このプロトコルは、ブタから副甲状腺を調達するための迅速かつ非致死的な方法を提示します。この手順は、麻酔によるブタの準備、片側胸腺回収、胸腺内副甲状腺の ex vivo 同定と抽出の 3 つの主要なステップで構成されます。
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この記事について
サマリー
要約
副甲状腺機能低下症は、多くの場合、外科的合併症に起因し、カルシウムの恒常性を著しく破壊し、障害症状を引き起こします。現在の治療法では緩和効果は限定的であり、副甲状腺移植などの代替療法の必要性が浮き彫りになっています。この研究では、ブタから生体ドナー副甲状腺を調達するための簡単な方法を紹介し、移植研究、特に異種移植の分野への応用の可能性を秘めています。この手順には、麻酔によるブタの準備、片側胸腺回収、胸腺内副甲状腺の ex vivo 同定と抽出という 3 つの重要なステップが含まれます。このプロトコルではランドレース豚を利用しており、倫理的な治療と術後の回復を保証する手順が施されています。副甲状腺の抽出に成功し、その後の分析を通じてその生存率と完全性を確認しました。組織上清中のPTHレベルは1,000 pg / mLを超え、免疫蛍光染色により副甲状腺と胸腺組織が区別され、手順の信頼性が検証されました。このプロトコルは、ブタから副甲状腺を調達するための迅速で非致死的かつ倫理的に健全な方法を提供し、ブタと人間の解剖学的違いに対処します。これは、副甲状腺機能低下症の研究と異種移植に重要な意味を持つ持続可能なアプローチを提供します。
概要
このプロトコルは、ブタから副甲状腺を調達するための迅速かつ非致死的な方法を提示します。パラホルモン分泌不足を特徴とする副甲状腺機能低下症は、カルシウム恒常性を著しく破壊します1.この状態は、主に副甲状腺摘出術または甲状腺摘出術後の外科的合併症であり、無力症、慢性疼痛、頻脈、発作、さらには末期腎疾患などの症状として現れます2。時折、まれな自己免疫疾患または遺伝性疾患から発生します。現在の治療法、主にカルシウムとビタミンDの経口補給または組換えパラトホルモンは、疲労やうつ病などの全身症状を部分的にしか緩和しません3,4。重度の副甲状腺機能低下症の潜在的な治療法としての副甲状腺同種移植の必要性が高まっていることは、統一された移植プロトコルの確立の必要性を強調しています 5,6,7,8,9。しかし、副甲状腺移植に関する前臨床研究は依然として限られており、標準化された動物モデルも不足しています。さらに、異種移植分野10,11における最近の後押しは、特に内分泌細胞療法12,13の分野における異種移植の臨床応用への関心を高めている。しかし、副甲状腺異種移植のブタモデルは、ブタの副甲状腺組織の同定が複雑であるため、困難です。したがって、副甲状腺異種移植をさらに発展させるために、ブタから副甲状腺を回収するための再現性があり、持続可能で倫理的な技術を提供する必要があります。
通常、甲状腺の後ろに4つの副甲状腺がある人間とは異なり、ブタは、ほとんどの場合、胸腺の頭蓋部分にある2つの副甲状腺を持っています。ブタの副甲状腺の位置を特定することを目的とした以前の研究は、ex vivo同定のための致死的方法または蛍光色素ベースの技術のいずれかに依存していましたが、これは異種移植で実装するのが難しい可能性があります14,15,16。ここでは、ブタ胸腺の回収と透過照明を使用した副甲状腺のex vivo同定という2つの重要なステップに基づいて、異種移植に適したシンプルで非致死的な技術を提案します。この技術は、移植だけでなく、副甲状腺生理学の研究にも役立つ可能性があります。
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プロトコル
すべての動物実験は、リール大学の動物倫理委員会によって承認されました (参照 #20491-20190219161313)。
1.豚の麻酔
- 最初の切開の 30 分前にブプレノルフィン (0.015 mg/kg、筋肉内) を投与し、術前鎮痛を提供します。
- ケタミン(50mg/kg)とキシラジン(3mg/kg)を筋肉内注射して鎮静を誘導します。5%イソフルランを吸入 で 3〜5分間投与し、麻酔を深めます。
- まぶたの閉鎖反射と嚥下反射をチェックして、麻酔の深さを評価します。ブタを挿管し、手術台に仰臥位で配置します。麻酔維持のために吸入によりイソフルラン濃度を2%に下げます。
- ポータブルマルチパラメータ動物用モニターを使用して心拍数と酸素飽和度を継続的に監視し、処置全体を通じて最適な麻酔深度と生理学的安定性を確保します。
2. 関心のある分野の博覧会
- 顎下領域から胸骨まで続く頸部を剃り、細心の注意を払って洗浄します。
- 消毒石鹸を塗布し、続いてクロルヘキシジンを塗布して、無菌の野を確保します。全体を完全に乾かします。
- 外科的介入のために前頸部領域を隔離するために滅菌ドレープを配置します。
3.ブタ胸腺への曝露
- メスを使用して、白い頸部ラインに沿って垂直に10cmの切開を行います。メッツェンバウムはさみでその領域を注意深く解剖し、甲状腺前の筋肉を分離し、明確な手術野を作成します。
- 舌骨筋と甲状腺軟骨の間に自己保持レトラクターを配置して、結合組織の解剖を容易にし、胸腺を露出させます。
注意: 怪我を防ぐために、気管に過度の圧力をかけないでください。 - 胸腺の頭蓋部分を徐々に露出させ、迷走神経、内頸静脈、総頸動脈を含む頸動脈鞘から慎重に分離します。
注:怪我を防ぐために、電気凝固を使用して止血を達成します。
4.ブタ胸腺の回収
- 解放されたら、通常5〜8 cmの胸腺の頭蓋部分を抽出します。
- 抽出した胸腺を等張生理食塩水ですすぎ、副甲状腺の識別を容易にします。
注: このステップは、副甲状腺の独特の質感の視覚化と区別を強化するために非常に重要です
5. 胸腺内副甲状腺のex vivoでの同定
- 副甲状腺の識別を容易にするために、胸腺組織をそっと平らにします。
注:副甲状腺は、特に周囲の組織と比較して、独特の質感を示します。副甲状腺の線維性被膜はより硬く、エンドウ豆に似た大きさです。 - 光源を使用して、透過照明 によって 副甲状腺を識別します。
注:副甲状腺を取り巻く血管系ははっきりと見え、その分化を助ける必要があります。 - カプセルを慎重に切除し、副甲状腺全体を抽出します。デリケートな取り扱いにはデバキー鉗子を使用し、正確な解剖にはメッツェンバウムハサミを使用します。腺を周囲の胸腺組織から分離します。
- 単離した副甲状腺を冷蔵液に入れ、4°Cに維持して、その後の処置のために生存率を維持します。
- さらに処理するために組織をパラフィンに埋め込みます。
6.外科的閉鎖と覚醒
- 副甲状腺の回収に続いて、手術部位を層状に閉じます。吸収性縫合糸を使用して筋肉と皮下組織を縫合します。非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
- 豚を徐々に麻酔から離乳させます。意識を取り戻したら、ブタに術後すぐに合併症がないか監視します。
- 術後プロトコルに従って鎮痛薬と抗生物質を投与します(ブプレノルフィン0.03 à 0.05 mg / kgおよびクラモキシル15 mg / kgを48時間)。獣医師の監督下で回復のために豚を飼育施設に戻します。
7. 免疫染色プロトコル
- パラフィン包埋サンプルから脱パラフィン化および脱水を実行します:キシレン5分間、キシレン10分間、100%エタノール5分間、90%エタノール7分間30、70%エタノール7分間30、50%エタノール5分間、蒸留水5分間、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)5分間。
- サンプルをクエン酸緩衝液pH 6で650 Wで9分間電子レンジで加熱することにより、抗原回収を行います。サンプルをバッファー中で20分間冷却します。PBSで5分間3回すすぎます。
- Dakoペンで囲んだサンプルを、タンパク質ブロック溶液とともに室温で20分間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。
- サンプルを1%ウシ血清アルブミン(BSA)で希釈した一次抗体(PTH抗体(H-7)、マウスIgG-α-ヒト、sc-398856、1:100)とともに4°Cで一晩インキュベートします。PBSで5分間2回洗浄します。
- 1%ウシ血清アルブミンで希釈した二次抗体(Alexa Fluor 488、ヤギαマウス、A11001、1:500)を室温で1時間30分間インキュベートします。PBSで2回、二重蒸留水で5分間1回洗浄します。
- DAPI溶液でスライドをマウントし、スライドを4°Cで保存します。
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結果
この研究の主な結果には、在来種ブタから副甲状腺を抽出することに成功し、その後の分析を行い、その生存率と完全性を確認することが挙げられます。その結果をまとめると、以下のとおりです。副甲状腺組織の同定は、透過照明 によって 術中に確認されました(図1A)。抽出後、組織の2つの小さなサンプルを収集しました(それぞれ約10%)。1つのサンプルを1 mLのDMEM-F12培地の皿プレートでみじん切りにしました。みじん切り後、上清から1 mLを採取し、術中PTHアッセイでPTHレベルを評価した(図1C)。組織の副甲状腺の性質が確認された場合、上清中のレベルは通常1000 pg / mLを超えます。
もう一方のサンプルは、組織学とさらなる免疫染色のために4%パラホルムアルデヒドで一晩固定されました。副甲状腺は、エタノールの濃度を上昇させて徐々に脱水し、次にキシレンで除去し、最後にパラフィンに包埋しました。それぞれ厚さ5μmの連続組織切片をミクロトームを使用して...
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ディスカッション
このプロトコルは、ブタの副甲状腺調達のための迅速かつ非致死的な方法を提示します。プロトコル内の重要なステップには、ブタ胸腺を局在化して、さらなる ex vivo 調査のための完全な回収を確実にすることが含まれます。胸腺が摘出されると、透過照明を使用して副甲状腺を簡単に識別できます。
この技術の主な課題の 1 つは、私たちのプロトコルがブタと人間の PTG 位置の解剖学的違いを回避するため、副甲状腺摘出術に関連する人間の手術習慣に依存しないようにする必要があることです。副甲状腺が甲状腺の後ろにある人間とは異なり、ブタでは、副甲状腺は胸腺の頭蓋部分に埋め込まれています17。さらに、ブタには通常、人間に見られる 4 つの副甲状腺が 2 つしかありません。別の制限は、豚間の解剖学的多様性に起因します。片側副甲状腺が1つしかない人もいれば、異所性副甲状腺を持つ人もいます18。さらに、副甲状腺は胸腺内に閉じ込められ...
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謝辞
フランス糖尿病学会と医学研究財団の支援と研究資金に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 22G ショート末梢カテーテル | Smiths Medical | 5060 | |
| ベーシックセット II、クレープ | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (buprénorphine) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| 使い捨てメス | Swann-Morton | 0510 | |
| 電極スパチュラ | Erbe | 21191-002 | |
| 電気外科用ジェネレーター BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| 移動式ルアーロックチップ付き重力輸液3方弁 | ケアフュージョン | A64-3V | |
| 電極用ボタン2つ付き スリムライン | Erbe | 20190-065 | |
| イソフルラン漏斗充填気化器 | Supera 麻酔 | VAP3000 | |
| イソラン (イソフルラン) | Axience | ||
| ケタミドール (kéタミン) | Axience | ||
| Light Ceiling Double | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb 二酸化炭素吸収剤 | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| ミクロトーム | LEICA RM2255 | ||
| ミラー | Opticlar | 600.020 | |
| 酸素濃縮器 | DeVilbiss | 525KS | |
| Paxman (キシラジン) | Virbac | ||
| ポータブルマルチパラメータ獣医モニター | Mindray | IPM 10 | |
| 再利用可能な喉頭鏡ハンドル | Opticlar | 600.080 | |
| 小動物麻酔人工呼吸器 | ッドマーク | 91806001 | |
| 塩化ナトリウム注射 Viaflo | Baxter | ||
| 手術器具 | Kohler medizintechnik | ||
| 手術台 | Vetinox | TA700005 | |
| 気管チューブ | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| 材料および試薬 | |||
| DMEM F-12 培地 | ThermoFischer | 11320033 | |
| Parathormone 抗体 | SantaCruz | sc-398856 | |
| 術中迅速 pth アッセイ | Beckman Coulter | A16972 |
参考文献
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