しました12。

どちらも信頼性が高く、簡単に実装できるという利点がありますが、分子レベルでは、3Dスフェロイドスプラウティングアッセイは、代謝スイッチや細胞とマトリックスの相互作用など、in vivoデータと比較して血管新生の主要な側面に対処するのに有利でした。in vitro血管新生アッセイは、シグナル伝達経路13の血管調節能の評価や治療薬のスクリーニングに使用されるため、in vitroの結果のin vivo設定への転写性が不可欠です。さらに、制御された条件下での血管新生プロセスの標的調節に対する分子変化を特徴付けるために、RNAおよびタンパク質レベルに関するオミクスベースの分析の機会は、in vivo設定14,15と比較して依然として重要な利点である。

本書では、生細胞イメージング遊走アッセイやスフェロイドスプラウティングアッセイの利用を通じて、トランスクリプトーム解析のためのRNAシーケンシングやタンパク質レベルでの免疫組織化学などの分子解析を含む、血管新生関連の問題を探求するための主要なアッセイを紹介します。

プロトコル

1. HUVEC細胞培養

注:滅菌作業条件(滅菌作業ベンチ)で以下のすべての手順を実行します。

  1. HUVECの拡大
    1. どちらの血管新生アッセイにも、プールされたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)またはヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)を使用してください。
    2. 分割を行う前に、内皮細胞増殖培地(EGM)を含むコーティングされていないT75フラスコで細胞が90%のコンフルエントに達するまで細胞を培養します。週に3回、中程度の交換を行います。
      注意: 成長を促進するために、培地は毎日交換できます。6番目のパッセージを超えてHUVECを使用しないでください。この研究は、同じパッセージのHUVECを使用してすべての実験を実行した最も一貫した結果を受け取りました。
  2. HUVECの分割
    1. HUVECがT75フラスコで目的の合流点に達したら、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回すすぎた後、インキュベーター内で0.5%トリプシンと細胞を2分間インキュベートします。
      注:トリプシンに長時間さらされると、HUVEC機能が損傷する可能性があります。.
    2. フラスコを軽くたたいて、細胞をそっと切り離します。倒立位相差顕微鏡で剥離が成功したことを確認します。
    3. EGM8 mLを加え、溶液をチューブに移し、250 x g で3分間遠心分離して細胞をペレット化します。
    4. 細胞計数が必要な場合は、細胞を5 mLのEGMに再懸濁し、ノイバウアーチャンバーを使用します。それ以外の場合は、40 mLのEGMを添加し、4つの新鮮なT75細胞培養フラスコに分配します。

2. スクラッチ創傷移動アッセイ

注:スクラッチ創傷移動アッセイは、完了するまでに3日間の期間が必要です(図1)。無菌作業条件(無菌作業台)で以下のすべての手順を実行します。

  1. 細胞のプレーティングと飢餓(1日目)
    1. 生細胞イメージング専用の96ウェルプレートを使用して、ウェルあたり100 μLのEGMに20,000 HUVECを播種します。細胞をインキュベーター内で6時間沈殿させます。
      注:サプライヤーと研究所の間で血管内皮細胞の成長速度が異なることを考慮して、細胞数を最適化することをお勧めします。目的は、スクラッチを開始する前に、翌日に完全な単層を達成することです。過密状態のウェルは、例えば、接触阻害16によって内皮細胞の挙動を変化させることができるが、不完全な単層は分析を劇的に妨げる。
    2. すべてのウェルを、ウェルあたり100μLのEBMに2%FBSを添加して一晩飢餓状態にします。
      注:特にマルチチャンネルピペットを使用する場合は、細胞単層を損傷しないように注意してください。
  2. 刺激溶液の準備(2日目)
    1. 2% FBSを添加した内皮細胞増殖基礎培地(EBM)で目的の物質とコントロールを希釈します。各ウェルには、100 μLの溶液を使用します。
      注:2%FBSを添加したEBMはネガティブコントロールとして機能しますが、25 ng / mLの組換えヒト血管内皮増殖因子(VEGF)はポジティブコントロールとして使用できます。96ウェルプレートを使用して、実験は最小限の技術的反復(同一の条件を持つ4つのウェル)で設計することをお勧めしますが、最適な結果を得るには8ウェルを使用することをお勧めします。レイアウトを計画するときは、エッジやコーナーの影響を最小限に抑えるようにしてください。
  3. スクラッチ作成(2日目)
    1. 顕微鏡で細胞を検査し、コンフルエントな細胞単層と細胞生存率を確認します。96ウェルプレートを96ウェル巻線メーカーツールにセットし、デバイスのレバーを押し下げて傷を発生させます。二重の傷を防ぐために、レバーを離す前に、傷取りメーカーツールの蓋を慎重に持ち上げてください。
    2. 2% FBSを添加したウェルあたり200 μLのEBMを使用して、すべてのウェルを2回洗浄します。デブリが正常に除去されたことを顕微鏡で確認します。
  4. 細胞刺激(2日目)
    1. 調製した刺激溶液またはコントロール溶液をウェルあたり100μL加えます。
  5. イメージング(2-3日目)
    1. 生細胞イメージング顕微鏡が提供する自動スケジュールを使用して、最大24時間にわたって1時間に1回画像を取得します。
      注:良好な画質を確保するには、生細胞イメージングシステムを収容するインキュベーターに移した直後にすべてのウェルをスキャンしてください。インキュベーター内で30分間の順応時間は、より良い画質を得るのに役立ちます。顕微鏡ソフトウェアは、定義されたスクラッチの正中線にある各ウェルについて、1時間あたり1つの画像を取得するようにプログラムされています。
  6. 創傷メーカーツールとライブセルイメージャーがない場合は、以下で説明する手順に従ってください。
    1. 24ウェルプレートにピペットチップを使用して、引っかき傷を誘発します。従来の細胞培養顕微鏡で特定の間隔で画像を撮影します。この目的のために、正確なxおよびy追跡機能を備えた電動顕微鏡を利用します。これにより、自動位置決めが可能になり、事前定義された場所で一貫した画像キャプチャが保証されます。
      注:手動イメージングが必要な場合は、T0と治療後1つの時点「x」時間のみをイメージングすることが実行可能なオプションです。HUVECを使用した記載のプロトコルでは、時点T12(刺激後12時間)は、陰性コントロールとVEGF刺激ポジティブコントロールとの間に明確な分離がある魅力的な時点であった。ただし、各ラボの特定の実験設定に最適な時点を決定するために、2時間または1時間ごとにイメージングによる初期時間経過実験を実行することをお勧めします。
  7. 分析(3日目)
    1. 生細胞イメージング顕微鏡ソフトウェアは、取得した画像の直接分析を可能にする場合があります。セルの芝生、初期スクラッチ、および相対的な巻線密度領域を描写するマスクを定義します。コントラストの違いに基づいてセルの境界を決定します。
      注:HUVECでの実行実験には、セグメンテーション調整1.6、ホールファイル500μm2、調整サイズ1ピクセル、面積>500μm、偏心>0.6を使用しました。実際の画像に対する細胞検出パラメータの徹底的な視覚的検証が不可欠です。最適化された構成により、ソフトウェアは経時的な相対創傷密度(RWD)を自動的に計算し、テクニカルレプリケートの標準偏差(SD)に対応する時間グラフを生成します。このデータは、統計分析に使用できます。

3. 2D培養細胞によるRNA抽出

注:滅菌作業条件(滅菌作業ベンチ)でステップ3.3までの次の手順をすべて実行します。

  1. プレーティングセル(1日目)
    1. HUVEC細胞培養プロトコルのステップ1.2に従ってHUVECを切り離します。
    2. 1ウェルあたり50,000個の細胞を、ウェルあたり2 mLのEGMを含む12ウェルプレートに播種します。
    3. 6時間後に培地を2%FBS(飢餓培地)を含むEBMに変更して、一晩飢餓させます。
  2. 細胞の治療(2日目)
    1. EBMに関心のある希薄化剤に2%FBSを添加。飢餓培地を調製した希釈液と交換し、インキュベーター内で細胞を所望の時間インキュベートします。
  3. RNA抽出(2-3日目)
    1. ウェルあたり750 μLのTrizolで細胞を溶解し、オービタルシェーカーで10分間インキュベートします。
    2. 1000 μLのピペットでサンプルを数回再懸濁した後、特定の低結合RNAチューブ(容量1.5 mL)に保存します。-80°Cで保存してください。

4. 2D培養細胞を用いた免疫細胞化学

注:無菌作業条件(滅菌作業ベンチ)でステップ4.4までの以下のすべての手順を実行します。

  1. カバースリップの準備
    1. 直径12 mmのカバースリップ100枚を、50 mLチューブ内のメタノール溶液中5%水酸化カリウムに溶かし、塗布溶液を振といながら30分間インキュベートします。
      注:これは、カバーガラスの表面を脱プロトン化し、コーティングと培養の条件を改善するための非常に重要なステップです。この時点で、カバーガラスが媒体内に十分に分散し、乾燥して接着されないようにすることを強くお勧めします。
    2. カバースリップを脱塩水で30分間4回洗います。
    3. 洗浄後、70%イソプロピル溶液に移して保存します。
  2. カバースリップのコーティング
    1. カバーガラスを正方形のシャーレの壁に個別に立てかけ、イソプロピルアルコールを蒸発させます。
    2. 5分後、カバースリップを24ウェルプレート(ウェルごとに1枚のカバースリップ)に移します。PBS中の10 mg/mLコラーゲンI溶液1 mLを各ウェルに適用し、37°Cで60分間インキュベートします。
    3. 次に、カバーガラスをPBSで5分間4〜5回洗います。
  3. 細胞の培養
    1. HUVEC細胞培養プロトコルのステップ1.2で概説されている手順に従って、HUVECを切り離します。
    2. ウェルあたり50,000個の細胞を、ウェルあたり2 mLのEGMを含む24ウェルプレートに播種します。
    3. 6時間後、培地を2%FBSを含むEBMに変更して、細胞がウェルに付着し、細胞を一晩飢餓状態にします。
    4. 翌日、EBM中の目的の希薄化剤に2%FBSを補充した。ウェル内の飢餓溶液を調製した希釈液と交換し、インキュベーター内で細胞を所望の時間インキュベートします。
  4. 固定とブロッキング
    1. 細胞を所望の時間培養し、PBSで細胞を5分間洗浄します。
    2. 細胞をPBS中の2%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温(RT)で20分間固定します。
    3. PBSで3〜4回5分間洗浄します。
    4. 5%正常ヤギ血清(NGS)、0.1% Triton-X-100 in PBSを含むブロッキングバッファーでサンプルをRTで1時間インキュベートします。
      注:このステップでは、PFAが完全に除去されることを保証するために、サンプルを洗浄することが重要です。二次抗体の起源に基づいて血清の種を選択してください。
  5. 染色
    1. サンプルをブロッキングバッファーで4°Cで一晩インキュベートします。
    2. 翌日、結合していない一次抗体を除去するために、サンプルをPBSで3〜4回、それぞれ5分間洗浄します。
    3. その後、サンプルを対応する二次抗体およびPhalloidin-FITCと共にRTで1時間インキュベートし、ブロッキングバッファーで一緒に希釈します。
    4. さらに3〜4回洗います。
    5. カバースリップをDAPI含有封入剤の小滴でスライドに反転させ、暗所で乾燥させ、マニキュアで密封します。サンプルは4°Cの暗所で保存してください。

5. スフェロイドスプラウティングアッセイ

注:スフェロイド発芽アッセイは、完了までに3日を要します(図2)。無菌作業条件(無菌作業ベンチ)でステップ5.7までの以下のすべての手順を実行します。

  1. 吊り下げ液滴でのスフェロイドの生成(1日目)
    1. HUVEC細胞培養プロトコルのステップ1.2で概説されている手順に従って、HUVECを切り離します。
    2. 200,000個の細胞を8mLのEGMおよび2mLのメトセルストック溶液と混合し、完全に混合します。メトセル原液の調製方法については、 補足ファイル1 を参照してください。
    3. 溶液の25μLの液滴を、大きな正方形のシャーレの逆さまの内面に分注します。蓋を180°ゆっくりと回転させ、液滴がぶら下がるように細胞培養容器の底に置きます。容器を細胞培養インキュベーターに一晩置きます。
  2. コラーゲンジェルの準備(2日目)
    1. 2.3 mLのラットテールコラーゲンI型と0.280 mLの10x Medium 199を、混合物が一貫して均一な黄色の色合いになるまで十分に混合します。この混合物は、プロセス全体を通して氷の上に置いておきます。
  3. コラーゲンジェルを滴定する(2日目)
    1. 混合物を滴定して、NaOH(2 N)を使用して、オレンジ色で示される生理的pHを達成します。
    2. 最終製品に50 μLのHEPESバッファーを加えます。
      注:アッセイの最適なダイナミックレンジを確保するためには、生理学的pHにできるだけ近づくことが不可欠です。コラーゲンのバッチごとに、必要なNaOHの量が異なる場合があります。プロセス全体を通して混合物を厳密に氷上に保管し、常に均一に混合します。
  4. スフェロイドの採取(2日目)
    1. 細胞培養蓋に吊り下げた滴を20mLのPBSですすいでください。
    2. 溶液を250 x gで7分間遠心分離します。上清を捨て、チューブを軽くたたいてスフェロイドを0.1 mLのFBSと0.4 mLのEGMに再懸濁します。
    3. メトセル原液2mLを加え、よく混ぜます。スフェロイドの損傷を避けるために、最小容量が5 mLのピペットを使用してください。
  5. 3Dコラーゲンマトリックスへのスフェロイドの添加(2日目)
    1. 調製したコラーゲン混合物2mLを再懸濁したスフェロイドに加え、十分に混合します。
    2. 得られた混合物0.5 mLを24ウェルプレートのウェルに分注し、細胞インキュベーターで30分間インキュベートします。
  6. 3Dコラーゲンマトリックス中のスフェロイドの刺激(2日目)
    1. EBMで目的の物質を希釈します。各ウェルには、100 μLの溶液を使用します。
      注:EBMはネガティブコントロールとして機能しますが、25 ng / mL(500 μLのコラーゲンマトリックスと100 μLのEBM層の最終濃度)の血管内皮増殖因子(VEGF)はポジティブコントロールとして使用できます。
    2. 希望の時間インキュベートします。
      注:標準的なアッセイでは、18〜24時間が推奨されますが、タイミングは各ラボで慎重に最適化する必要があります。
  7. スフェロイドのイメージング(3日目)
    1. 倒立顕微鏡とイメージングプラットフォームを利用して、ウェルリムに接触していない、互いに接触していない、または損傷の兆候が見られるすべてのスフェロイドの画像をキャプチャします。すべての条件で一貫した設定とズームレベルを維持します。
  8. 分析(3日目)
    1. ImageJ Fijiの測定ツールを使用して、各画像内の各回転楕円体からすべての芽の長さを確認します。
      注: 補足ファイル2で提供されているプラグインを使用すると、分析がより効率的になり、出力.txtファイルが生成されます。
    2. データをスプレッドシート、R、またはその他の優先ソフトウェアにインポートし、スフェロイドごとのすべてのスプラウトの平均累積長を各条件の読み取り値として使用します。
      注:異なるゲルの結果は、絶対発芽長の形で組み合わせることはできません。各処理群のデータは、データをマージする前に、EBM または VEGF コントロール群 (相対的な発芽長) に正規化する必要があります。

6. 3D培養細胞によるRNA抽出

  1. スフェロイドスプラウトアッセイ
    1. セクション5に記載されているように、スフェロイドスプラウティングアッセイを実施します。
  2. コラーゲンゲルの溶解
    1. スフェロイドゲルを温かいPBSで5分間洗浄します。
    2. スフェロイドゲルを4分の1にカットし、4つの4分の1すべてを50mLチューブに移します。ゲルの機械的解剖にはメスを使用してください。
    3. ゲルサンプルを溶解溶液(PBS中に2 mg/mLのコラゲナーゼDを含有)で処理し、シェーカーで37°Cで45分間インキュベートします。
    4. 2 mM EDTAを添加したPBSでゲルを穏やかに洗浄し、溶解バッファーの反応を停止します。
  3. RNA抽出
    1. 溶解したゲルを750 μLのTrizolに再懸濁し、ステップ3.3で説明したように十分なRNA抽出を保証するために10分間インキュベートします。
    2. 1000 μLのピペットでサンプルを数回再懸濁し、サンプルを特定の低結合RNAチューブ(容量1.5 mL)に移します。サンプルは-80°Cで保存してください。

7. 3次元コラーゲンマトリックス中のスフェロイドの免疫細胞化学

  1. スフェロイドスプラウトアッセイ
    1. セクション5に記載されているように、スフェロイドスプラウティングアッセイを実施します。
  2. 固定とブロッキング
    1. ゲルをPBS中の4%PFAで1時間固定します。
      注:ゲル内の細胞を良好に固定するために、PBSですすいだ後、メスとピンセットでウェルの側面でゲルを慎重に取り外す必要があります。
    2. ゲルをPBSで3〜4回穏やかに洗浄し、ウェルの表面から完全に剥離して、新しい24ウェルプレートに移します。
    3. オービタルシェーカー上でブロッキング溶液(5% NGSおよび0.1% Triton-X-100を含む)を用いて、RTで1時間ゲルをインキュベートします。
  3. 染色
    1. サンプルをオービタルシェーカーで4°Cで一晩インキュベートし、一次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。
      注:このインキュベーション中にゲルを回転させても、染色品質は改善されませんでした。
    2. 翌日、ゲルをPBSで4〜5回、それぞれ5分間穏やかに洗います。
    3. 対応する二次抗体をPhalloidin-FITCで希釈し、ブロッキングバッファー中でオービタルシェーカー上で4°Cで一晩インキュベートします。
    4. PBSで4〜5の追加洗浄ステップを実行します。
    5. ゲルを顕微鏡スライドに移し、各ゲルの上に置いたカバースリップに2滴のDAPI含有封入剤をセットします。サンプルを乾燥させてからマニキュアで密封し、4°Cの暗所で保管します。
  4. 顕微鏡
    1. すべてのサンプルを共焦点顕微鏡でイメージングします。20倍対物レンズを使用し、関心領域に焦点を合わせます。Zスタックとして画像を取得し、個々の焦点面画像も取得します。
      注:3Dサンプル全体の複数のセクションでZスタック画像と焦点面画像を取得することは、特に厚い3Dサンプルの場合、完全な表現をキャプチャするために不可欠です。

8. ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMVECs)

注:記載されているすべてのステップは、微小血管内皮細胞、例えば、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMVEC)を用いても実施することができる。その場合、培地を10%ウシ胎児血清(FBS)を含む特定の微小血管内皮細胞培地に切り替える必要があり、培養および各アッセイの特定のステップを行う必要があります。HRMVEC特有のアッセイプロトコルの違いを以下に概説します。

  1. スクラッチ創傷アッセイ
    1. EGMの代わりに10%FBS微小血管内皮細胞培地で細胞を培養します。
    2. 20,000細胞/ウェルを播種します。
    3. 細胞を一晩中飢餓にしないでください。
    4. スクラッチを行った後、培地をEBMと2%FBSではなく、5%FBSを含む基底内皮細胞培地に変更します。
  2. 2D培養HRMVECの免疫細胞化学
    1. EGMの代わりに10%微小血管内皮細胞培地で細胞を培養します。
    2. 細胞を一晩中飢餓にしないでください。
    3. 治療の直前に培地をEBM+2%FBSではなくEBM+5%FBSに変更してください。
  3. スフェロイドスプラウトアッセイ
    1. EGMの代わりに10%FBSを含む微小血管内皮細胞培地で、ぶら下がっている滴として細胞を播種します。
  4. 3Dコラーゲンマトリックス中のスフェロイドの免疫細胞化学
    1. EGMの代わりに10%FBSを含む微小血管内皮細胞培地で、ぶら下がっている滴として細胞を播種します。

結果

移行アッセイでは、t = 0 hの時点で取得された画像を徹底的に調べて、完全に形成された細胞単分子膜の存在がシステムによって正確に検出されることを確認することが重要です(図1B)。さらに、スクラッチボーダーの明瞭さと真直度を確認する必要があります(図1B)。無細胞領域には、破片がほとんどないはずです。アッセイの最後に、例えば25 ng/mL VEGFをポジティブコントロールとして刺激したグループは、元のスクラッチ領域で成功した移動を示すはずです(図1B)。技術的な問題の事例は、細胞の増殖が不均一である、二重の引っかき傷、または引っかき傷の境界のうねりとして現れる場合があります(図1C)。さらに、ネガティブコントロール(EBM刺激サンプル)とポジティブコントロール(VEGFサンプル)との間に実質的なダイナミックレンジを確立することが重要です(図1D)。この実験設定では、12時間後にRWDが25%増加することを最適な範囲と見なしています(図1D)。技術的に問題のあるアッセイでは、ポジティブコントロールとネガティブコントロールが正しく分離せず、ダイナミックレンジが低いことを示しています(図1E)。

カバースリップ上のHUVECの免疫細胞化学的染色を蛍光顕微鏡で可視化し、染色の成功を検証(図1F)。細胞の大部分を調査し、スライドの特徴的な領域を特定することが重要です。染色特異性は、非特異的結合を排除するために二次抗体のみで処理したコントロールスライドを使用して評価します(図1F)。特異的な染色シグナルは、標的タンパク質の既知の細胞内局在に従って批判的に検討する必要があります。私たちは、成功した免疫染色プロトコルの指標として、コントロールサンプルにシグナルがないこととともに、細胞内局在パターンを使用します。

同様に、高品質のスフェロイドスプラウティングアッセイには、特定の側面を考慮する必要があります。この場合、品質は、アッセイの終了時に、例えばt = 24時間で評価されるべきです。顕微鏡で観察するコラーゲンマトリックスは均質性を示す必要があり、もろくなったりざらざらしたりしないようにする必要があります(図2B)。ネガティブコントロールとして基礎培地のみで刺激されたスフェロイドと、ポジティブコントロールとして25 ng/mL VEGFで刺激されたスフェロイドは、明確に区別できるはずです(図2B)。さらに、スフェロイドはゲル内に浮遊し、地面に落下して分散しないようにするため、品質が低いことを示します(図2C)。この問題は、混合物の滴定中のコラーゲンの冷却が不十分であること、またはpHの滴定が過剰または不足していることから生じることがよくあります(図2C)。ウェルごとに最低10個のスフェロイドが、各ウェルでイメージング可能である必要があります。ネガティブコントロール(EBM刺激サンプル)は中程度のベースライン発芽率を示す必要がありますが、ポジティブコントロールとして機能するVEGFは、コントロールと比較してRSLを理想的には2倍または3倍にします(図2D、左のグラフ)。芽の数も同様のダイナミックレンジを示すはずです(図2D、右のグラフ)。技術的に次善のアッセイでは、コントロール間のこのダイナミックレンジは示されないため、データの誤った解釈につながる可能性があります(図2E)。

アナログ染色から2D染色、蛍光顕微鏡下でのスライドの検査、および染色された構造の批判的評価は、染色を成功させるために非常に重要です(図2F)。構造の細胞局在と、コントロールと比較したシグナル強度が理解できれば、染色は成功したと想定できます。

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図1:生細胞イメージングスクラッチ創傷移動アッセイ(A)スクラッチ創傷移動アッセイのスキーム。(B)t = 0 hおよびt = 12 hでの高品質の技術的複製を示す画像。細胞は、ポジティブコントロールとして機能するように25 ng/mL VEGFで刺激されています。(C)不適切なスクラッチまたはダブルスクラッチによるt = 0hでの2つの低品質のテクニカルレプリケートの例。(D)成功した引っかき傷移動アッセイの結果。25 ng/mL VEGF で刺激したポジティブコントロールと基礎培地で処理したばかりのネガティブコントロールの正しい分離を、t = 12 h のバイオリンプロットによってさらに可視化しました。データには、グループごとに 7 〜 8 回のテクニカルレプリケートが含まれます。(E)失敗したスクラッチ創傷移行アッセイを強調する例示的な結果。25 ng/mL VEGF で刺激したポジティブコントロールと基礎培地で処理したばかりのネガティブコントロールの最適でない分離を、t = 12 h のバイオリンプロットで可視化しました。データには、グループごとに 7 〜 8 回のテクニカルレプリケートが含まれます。(F)カバーガラスに播種し、DAPI、ファロイジン、およびVEGF-R2について染色したHUVECの例示的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:スフェロイドスプラウティングアッセイ。 (A)スフェロイド発芽アッセイのスキーム。(B)t = 24時間における終了時の理想的なテクニカルアッセイのネガティブコントロール(基礎培地刺激スフェロイド)およびポジティブコントロール(VEGF 25ng/mL刺激スフェロイド)を示す画像。左の画像は、損傷したスフェロイドがプレートの底に落下したため、スフェロイド本体が緩み、発芽速度が異常に向上している様子を示しています。右の画像は、コラーゲンが目立つカラーパッチで可視化されており、アッセイの品質を大幅に損なう非常に不均一な環境を作り出しています。(D)ネガティブコントロールとポジティブコントロールの間の良好なダイナミックレンジで成功したアッセイのRSL(左のグラフ)とスプラウトの数(右のグラフ)の分析。データはバイオリンプロットを使用して視覚化され、グループごとに10〜25個の回転楕円体が含まれています。(E)ネガティブコントロールとポジティブコントロールの間のダイナミックレンジが最適でない技術的に問題のあるアッセイのRSL(左のグラフ)とスプラウトの数(右のグラフ)の分析。データはバイオリンプロットを使用して視覚化され、グループごとに10〜25個の回転楕円体が含まれています。(F)DAPI、ファロイジン、およびVEGF-R2.cについて染色したスフェロイド発芽アッセイからのHUVECの例示的な画像

補足ファイル1:メトセル原液の調製方法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:SpheroidCount.ijmプラグイン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このレポートでは、 in vitroで血管新生を研究するための機能的および分子的な読み出しを備えたさまざまな手法を紹介しました。

マイグレーションアッセイは、ウェットラボ作業のあらゆる分野で使用される確立された技術です。スクリーニングおよび用量反応実験に適した96ウェルフォーマット、WoundMakerツールによって作成された標準化された再現性のある創傷サイズ、最大24時間のタイムラプスイメージングによる移動動態を観察する機会、および自動画像定量化ソフトウェアを活用するために、市販のライブセルイメージングアプローチを選択しました。しかし、血管新生解析ソフトウェアを搭載したライフセルイメージングシステムが研究室や中核施設に存在する必要があります。特定の生細胞イメージング顕微鏡または他の特別な装置を必要としない多数の代替実験装置が確立されている10。

私たちの経験に基づいて、HUVECやその他の血管内皮細胞タイプはコントラストが悪い傾向があり、顕微鏡ソフトウェアによる自動読み出しを妨げる可能性があるため、アナライザーの設定を最適化することが重要です。この問題に対処するために、追加の蛍光染色ステップ(例えば、生細胞染色)を導入することができます。生細胞イメージングシステムは、このような染色や、目的のタンパク質を追跡するためのマルチカラー染色をサポートします。このアッセイの大きな制限の1つは、細胞の移動と増殖の分化が必ずしも簡単ではなく、アッセイ結果が両方のプロセスの組み合わせを表していることです。この研究で使用されたライブセルイメージングソリューションは、相対創傷密度(RWD)を導入することにより、この問題に対処しようとします。スクラッチ領域で従来使用されていた合流点とは対照的に、RWD はスクラッチ領域内の合流点を外側のスクラッチ領域に対して評価します。スクラッチ領域への移動は、細胞の移動によりスクラッチ領域外のコンフルエンスを同時に減少させるとともに、内部のコンフルエンスを増加させることでRWDを上昇させます。逆に、細胞増殖は傷のある領域の外側のコンフルエンスも増加させ、それによってRWDを減少させます。これを、最終的な読み出しに対する拡散の影響を軽減するための戦略的な分析アプローチとして認識することが重要です。この問題に対処するためには、補完的な増殖アッセイが必要になるかもしれません。あるいは、マイトマイシンCなどの細胞周期阻害剤をアッセイに添加して、増殖をブロックすることもできます。これらの阻害剤を用いたプロトコールの実施は、アッセイのダイナミックレンジを縮小することなく目的の効果を達成するために、各ラボで慎重に最適化する必要があります。さらに、各ウェルのスキャン頻度を増やすことにより、このセットアップは、そのような詳細な追跡が特に興味深い場合に、個々のレベルで移動する細胞を正確に追跡するための簡単に実装可能な機会を提供します。

生細胞イメージングマイグレーションアッセイは、スケーラビリティと自動化された偏りのない解析の利点を示していますが、私たちの以前の研究では、血管新生のより複雑な詳細を捕捉するスフェロイドスプラウティングアッセイの能力が強調されました。これには、先端細胞と茎細胞の形成、細胞-マトリックス相互作用、および解糖スイッチ12などの基本的な側面が含まれる。アッセイの再現性を保証するには、コラーゲンマトリックスの調製に経験を積む必要があります。この過程でのpHや温度の変動は結果に影響を与える可能性があるためです。さらに、分析は手動で行われます。したがって、画像分析には時間がかかり、バイアスのリスクを抑えます。バイアスの導入を防ぐためには、解析中に条件を適切にマスキングすることが不可欠です。この懸念に対処するために、私たちは最近、スプラウティングアッセイの分析における潜在的なバイアスを特定して軽減するためのニューラルネットワークベースのアプローチを提案しました17。 結論として、結果を検証するための最良のアプローチは、両方のアッセイを組み合わせることです。ただし、2D設定と3D設定の異なる性質により違いが生じる可能性があることを認識することが重要です12。

2Dおよび3D のin vitro 血管新生アッセイには幅広い選択肢があるため、他の方法と比較した提示されたアッセイの長所と短所を考慮することが重要です。例えば、引っかき傷アッセイは、プラスチック皿上の2D水平移動に焦点を当て、ボイデンチャンバーアッセイは、「アウターチャンバー」内の化学誘引剤を含むメッシュインサートを介した垂直移動を特徴付けます。スクラッチ創傷アッセイは、その簡単なセットアップと読み出しに基づいて、特に96ウェルフォーマットでのハイスループット実験を可能にし、高い再現性を提供するだけでなく、実験を視覚化してタイムラプスを実施する可能性を提供します。残念ながら、スクラッチ創傷アッセイの欠点は、増殖と遊走を区別するのが難しいこと、接着細胞が必要であること、および創傷メーカーツールがない場合、不均等なスクラッチによるばらつきが高くなることです。Boyden Chamber Assayの読み出しは、運動性細胞18 に対する可溶性物質の走化性効果を測定する利点があり、浸潤と移動の両方を強調します。残念なことに、欠点は、アッセイの再現性が乏しく、分散が大きいこと、細胞の動きを視覚化できないこと、シグナルを得るために必要な移動細胞の数が多いこと、非常に長くて精巧なセットアップと読み出し、さらにはタイムラプス設定の機会がないことである19。

スフェロイドスプラウティングアッセイは、内皮細胞の3Dゲルマトリックスへのスプラウティングを定量化し、一方、チューブ形成アッセイは、ゲルマトリックス20の表面上の細胞チューブの形成を特徴付ける。スプラウティングアッセイには、細胞のマトリックスへの浸潤、ならびに増殖および移動を特徴付けるという利点があります。欠点は、滴定されたコラーゲンゲルの分散が高いことと、これに基づいてスフェロイドの品質が損なわれることです。チューブ形成アッセイの利点は、(サイトカインに依存)明確な時間後に血管チューブが形成され、アプローチが容易であることです。不利な点は、細胞の浸潤の欠如と、マトリゲル自体が管形成に及ぼす影響である21。

提示された実験はすべてHUVECを使用して行われました。異なる起源(例えば、マクロ血管とマイクロ血管)の血管内皮細胞の挙動に大きな違いが存在することはよく知られている22,23。したがって、他の血管内皮細胞株での実験結果を検証する必要があるかもしれません。実験設定は、HRMVECがより高いFBS濃度を必要とするという事実を除いて、ヒト網膜微小血管内皮(HRMVECS)に移すことができました。一方、一般的に使用されるウシ大動脈内皮細胞株(BAEC)は、基礎発芽率が高すぎるため、スフェロイド発芽アッセイには使用できませんでした。

提示された両方のアッセイは、それらが単一の細胞タイプに限定されるという制限を共有しています。in vivoでの血管新生が複雑な多細胞プロセスであることを考えると、この重要な側面はどちらのアッセイでも正確に捉えられません。両方のアッセイの共培養バリエーションが開発されており、特にスフェロイド発芽アッセイに焦点を当てており、最近10,24が議論されています。あるいは、関連するin vivo血管新生モデルでデータを直接検証することも、実行可能な選択肢となります。 この目的のために確立されたアッセイには、酸素誘発性網膜症(OIR)25のマウスモデル、レーザー誘起脈絡膜新生血管(Laser-CNV)モデル26、およびプラグアッセイ27が含まれる。

全体として、2D生細胞イメージング移動アッセイと3Dスフェロイドスプラウティングアッセイは、提示された分子解析ツールと組み合わせることで、血管新生研究のための堅牢なプラットフォームを提供し、血管新生コミュニティ内で広く認識されています。これらのアッセイをその後の in vivo 解析と組み合わせて所見を検証することで、特定の血管新生関連の問題を調査するための強固な基盤が得られます。

開示事項

著者は、このプロジェクトに利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者は、Sophie Krüger と Gabriele Prinz の優れた技術サポートに感謝します。スフェロイドの芽を定量化するためのImageJプラグインを開発したSebastian Maier氏と、フライブルク大学病院医学部IのLighthouse Core FacilityであるLighthouse Core FacilityのIncuCyteシステムの使用に感謝します。グラフィックは biorender.com で作成されました。この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B]、フライブルク大学アルベルト・ルートヴィヒス大学[Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.]、Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.]、German Cancer Consortium [CORTEX fellowship for Clinician Scientists to J.R.]、Volker Homann Stiftung [to J.N.+F.B.]、Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburge.V.」[P.L.へ]

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)'2-フラグメントジャクソンIR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 ラットテールCorning354236
Collagenase DRoche 
内皮細胞基礎培地ザCC-3156EBM
内皮細胞増殖培地ロンザCC-3162EGM
エチレンジアミン四酢酸 Serva11290.02EDTA
ウシ胎児血清Bio&SELLS 0615FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooledLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates ザルトリウス4379
インキュサイト S3 生細胞解析システムザルトリウス
メトセルシグマm-0512
微小血管内皮細胞培地 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHカール ロスP031.2
ファロイジン-フルオレセイン イソチオシアネート標識 (0.5 mg/mL メタノール)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial CellsCell SystemsACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlueInvitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
組換えヒト血管内皮成長因子PeproTech100-20VEGF
スクエアシャーレGreiner688102
TrizolQiagen79306
トリプシンPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (モノクローナル)サーモフィッシャーサイエンティフィック インクB.309.4
WoundMakerザルトリウス4493
11088858001ロン

参考文献

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