ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

DNA二本鎖切断(DSB)は、細胞がこれらの病変を修復するために複数のDSB修復(DSBR)経路を進化させたため、特に毒性のあるDNA損傷¹のクラスです。DSBRの4つの主要なメカニズムは、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、ミクロホモロジー媒介端結合(MMEJ)、および一本鎖アニーリング(SSA)^である2,3。DSBR経路は、健康な組織の発達と生理機能の維持に貢献し、がんなどの疾患から保護します。さらに、これらの修復メカニズムは、精密腫瘍学における低分子モジュレーターの開発に治療の可能性を秘めています。例えば、MMEJ修復経路の極めて重要な酵素であるDNAポリメラーゼθ(Polθ)を標的とすることは、がんにおけるHR欠損を伴う合成致死性により、関心を集めています⁴。

したがって、DSBRを理解することには広範な臨床的意味があり、すべての主要なDSBR経路の活性を測定できる機能的な細胞アッセイが必要です⁵。アッセイは、遺伝的および薬理学的調査の両方に適しており、関心のある細胞モデル全体に展開可能でなければなりません。低分子創薬の取り組みをサポートするためには、アッセイは高感度で滴定可能であり、ターンアラウンドが速く、化合物スクリーニングに適したハイスループットフォーマットにスケーラブルである必要があります。

一般に、DSBRは、細胞ゲノムに安定して組み込まれた蛍光ベースのレポーターアッセイシステムを使用して以前に測定されてきました⁶。しかし、染色体DSBRの生理学的再現は明確な利点ですが、そのようなアッセイは、レポーターが統合されたホストモデルに限定され、フローサイトメトリーによる労働集約的なサンプル調製と分析を利用し、創薬活動に必要なすべての重要な機能であるスループット、ターンアラウンドタイム、頑健性、感度が制限されています。

ここでは、4つの主要なDSBR経路の評価を可能にする一連のDSBRレポーターアッセイについて説明します。レポーターアッセイ基質のスイートは、 図1 に概説されており、最近の出版物⁷でさらに説明されています。それらは染色体外であり、単純な一過性トランスフェクションによって細胞への導入を可能にし、特定のDSBRメカニズムとの関与によって再構成する必要があるナノルシフェラーゼレポーター遺伝子⁸の取り込みは、感度、堅牢性、およびスケーラビリティを生み出します。このプロトコルには、以下のDSBRレポーター基質バリアントが含まれています(図1)。

切除非依存性MMEJ: この線状基質は、切除されたDNA末端⁹を模倣する一本鎖DNA(ssDNA)のオーバーハングを有するコア二本鎖DNA(dsDNA)領域から構成されている。ssDNA領域の末端にある4つのヌクレオチドマイクロホモロジーは、レポーター遺伝子の開始コドンをコードしています。この基質をMMEJで修復すると、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)が回復します。

切除依存性MMEJ: N末端レポーター遺伝子のエクソンは、8つの塩基対(bp)マイクロホモロジーに隣接する終止コドンを含むセグメントによって中断されます。MMEJを介した修復の前に、無傷のレポーター遺伝子を回復させるためには、核溶解性末端切除が必要です。

鈍的NHEJ: レポーター遺伝子はN末端とC末端に分割され、C末端はプロモーターの上流に配置されます。DSBは EcoRVを使用して産生され、レポーター遺伝子部分の再結合とレポーターORFの修復の両方に対して、NHEJによる直接ライゲーション(末端処理なし)が必要です。

ノンブラントNHEJ: DSBはイントロン内に位置し、制限酵素の選択に応じて、凝集性または非凝集性の末端を持ちます。NHEJによるこの基質の修復には、ライゲーションの前に末端処理が必要です。

長いテンプレートHR: レポーター遺伝子のN末端エクソンは、制限部位を含むDNAセグメントによって中断され、元のレポーター遺伝子配列の22 bpを置き換えます。この配列を復元するために、HRによる修復では、C末端エクソンの下流に配置された2.5キロベース(kb)の相同性テンプレートを使用します。

短いテンプレートHR: DSBを生成するために必要な制限部位は、ネイティブレポーター遺伝子配列の一部を置き換え、インフレーム停止コドンを導入します。長いテンプレートバージョンと同様に、このHR基質は、レポーターORFの正確な修復と修復のために、ダウンストリームの相同性テンプレート(360 bp)を必要とします。

SSAの この基質には、レポーター遺伝子のN末端エクソン内に位置する早期終止コドンが含まれています。この終止コドンの除去と無傷のレポーター遺伝子配列の回復には、相同性の整列に先立って双方向の長距離切除を行うSSAによる修復が必要です。

DSBの生成には、レポーター基質の一部をI-SceIで分解することができます(図1)。これにより、切除依存性MMEJ、非平滑NHEJ、長テンプレートHRおよびSSAレポーターに非凝集性末端を持つ線形基質が生成されます。ショートテンプレートHRレポーター基質では、単一のI-SceI部位の消化により凝集性末端が生成されます。非鈍的NHEJ、切除依存性MMEJ、長鎖テンプレートHRおよびSSAプラスミドもHindIIIで消化でき、相補的な凝集末端が生成されます。

レポーターアッセイ基質の作製のためのプロトコルを提供し、アッセイの実施方法を説明し、低分子への滴定可能な応答、細胞の効力、オンターゲット活性、および経路選択性の評価など、DSBRの定量にそれらをどのように使用できるかについて詳しく説明します。

1. レポーター基質の調製と品質管理(QC)

注:レポーター基質をコードするプラスミドは、標準的な 大腸菌 株(DH5αおよび誘導体など)で増殖し、プラスミド単離によって回収することができます。プラスミドの詳細(サイズと抗生物質耐性)は、 表1 および 図1に記載されています。

図1:染色体外NanoLucベースのDSBRレポーターアッセイの概略図。 DSBRレポーター基質の概略図(各ソースプラスミド内の位置、メイン配列の特徴、パスウェイ特異的修復後の最終レイアウトなど)。切除非依存性のMMEJ基質コアは、 XhoI/HindIIIによる消化によりソースプラスミドから切り出され、その後、MMEJの基質を生成するためにキャップを両端にライゲーションする必要があります。鈍的NHEJレポーター基質は、ソースプラスミドから EcoRVで除去することにより生成されます。切除依存性MMEJ、非平滑性NHEJ、長鎖テンプレートHR、およびSSAレポーター基質は、I-SceI(非凝集性末端を産生)または HindIII(凝集性末端を産生)のいずれかを使用してソースプラスミドを直鎖化することによって生成されます。ショートテンプレートHRレポーター基質は、I-SceIを使用してソースプラスミドを直鎖化することによって生成されます(これにより凝集性末端が生成されます)。標的DSBR経路による各レポーター基質の修復は、機能的なNanoLucをコードする無傷のナノルシフェラーゼORFを再構成します。この図は、Rajendra et ^al.7 から採用されました。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。NanoLuc = ナノルシフェラーゼ;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング;ORF = オープンリーディングフレーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 切除非依存性MMEJレポーター基質(図 1 そして 図2A-C)
   1. ssDNA/dsDNAキャップの調製(図2A)
      1. 表2にリストされている4つのオリゴヌクレオチドをアニーリングバッファー(20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl in molecular biology grade water)に個別に再懸濁して、100 μMのストック溶液を生成します。
      2. ss/dsDNAキャップのアニーリング
         1. ステップ1.1.1.1の左キャップ用の長鎖オリゴヌクレオチドと短鎖オリゴヌクレオチド(100 μMストック溶液)をそれぞれ50 μLずつ0.2 mLチューブに混合します。
         2. 右キャップオリゴヌクレオチドについても繰り返します。
         3. サーモサイクラーを使用して、各オリゴヌクレオチドミックスを99°Cで5分間インキュベートし、その後1°C/minで10°Cまでランプダウンします。
            注:これにより、焼きなましされた左右のキャップが生成されます。
      3. (QC、オプション)電気泳動によるオリゴヌクレオチドアニーリングの検証
         1. ステップ1.1.1.2の各生成物100 ng、ステップ1.1.1.1の個々のオリゴヌクレオチド、および20%アクリルアミド-トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)ゲル中の低分子量DNAラダーを200 Vで80分間電気泳動。
         2. ssDNAとdsDNAの両方を可視化するための適切な蛍光DNA色素を含むTBEランニングバッファーでゲルを少なくとも10〜15分間染色します。
         3. ゲルドキュメンテーションシステム上で蛍光を可視化します(図2A)。
            注:手順1.1.1.3.1から1.1.1.3.3は、キャップが正しくアニーリングされたことを確認するために使用されます。左のキャップと右のキャップの見かけのサイズは、それぞれ~120 bpと~175 bpである必要があります。
   2. レポーター基板コアの精製(図2B)
      1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 HindIII4 μLおよび XhoI.®4 μL(各酵素に4 U/μgプラスミド)および10xバッファー20 μLと混合します。総容量を200 μLに戻し、再蒸留水(ddH₂O)で37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
         注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。
      2. 消化反応を80°Cで20分間インキュベートし、制限酵素を加熱不活化します。
      3. ステップ1.1.2.2の反応ミックスに、40 μLのアルカリホスファターゼ(2 U/μgプラスミド)と27 μLの10xバッファーを加えます。37°Cで2時間インキュベートし、プラスミドを脱リン酸化します。
         注:必要に応じて反応をスケールアップまたはスケールダウンします。
      4. 60 μLの6倍ローディング色素をステップ1.1.2.3の反応液に加えます。蛍光dsDNA染色を含む1.5%(w / v)アガロース-トリス-アセテート-EDTA(TAE)ゲルで、120 Vで2.5時間、またはバンドが十分に分解されるまで、高分子量DNAラダーと並んで電気泳動します。
      5. ゲルドキュメンテーションシステムで蛍光を可視化します(図2B)。
      6. レポーターコアフラグメント(~1.5 kb)を、ベクターバックボーン(~2.5 kb)で汚染しないように注意しながら、清潔なメスを使用してゲルから取り出します。
      7. ゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従ってレポーターコアフラグメントを抽出します。
      8. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
   3. ssDNA/dsDNAキャップによるレポーター基質コアのライゲーションと最終レポーター基質の精製(図2C)
      1. ステップ 1.1.2.7 のレポーターコアフラグメント 30 μg と、ステップ 1.1.2 でアニーリングした左右のキャップ 3.85 μL (キャップコア DNA のモル比約 6:1)、10x リガーゼバッファー 30 μL 、T4 DNA リガーゼ 1.5 μL (20 U/μg DNA) を混合します。反応液の総量をddH₂Oで300 μLにし、16 °Cで一晩インキュベートして、レポーターコアフラグメントにキャップをライゲーションします。
         注:必要に応じて反応をスケールアップまたはスケールダウンします。
      2. (QC、オプション)ステップ1.1.3.1で得られた生成物200 ngを、レポーター基質コアおよび高分子量DNAラダーと並べて、蛍光dsDNA染色を含有する0.7%(w/v)アガロース-TAEゲルに120 Vで少なくとも1.5時間電気泳動します。ライゲーションされた製品に対応するバンドが、ライゲーションされていないレポーター基板コアよりもわずかに遅い速度で移動することを確認します(図2C)。
         注:このQCステップは、レポーターコアフラグメントへのキャップのライゲーションが正しく行われたことを確認するためのものです。
      3. ステップ1.3.1の消化反応からDNAを精製します。推奨される方法(ビーズベースまたはカラムベースの方法など)を使用し、製造元の指示に従ってください。
         注:精製ステップ1.1.3.3は、非結紮キャップの存在を大幅に減少させます。
   4. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
2. 鈍いNHEJレポーター基質の作製(図1 、 図2D、E)
   1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 EcoRV(5 U/μgプラスミド)5 μLおよび10xバッファー20 μLと混合します。ddH₂Oで総容量を200 μLにし、37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
      注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。
   2. 消化反応を65°Cで20分間インキュベートし、制限酵素を加熱不活化します。
   3. ステップ1.2.2の反応液に50 μLの6倍ローディング色素を加えます。蛍光dsDNA染色剤を含む1.5%(w / v)アガロース-TAEゲル中で、高分子量DNAラダーと並んで電気泳動し、120 Vで2時間、またはバンドが十分に分解されるまで。
   4. ゲルドキュメンテーションシステムで蛍光を可視化します(図2D)。
   5. レポーター基質(~1.7 kb)を清潔なメスでゲルから取り出し、ベクター骨格(~2.6 kb)で汚染しないように注意します。
   6. ゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従ってレポーターコアフラグメントを抽出します(図2E)。
   7. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
3. I-SceI系レポーター基材の作製(図1)
   注:これらの基質には、切除依存性MMEJ(図2F)、非鈍的NHEJ(図2G)、長テンプレートHR(図2H)、短テンプレートHR(図2I)、およびSSA(図2J)が含まれます。
   1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 I-SceI(プラスミド5 U/μg)50 μLおよび10xバッファー60 μLと混合します。ddH₂Oで総容量を600 μLにし、37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
      注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。非鈍的NHEJ、切除依存性MMEJ、長鎖テンプレートHRおよびSSAプラスミドも HindIIIで消化することができ、これにより補完的な凝集末端が生成されます。
   2. 消化反応を65°Cで20分間インキュベートし、 I-SceIを熱不活化します。 HindIIIを消化に使用した場合は、このステップで温度を80°Cに設定します。
   3. ステップ1.3.2の不活化消化反応から、製造元の指示に従って、好ましい方法(ビーズベースまたはカラムベースの方法など)を使用してDNAを精製します。
   4. DNA濃度と純度A_260/280)を分光光度法で測定します。
4. レポーター基材の品質管理
   1. 蛍光dsDNA染色を含む0.7%(w/v)アガロース-TAEゲル中の高分子量DNAラダーと並んでレポーター基質200 ngを電気泳動し、120 Vで2時間またはバンドが十分に分解されるまで。元のアンカットレポータープラスミドをコントロールとして一緒にロードします。
   2. 各レポーター基板について、正しいサイズで定義されたバンドが観察されていることを確認します(表1および図2F-Jを参照)。

図2:DSBRレポーター基質生成のゲル電気泳動分析。(A-C) 切除に依存しないMMEJレポーター基質の生成に必要な中間体および最終構築物のゲル電気泳動分析からの代表的な画像。パネル(A)と(C)の隣接する画像は、同じゲルからのものです。無関係なレーンは省略されています。(D,E)ソースプラスミド、EcoRV消化製品、および鈍的NHEJレポーター基質の生成に必要なゲル抽出最終コンストラクトのゲル電気泳動分析からの代表的な画像。(F-J)I-SceI消化レポーター基質のソースプラスミドおよび直鎖状DSBRコンストラクトのゲル電気泳動分析からの代表的な画像:切除依存性MMEJ、非鈍的NHEJ、長テンプレートHR、短テンプレートHR、SSA。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. DSBRレポーター基質の一過性トランスフェクション

注:アッセイの実験ワークフローの概要といくつかの潜在的な順列を 図3に示します。以下のプロトコルは、HEK-293細胞を用いた実験を例に説明しており、HEK-293細胞をレポーター基質と逆トランスフェクトします。以下の数値は、プレートごとに使用するウェルの数に応じて拡大または縮小できます。次のステップは、1 つの 96 ウェルプレートで実施するアッセイについて計算されています。その他の考慮事項については、ディスカッションを参照してください。

図3:DSBRレポーターアッセイの実験ワークフロー。 目的の細胞に、直鎖状化されたDSBR基質(特定のDNA修復イベントを通じて修復が必要なNanoLuc ORFをコードする)とFireflyプラスミド(トランスフェクション制御)をトランスフェクションします。その後、トランスフェクションの6-24時間後に、Nano-Gloデュアルルシフェラーゼ試薬を添加した後、Firefly発光とNanoLuc発光を順次読み取ることができます。コアステップへの順列の例(水色のボックス内に表示)を使用して、遺伝的調節(ノックアウト、ノックダウン、または過剰発現)または薬理学的治療が細胞内のDSBR経路の習熟度にどのように影響するかをテストできます。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。NanoLuc = ナノルシフェラーゼ;WT = 野生型;KO = ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. (オプション)レポーターアッセイに対する化合物の影響を評価する場合は、ビヒクルに溶解した化合物(ジメチルスルホキシド[DMSO]など)を、事前定義された実験レイアウトに従って96ウェルプレートのウェルに分注します。すべてのウェルで車両濃度を正規化します。
   注: テクニカル レプリケートをお勧めします。コントロールウェルを含めます(例:車両のみ)。
2. 1.5 mLチューブで、ステップ1.1、1.2、または1.3で生成したFireflyコントロールプラスミド(コントロールルシフェラーゼ)およびNanoLuc DSBRレポーター基質(レポータールシフェラーゼ)を500 μLのトランスフェクションバッファーで希釈します。1 ×^{10 6} 細胞あたり0.66 μgのコントロールルシフェラーゼプラスミドを使用してください。使用するNanoLuc DSBRレポーター基板の量については 、表3 を参照してください。
   注:レポータールシフェラーゼを構成的に発現するポジティブコントロールプラスミドは、装置のセットアップやトランスフェクション条件の検証、またはレポータールシフェラーゼ自体に対する非特異的な影響の確認に使用できます。出発点として、1 ×^{10 6} 細胞あたり0.1 μgのレポータールシフェラーゼプラスミドと0.66 μgのコントロールルシフェラーゼプラスミドを推奨します。
3. ステップ2.2で希釈したDNAに脂質ベースのトランスフェクション試薬をメーカー推奨の比率で添加し(例:1:2、 材料表に記載の試薬には1:2、μg DNA:μL試薬)、短時間ボルテックスしてよく混合し、室温で10分間インキュベートします。
4. トリプシン処理により細胞を採取し、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む新鮮な培地に再懸濁し、カウントします。
5. 3細胞×10⁶ 細胞を15 mLチューブに移し、8.5 mLの培地に再懸濁します。
6. ステップ2.3のDNAトランスフェクションミックスを細胞懸濁液に加え、反転して数回混合します。
7. ウェルあたり80μLの細胞懸濁液(約2.7×10⁴ 細胞)をプレートします。
   注:細胞とDNAトランスフェクションミックスを含む懸濁液は、手動でピペッティングするか、またはハイスループット実験用の自動リキッドハンドラーを使用してプレートに分注できます。
8. 37°C/5% CO₂ で24時間インキュベートします。

3. 発光の検出

1. 試薬の調製
   1. レポーター(NanoLuc)およびコントロール(Firefly)ルシフェラーゼ試薬の調製および添加については、製造元の指示に従ってください。これらの試薬は、両方のルシフェラーゼ(それぞれフリマジンおよび5'-フルオロルシフェリン)の基質を提供します。
   2. コントロールルシフェラーゼ試薬を調製します。製造元の指示に従って再構成し、ルシフェラーゼ基質が完全に溶解するまで反転して混合します。
   3. 製造元の指示に従って、新しいレポータールシフェラーゼ試薬を準備します。80 μL/ウェルを添加し、1:100の比率で適切な量のアッセイバッファーに基質を添加するために必要な試薬の量を計算します(ルシフェラーゼ基質:バッファー)。96ウェルプレート1枚につき、88 μLのルシフェラーゼ基質を8,800 μLのバッファーに希釈し、反転して混合します。
      注意: これらの数量には、約10%の超過分が含まれています。再構成したコントロールルシフェラーゼ試薬は、メーカーの指示に従って保存し、将来使用することができます。レポータールシフェラーゼ試薬は、使用するたびに新鮮に調製する必要があります。
2. コントロールおよびレポータールシフェラーゼ(96ウェルプレート)からの発光の連続検出
   1. プレートとルシフェラーゼ試薬を室温に戻します。
   2. ウェルあたり80 μLのコントロールルシフェラーゼ試薬を添加します。
   3. プレートをオービタルシェーカーで450rpmで3分間振とうします。
   4. コントロールルシフェラーゼ発光シグナルを発光プレートリーダーで測定します。
      注:580 nm(80 nmバンドパスフィルター)またはウェルあたりの全発光での読み取り発光。この発光は、トランスフェクション効率と細胞密度の尺度として使用され、試験処理によって引き起こされる細胞毒性についても情報を得ることができます。
   5. レポータールシフェラーゼ試薬をウェルあたり80 μL添加します。
      注:この試薬は、コントロールルシフェラーゼを阻害します。また、レポータールシフェラーゼの基質も含まれています。
   6. プレートをオービタルシェーカーで450rpmで3分間振とうします。
   7. プレートを室温で7分間休ませます。
   8. レポータールシフェラーゼ発光シグナルを発光プレートリーダーで測定します。
      注:470 nm(80 nmバンドパスフィルター)でのリード発光、またはウェルあたりの全発光。この発光は、目的のDSBR経路によって修復されたレポーター基質の量に関する情報を提供します。
   9. ルミネセンス測定値をエクスポートして、ダウンストリーム分析に役立てます。

4. データ分析

1. レポータールシフェラーゼ(NanoLuc)発光シグナルを、同じウェル由来のコントロールルシフェラーゼ(Firefly)発光シグナルで割ってアッセイシグナルを算出する。式 (1) に示すように、その計算をすべての井戸に適用します。
   (1)
2. コントロールウェルのアッセイシグナルの平均を計算します(例:ビヒクルのみ)。
3. 式(2)を使用して、テストウェルのアッセイシグナルをコントロールウェル平均に正規化し、ウェルあたりの修復(%)を計算します。
   (2)
4. (オプション、カーブフィッティング)複数の化合物用量を試験する場合は、計算された修復(%)を化合物濃度に対してプロットし、非線形回帰モデルを使用して用量反応曲線を適合させます。この曲線は、後続の EC₅₀ 補間に使用します。

各レポーターアッセイの修復は、同じ手順を使用して検出および定量できます。細胞内の同族修復経路による基質の正しい修復は、NanoLucをコードする無傷の機能的なORFを再構成します。この発光信号は、プレートリーダーを使用して検出できます。

Fireflyルシフェラーゼをコードするインタクトプラスミドとの同時トランスフェクションは、トランスフェクションコントロールとして機能します。このコントロールには 2 つの目的があります。まず、遺伝的または薬理学的手段によるDSBRの変調によってNanoLucシグナルが乱されない必要があるため、NanoLucシグナルをに正規化するための標準を提供します。次に、細胞周期の調節、転写/翻訳への影響、一般的な毒性など、ルシフェラーゼシグナルに影響を与えるオフターゲット細胞摂動の指標を提供することができます。

NanoLucとFireflyの比率は、修理の代理読み出しとして機能します。発光値は、同じウェル内から2つのルシフェラーゼシグナルを正規化することにより、エクスポートおよび分析できます。遺伝的摂動研究(例えば、野生型とKO型の比較、または非標的型と標的siRNAの比較)の場合、修復は通常、親サンプル(野生型細胞または非標的制御siRNAで処理された細胞)に対して正常化されます。薬理学的調節の場合、化合物処理されたサンプルからの値は、ビヒクル処理によって生成された値に正規化されます。

説明されているレポータースイートの完全な検証が最近公開されました7。DSBRの遺伝的および薬理学的調節の特性評価を例示するデータを図4に示します(7から適応)。PolθはMMEJの主要なメディエーターであり、この酵素の喪失または阻害は細胞のMMEJを特異的にアブリューブすると予測されています3,10。Polθをコードする遺伝子であるPOLQをノックアウトした細胞株を用いて11、切除に依存しないMMEJレポーターアッセイは、MMEJが実際にほぼ完全に抑制されていることを実証しています。NanoLuc と Firefly の発光シグナルを評価すると、観察された修復欠陥は NanoLuc シグナル(レポーター基板によってエンコード)の減少によって引き起こされ、Firefly シグナル(制御)は乱されていないことが示されています(図 4A-C)。対照的に、鈍端のNHEJレポーターを使用したNHEJ習熟度の評価では、POLQノックアウトがレポーター基質の修復を阻害しないことが示されました(図4D-F)。これらの遺伝データは、MMEJを介した修復におけるPolθの特異的な役割を裏付けています。これらの観察結果は、最近報告されたPolθのポリメラーゼドメインの非常に強力で特異的な阻害剤であるART55812,13(図4G)で薬理学的に完全に再現されており、MMEJの滴定可能な阻害が観察されます。これは、ホタルシグナルではなくNanoLucの特異的な減少に由来します(図4H)。さらに、遺伝データと一致して、NHEJへの影響はありません(図4I、J)。これらのデータを総合すると、これらのレポーターを使用してDSBR経路の遺伝的調節を特徴付け、低分子の細胞効力と標的/経路特異性を示す方法が浮き彫りになります。

図4:MMEJおよびNHEJレポーターシグナルに対するPolθの遺伝的ノックアウトおよび薬理学的阻害の影響。 eHAP1 WTおよびPOLQ(-) 細胞に、Fireflyコントロールプラスミドと(A-C)切除非依存性MMEJレポーターまたは(D-F)平滑末端NHEJレポーターをトランスフェクションしました。MMEJまたはNHEJ修復の割合は、トランスフェクション後24時間でDMSO処理されたコントロールに正規化された、ホタル発光に対するNanoLuc発光の比率です。データは±3つの生物学的複製の平均SEMを表し、それぞれが平均8回の技術的複製です。HEK-293細胞にFireflyコントロールプラスミドと(G,H)切除非依存性MMEJレポーターまたは(I,J)鈍末端NHEJレポーターをトランスフェクションし、Polθポリメラーゼ阻害剤ART558で処理しました。修復の割合は、トランスフェクションの24時間後におけるDMSO処理されたコントロールに正規化された、ホタル発光に対するNanoLuc発光の比率です。(G)および(I)における個々の発光シグナルの阻害割合をDMSO処理コントロールと比較して計算し、それぞれ(H)および(J)に示した。データは、2 つの生物学的レプリケートの平均 ± SEM を表し、それぞれが平均 4 回のテクニカルレプリケートを表します。この図は、Rajendra et al.7 から採用されました。略語:NanoLuc = Nanoluciferase;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;WT = 野生型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:RAD51阻害剤CAM833によるHRレポーターシグナルの阻害 (A)HEK-293細胞に長テンプレートHRレポーター基質であるホタルルシフェラーゼコントロールプラスミドをトランスフェクションし、RAD51阻害剤CAM833で処理した14。NanoLucおよびFireflyの発光は、トランスフェクションの16時間後に読み取られました。HR修復の割合は、NanoLuc発光とFirefly発光の比率であり、DMSO処理されたコントロールに正規化されています。破線は、曲線EC50でのHR阻害率とCAM833濃度を示しています。データは、2 つの生物学的レプリケートの平均 ± SEM を表し、それぞれが平均 4 回のテクニカルレプリケートを表します。(B)(A)の個々の発光シグナルの阻害率は、DMSO処理されたコントロールに対して計算されました。破線は、3.33 μM CAM833(EC50)でのNanoLucおよびFirefly阻害率を示しています。CAM833濃度が10μM≥でのホタルシグナルの減少は、高用量での化合物毒性を示しています。しかし、NanoLucシグナルの減少は、Fireflyシグナルが影響を受けない濃度で観察され、CAM833がオンターゲットHR阻害を誘導することを示唆しています。この図は、Rajendra et al.7 から採用されました。略語:NanoLuc = Nanoluciferase;HR = 相同組換え。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:レポーター基質プラスミド。 略語:DSB =ダブルストランドブレーク;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング;Kan = カナマイシン;アンプ=アンピシリン。

表2:切除非依存性MMEJレポーター基質を作製するためのキャップ用オリゴヌクレオチド。 略語:ssDNA =一本鎖DNA;dsDNA = 二本鎖DNA;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動。マイクロホモロジーには下線が引かれています。

表3:NanoLucレポーター基質およびFirefly制御ルシフェラーゼプラスミド(HEK-293、96ウェルプレートフォーマット)の一過性トランスフェクションのDNA量。 略語:MMEJ =マイクロホモロジー媒介エンドジョイン。NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング。

D.G.、E.R.、B.M.、A.G.、S.J.B.、G.C.M.S.、H.M.R.R.は、Artios Pharma Ltd.の従業員および株主であり、G.C.M.S.はAstraZeneca PLCの株主であり、S.J.B.はArtios Pharma Ltd.の創設者であり、科学者であり、株主です。この研究で概説された一部の報告者について特許が出願されています（WO 2021/001647)。Promegaは、NanoLuc®テクノロジーと修飾NanoLuc®ポリヌクレオチドの供給源です。Artios Pharmaは、Promega社から修飾NanoLuc®ポリヌクレオチドの作製を承認されました。