ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

サマリー

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。

要約

DNA二本鎖切断(DSB)の修復は、ゲノムの安定性と細胞生存率の維持に重要です。細胞内のDSB修復(DSBR)は、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジーを介した末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)など、いくつかのメカニズムを介して媒介されます。細胞アッセイは、さまざまな刺激に応答したこれらの経路の習熟度と調節を測定するために不可欠です。

ここでは、細胞内の4つの主要なDSBR経路の1つによるナノルシフェラーゼレポーター遺伝子の再構成をそれぞれが測定する一連の染色体外レポーターアッセイを紹介します。目的の細胞に一過性トランスフェクションすると、ナノルシフェラーゼ(NanoLuc)発光を検出することにより、経路特異的レポーター基質の修復を24時間未満で測定できます。

これらの堅牢なアッセイは、定量性、感度、滴定性があり、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適しています。これらの特性は、DNA修復研究や創薬に幅広いアプリケーションを提供し、現在利用可能な細胞DSBRアッセイのツールキットを補完します。

概要

DNA二本鎖切断(DSB)は、細胞がこれらの病変を修復するために複数のDSB修復(DSBR)経路を進化させたため、特に毒性のあるDNA損傷¹のクラスです。DSBRの4つの主要なメカニズムは、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、ミクロホモロジー媒介端結合(MMEJ)、および一本鎖アニーリング(SSA)^である2,3。DSBR経路は、健康な組織の発達と生理機能の維持に貢献し、がんなどの疾患から保護します。さらに、これらの修復メカニズムは、精密腫瘍学における低分子モジュレーターの開発に治療の可能性を秘めています。例えば、MMEJ修復経路の極めて重要な酵素であるDNAポリメラーゼθ(Polθ)を標的とすることは、がんにおけるHR欠損を伴う合成致死性により、関心を集めています⁴。

したがって、DSBRを理解することには広範な臨床的意味があり、すべての主要なDSBR経路の活性を測定できる機能的な細胞アッセイが必要です⁵。アッセイは、遺伝的および薬理学的調査の両方に適しており、関心のある細胞モデル全体に展開可能でなければなりません。低分子創薬の取り組みをサポートするためには、アッセイは高感度で滴定可能であり、ターンアラウンドが速く、化合物スクリーニングに適したハイスループットフォーマットにスケーラブルである必要があります。

一般に、DSBRは、細胞ゲノムに安定して組み込まれた蛍光ベースのレポーターアッセイシステムを使用して以前に測定されてきました⁶。しかし、染色体DSBRの生理学的再現は明確な利点ですが、そのようなアッセイは、レポーターが統合されたホストモデルに限定され、フローサイトメトリーによる労働集約的なサンプル調製と分析を利用し、創薬活動に必要なすべての重要な機能であるスループット、ターンアラウンドタイム、頑健性、感度が制限されています。

ここでは、4つの主要なDSBR経路の評価を可能にする一連のDSBRレポーターアッセイについて説明します。レポーターアッセイ基質のスイートは、 図1 に概説されており、最近の出版物⁷でさらに説明されています。それらは染色体外であり、単純な一過性トランスフェクションによって細胞への導入を可能にし、特定のDSBRメカニズムとの関与によって再構成する必要があるナノルシフェラーゼレポーター遺伝子⁸の取り込みは、感度、堅牢性、およびスケーラビリティを生み出します。このプロトコルには、以下のDSBRレポーター基質バリアントが含まれています(図1)。

切除非依存性MMEJ: この線状基質は、切除されたDNA末端⁹を模倣する一本鎖DNA(ssDNA)のオーバーハングを有するコア二本鎖DNA(dsDNA)領域から構成されている。ssDNA領域の末端にある4つのヌクレオチドマイクロホモロジーは、レポーター遺伝子の開始コドンをコードしています。この基質をMMEJで修復すると、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)が回復します。

切除依存性MMEJ: N末端レポーター遺伝子のエクソンは、8つの塩基対(bp)マイクロホモロジーに隣接する終止コドンを含むセグメントによって中断されます。MMEJを介した修復の前に、無傷のレポーター遺伝子を回復させるためには、核溶解性末端切除が必要です。

鈍的NHEJ: レポーター遺伝子はN末端とC末端に分割され、C末端はプロモーターの上流に配置されます。DSBは EcoRVを使用して産生され、レポーター遺伝子部分の再結合とレポーターORFの修復の両方に対して、NHEJによる直接ライゲーション(末端処理なし)が必要です。

ノンブラントNHEJ: DSBはイントロン内に位置し、制限酵素の選択に応じて、凝集性または非凝集性の末端を持ちます。NHEJによるこの基質の修復には、ライゲーションの前に末端処理が必要です。

長いテンプレートHR: レポーター遺伝子のN末端エクソンは、制限部位を含むDNAセグメントによって中断され、元のレポーター遺伝子配列の22 bpを置き換えます。この配列を復元するために、HRによる修復では、C末端エクソンの下流に配置された2.5キロベース(kb)の相同性テンプレートを使用します。

短いテンプレートHR: DSBを生成するために必要な制限部位は、ネイティブレポーター遺伝子配列の一部を置き換え、インフレーム停止コドンを導入します。長いテンプレートバージョンと同様に、このHR基質は、レポーターORFの正確な修復と修復のために、ダウンストリームの相同性テンプレート(360 bp)を必要とします。

SSAの この基質には、レポーター遺伝子のN末端エクソン内に位置する早期終止コドンが含まれています。この終止コドンの除去と無傷のレポーター遺伝子配列の回復には、相同性の整列に先立って双方向の長距離切除を行うSSAによる修復が必要です。

DSBの生成には、レポーター基質の一部をI-SceIで分解することができます(図1)。これにより、切除依存性MMEJ、非平滑NHEJ、長テンプレートHRおよびSSAレポーターに非凝集性末端を持つ線形基質が生成されます。ショートテンプレートHRレポーター基質では、単一のI-SceI部位の消化により凝集性末端が生成されます。非鈍的NHEJ、切除依存性MMEJ、長鎖テンプレートHRおよびSSAプラスミドもHindIIIで消化でき、相補的な凝集末端が生成されます。

レポーターアッセイ基質の作製のためのプロトコルを提供し、アッセイの実施方法を説明し、低分子への滴定可能な応答、細胞の効力、オンターゲット活性、および経路選択性の評価など、DSBRの定量にそれらをどのように使用できるかについて詳しく説明します。

プロトコル

1. レポーター基質の調製と品質管理(QC)

注:レポーター基質をコードするプラスミドは、標準的な 大腸菌 株(DH5αおよび誘導体など)で増殖し、プラスミド単離によって回収することができます。プラスミドの詳細(サイズと抗生物質耐性)は、 表1 および 図1に記載されています。

図1:染色体外NanoLucベースのDSBRレポーターアッセイの概略図。 DSBRレポーター基質の概略図(各ソースプラスミド内の位置、メイン配列の特徴、パスウェイ特異的修復後の最終レイアウトなど)。切除非依存性のMMEJ基質コアは、 XhoI/HindIIIによる消化によりソースプラスミドから切り出され、その後、MMEJの基質を生成するためにキャップを両端にライゲーションする必要があります。鈍的NHEJレポーター基質は、ソースプラスミドから EcoRVで除去することにより生成されます。切除依存性MMEJ、非平滑性NHEJ、長鎖テンプレートHR、およびSSAレポーター基質は、I-SceI(非凝集性末端を産生)または HindIII(凝集性末端を産生)のいずれかを使用してソースプラスミドを直鎖化することによって生成されます。ショートテンプレートHRレポーター基質は、I-SceIを使用してソースプラスミドを直鎖化することによって生成されます(これにより凝集性末端が生成されます)。標的DSBR経路による各レポーター基質の修復は、機能的なNanoLucをコードする無傷のナノルシフェラーゼORFを再構成します。この図は、Rajendra et ^al.7 から採用されました。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。NanoLuc = ナノルシフェラーゼ;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング;ORF = オープンリーディングフレーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 切除非依存性MMEJレポーター基質(図 1 そして 図2A-C)
   1. ssDNA/dsDNAキャップの調製(図2A)
      1. 表2にリストされている4つのオリゴヌクレオチドをアニーリングバッファー(20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl in molecular biology grade water)に個別に再懸濁して、100 μMのストック溶液を生成します。
      2. ss/dsDNAキャップのアニーリング
         1. ステップ1.1.1.1の左キャップ用の長鎖オリゴヌクレオチドと短鎖オリゴヌクレオチド(100 μMストック溶液)をそれぞれ50 μLずつ0.2 mLチューブに混合します。
         2. 右キャップオリゴヌクレオチドについても繰り返します。
         3. サーモサイクラーを使用して、各オリゴヌクレオチドミックスを99°Cで5分間インキュベートし、その後1°C/minで10°Cまでランプダウンします。
            注:これにより、焼きなましされた左右のキャップが生成されます。
      3. (QC、オプション)電気泳動によるオリゴヌクレオチドアニーリングの検証
         1. ステップ1.1.1.2の各生成物100 ng、ステップ1.1.1.1の個々のオリゴヌクレオチド、および20%アクリルアミド-トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)ゲル中の低分子量DNAラダーを200 Vで80分間電気泳動。
         2. ssDNAとdsDNAの両方を可視化するための適切な蛍光DNA色素を含むTBEランニングバッファーでゲルを少なくとも10〜15分間染色します。
         3. ゲルドキュメンテーションシステム上で蛍光を可視化します(図2A)。
            注:手順1.1.1.3.1から1.1.1.3.3は、キャップが正しくアニーリングされたことを確認するために使用されます。左のキャップと右のキャップの見かけのサイズは、それぞれ~120 bpと~175 bpである必要があります。
   2. レポーター基板コアの精製(図2B)
      1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 HindIII4 μLおよび XhoI.®4 μL(各酵素に4 U/μgプラスミド)および10xバッファー20 μLと混合します。総容量を200 μLに戻し、再蒸留水(ddH₂O)で37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
         注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。
      2. 消化反応を80°Cで20分間インキュベートし、制限酵素を加熱不活化します。
      3. ステップ1.1.2.2の反応ミックスに、40 μLのアルカリホスファターゼ(2 U/μgプラスミド)と27 μLの10xバッファーを加えます。37°Cで2時間インキュベートし、プラスミドを脱リン酸化します。
         注:必要に応じて反応をスケールアップまたはスケールダウンします。
      4. 60 μLの6倍ローディング色素をステップ1.1.2.3の反応液に加えます。蛍光dsDNA染色を含む1.5%(w / v)アガロース-トリス-アセテート-EDTA(TAE)ゲルで、120 Vで2.5時間、またはバンドが十分に分解されるまで、高分子量DNAラダーと並んで電気泳動します。
      5. ゲルドキュメンテーションシステムで蛍光を可視化します(図2B)。
      6. レポーターコアフラグメント(~1.5 kb)を、ベクターバックボーン(~2.5 kb)で汚染しないように注意しながら、清潔なメスを使用してゲルから取り出します。
      7. ゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従ってレポーターコアフラグメントを抽出します。
      8. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
   3. ssDNA/dsDNAキャップによるレポーター基質コアのライゲーションと最終レポーター基質の精製(図2C)
      1. ステップ 1.1.2.7 のレポーターコアフラグメント 30 μg と、ステップ 1.1.2 でアニーリングした左右のキャップ 3.85 μL (キャップコア DNA のモル比約 6:1)、10x リガーゼバッファー 30 μL 、T4 DNA リガーゼ 1.5 μL (20 U/μg DNA) を混合します。反応液の総量をddH₂Oで300 μLにし、16 °Cで一晩インキュベートして、レポーターコアフラグメントにキャップをライゲーションします。
         注:必要に応じて反応をスケールアップまたはスケールダウンします。
      2. (QC、オプション)ステップ1.1.3.1で得られた生成物200 ngを、レポーター基質コアおよび高分子量DNAラダーと並べて、蛍光dsDNA染色を含有する0.7%(w/v)アガロース-TAEゲルに120 Vで少なくとも1.5時間電気泳動します。ライゲーションされた製品に対応するバンドが、ライゲーションされていないレポーター基板コアよりもわずかに遅い速度で移動することを確認します(図2C)。
         注:このQCステップは、レポーターコアフラグメントへのキャップのライゲーションが正しく行われたことを確認するためのものです。
      3. ステップ1.3.1の消化反応からDNAを精製します。推奨される方法(ビーズベースまたはカラムベースの方法など)を使用し、製造元の指示に従ってください。
         注:精製ステップ1.1.3.3は、非結紮キャップの存在を大幅に減少させます。
   4. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
2. 鈍いNHEJレポーター基質の作製(図1 、 図2D、E)
   1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 EcoRV(5 U/μgプラスミド)5 μLおよび10xバッファー20 μLと混合します。ddH₂Oで総容量を200 μLにし、37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
      注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。
   2. 消化反応を65°Cで20分間インキュベートし、制限酵素を加熱不活化します。
   3. ステップ1.2.2の反応液に50 μLの6倍ローディング色素を加えます。蛍光dsDNA染色剤を含む1.5%(w / v)アガロース-TAEゲル中で、高分子量DNAラダーと並んで電気泳動し、120 Vで2時間、またはバンドが十分に分解されるまで。
   4. ゲルドキュメンテーションシステムで蛍光を可視化します(図2D)。
   5. レポーター基質(~1.7 kb)を清潔なメスでゲルから取り出し、ベクター骨格(~2.6 kb)で汚染しないように注意します。
   6. ゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従ってレポーターコアフラグメントを抽出します(図2E)。
   7. DNAの濃度と品質(A_260/280)を分光光度法で測定します。
3. I-SceI系レポーター基材の作製(図1)
   注:これらの基質には、切除依存性MMEJ(図2F)、非鈍的NHEJ(図2G)、長テンプレートHR(図2H)、短テンプレートHR(図2I)、およびSSA(図2J)が含まれます。
   1. レポーターコアプラスミド100 μgを、 I-SceI(プラスミド5 U/μg)50 μLおよび10xバッファー60 μLと混合します。ddH₂Oで総容量を600 μLにし、37°Cで2時間から一晩インキュベートしてプラスミドを消化します。
      注:大量または少量の消化の場合は、反応を比例的にスケーリングします。非鈍的NHEJ、切除依存性MMEJ、長鎖テンプレートHRおよびSSAプラスミドも HindIIIで消化することができ、これにより補完的な凝集末端が生成されます。
   2. 消化反応を65°Cで20分間インキュベートし、 I-SceIを熱不活化します。 HindIIIを消化に使用した場合は、このステップで温度を80°Cに設定します。
   3. ステップ1.3.2の不活化消化反応から、製造元の指示に従って、好ましい方法(ビーズベースまたはカラムベースの方法など)を使用してDNAを精製します。
   4. DNA濃度と純度A_260/280)を分光光度法で測定します。
4. レポーター基材の品質管理
   1. 蛍光dsDNA染色を含む0.7%(w/v)アガロース-TAEゲル中の高分子量DNAラダーと並んでレポーター基質200 ngを電気泳動し、120 Vで2時間またはバンドが十分に分解されるまで。元のアンカットレポータープラスミドをコントロールとして一緒にロードします。
   2. 各レポーター基板について、正しいサイズで定義されたバンドが観察されていることを確認します(表1および図2F-Jを参照)。

図2:DSBRレポーター基質生成のゲル電気泳動分析。(A-C) 切除に依存しないMMEJレポーター基質の生成に必要な中間体および最終構築物のゲル電気泳動分析からの代表的な画像。パネル(A)と(C)の隣接する画像は、同じゲルからのものです。無関係なレーンは省略されています。(D,E)ソースプラスミド、EcoRV消化製品、および鈍的NHEJレポーター基質の生成に必要なゲル抽出最終コンストラクトのゲル電気泳動分析からの代表的な画像。(F-J)I-SceI消化レポーター基質のソースプラスミドおよび直鎖状DSBRコンストラクトのゲル電気泳動分析からの代表的な画像:切除依存性MMEJ、非鈍的NHEJ、長テンプレートHR、短テンプレートHR、SSA。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. DSBRレポーター基質の一過性トランスフェクション

注:アッセイの実験ワークフローの概要といくつかの潜在的な順列を 図3に示します。以下のプロトコルは、HEK-293細胞を用いた実験を例に説明しており、HEK-293細胞をレポーター基質と逆トランスフェクトします。以下の数値は、プレートごとに使用するウェルの数に応じて拡大または縮小できます。次のステップは、1 つの 96 ウェルプレートで実施するアッセイについて計算されています。その他の考慮事項については、ディスカッションを参照してください。

図3:DSBRレポーターアッセイの実験ワークフロー。 目的の細胞に、直鎖状化されたDSBR基質(特定のDNA修復イベントを通じて修復が必要なNanoLuc ORFをコードする)とFireflyプラスミド(トランスフェクション制御)をトランスフェクションします。その後、トランスフェクションの6-24時間後に、Nano-Gloデュアルルシフェラーゼ試薬を添加した後、Firefly発光とNanoLuc発光を順次読み取ることができます。コアステップへの順列の例(水色のボックス内に表示)を使用して、遺伝的調節(ノックアウト、ノックダウン、または過剰発現)または薬理学的治療が細胞内のDSBR経路の習熟度にどのように影響するかをテストできます。略語:DSBR =ダブルストランドブレーク修理。NanoLuc = ナノルシフェラーゼ;WT = 野生型;KO = ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. (オプション)レポーターアッセイに対する化合物の影響を評価する場合は、ビヒクルに溶解した化合物(ジメチルスルホキシド[DMSO]など)を、事前定義された実験レイアウトに従って96ウェルプレートのウェルに分注します。すべてのウェルで車両濃度を正規化します。
   注: テクニカル レプリケートをお勧めします。コントロールウェルを含めます(例:車両のみ)。
2. 1.5 mLチューブで、ステップ1.1、1.2、または1.3で生成したFireflyコントロールプラスミド(コントロールルシフェラーゼ)およびNanoLuc DSBRレポーター基質(レポータールシフェラーゼ)を500 μLのトランスフェクションバッファーで希釈します。1 ×^{10 6} 細胞あたり0.66 μgのコントロールルシフェラーゼプラスミドを使用してください。使用するNanoLuc DSBRレポーター基板の量については 、表3 を参照してください。
   注:レポータールシフェラーゼを構成的に発現するポジティブコントロールプラスミドは、装置のセットアップやトランスフェクション条件の検証、またはレポータールシフェラーゼ自体に対する非特異的な影響の確認に使用できます。出発点として、1 ×^{10 6} 細胞あたり0.1 μgのレポータールシフェラーゼプラスミドと0.66 μgのコントロールルシフェラーゼプラスミドを推奨します。
3. ステップ2.2で希釈したDNAに脂質ベースのトランスフェクション試薬をメーカー推奨の比率で添加し(例:1:2、 材料表に記載の試薬には1:2、μg DNA:μL試薬)、短時間ボルテックスしてよく混合し、室温で10分間インキュベートします。
4. トリプシン処理により細胞を採取し、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む新鮮な培地に再懸濁し、カウントします。
5. 3細胞×10⁶ 細胞を15 mLチューブに移し、8.5 mLの培地に再懸濁します。
6. ステップ2.3のDNAトランスフェクションミックスを細胞懸濁液に加え、反転して数回混合します。
7. ウェルあたり80μLの細胞懸濁液(約2.7×10⁴ 細胞)をプレートします。
   注:細胞とDNAトランスフェクションミックスを含む懸濁液は、手動でピペッティングするか、またはハイスループット実験用の自動リキッドハンドラーを使用してプレートに分注できます。
8. 37°C/5% CO₂ で24時間インキュベートします。

3. 発光の検出

1. 試薬の調製
   1. レポーター(NanoLuc)およびコントロール(Firefly)ルシフェラーゼ試薬の調製および添加については、製造元の指示に従ってください。これらの試薬は、両方のルシフェラーゼ(それぞれフリマジンおよび5'-フルオロルシフェリン)の基質を提供します。
   2. コントロールルシフェラーゼ試薬を調製します。製造元の指示に従って再構成し、ルシフェラーゼ基質が完全に溶解するまで反転して混合します。
   3. 製造元の指示に従って、新しいレポータールシフェラーゼ試薬を準備します。80 μL/ウェルを添加し、1:100の比率で適切な量のアッセイバッファーに基質を添加するために必要な試薬の量を計算します(ルシフェラーゼ基質:バッファー)。96ウェルプレート1枚につき、88 μLのルシフェラーゼ基質を8,800 μLのバッファーに希釈し、反転して混合します。
      注意: これらの数量には、約10%の超過分が含まれています。再構成したコントロールルシフェラーゼ試薬は、メーカーの指示に従って保存し、将来使用することができます。レポータールシフェラーゼ試薬は、使用するたびに新鮮に調製する必要があります。
2. コントロールおよびレポータールシフェラーゼ(96ウェルプレート)からの発光の連続検出
   1. プレートとルシフェラーゼ試薬を室温に戻します。
   2. ウェルあたり80 μLのコントロールルシフェラーゼ試薬を添加します。
   3. プレートをオービタルシェーカーで450rpmで3分間振とうします。
   4. コントロールルシフェラーゼ発光シグナルを発光プレートリーダーで測定します。
      注:580 nm(80 nmバンドパスフィルター)またはウェルあたりの全発光での読み取り発光。この発光は、トランスフェクション効率と細胞密度の尺度として使用され、試験処理によって引き起こされる細胞毒性についても情報を得ることができます。
   5. レポータールシフェラーゼ試薬をウェルあたり80 μL添加します。
      注:この試薬は、コントロールルシフェラーゼを阻害します。また、レポータールシフェラーゼの基質も含まれています。
   6. プレートをオービタルシェーカーで450rpmで3分間振とうします。
   7. プレートを室温で7分間休ませます。
   8. レポータールシフェラーゼ発光シグナルを発光プレートリーダーで測定します。
      注:470 nm(80 nmバンドパスフィルター)でのリード発光、またはウェルあたりの全発光。この発光は、目的のDSBR経路によって修復されたレポーター基質の量に関する情報を提供します。
   9. ルミネセンス測定値をエクスポートして、ダウンストリーム分析に役立てます。

4. データ分析

1. レポータールシフェラーゼ(NanoLuc)発光シグナルを、同じウェル由来のコントロールルシフェラーゼ(Firefly)発光シグナルで割ってアッセイシグナルを算出する。式 (1) に示すように、その計算をすべての井戸に適用します。
   (1)
2. コントロールウェルのアッセイシグナルの平均を計算します(例:ビヒクルのみ)。
3. 式(2)を使用して、テストウェルのアッセイシグナルをコントロールウェル平均に正規化し、ウェルあたりの修復(%)を計算します。
   (2)
4. (オプション、カーブフィッティング)複数の化合物用量を試験する場合は、計算された修復(%)を化合物濃度に対してプロットし、非線形回帰モデルを使用して用量反応曲線を適合させます。この曲線は、後続の EC₅₀ 補間に使用します。

結果

各レポーターアッセイの修復は、同じ手順を使用して検出および定量できます。細胞内の同族修復経路による基質の正しい修復は、NanoLucをコードする無傷の機能的なORFを再構成します。この発光信号は、プレートリーダーを使用して検出できます。

Fireflyルシフェラーゼをコードするインタクトプラスミドとの同時トランスフェクションは、トランスフェクションコントロールとして機能します。このコントロールには 2 つの目的があります。まず、遺伝的または薬理学的手段によるDSBRの変調によってNanoLucシグナルが乱されない必要があるため、NanoLucシグナルをに正規化するための標準を提供します。次に、細胞周期の調節、転写/翻訳への影響、一般的な毒性など、ルシフェラーゼシグナルに影響を与えるオフターゲット細胞摂動の指標を提供することができます。

NanoLucとFireflyの比率は、修理の代理読み出しとして機能します。発光値は、同じウェル内から2つのルシフェラーゼシグナルを正規化することにより、エクスポートおよび分析できます。遺伝的摂動研究(例えば、野生型とKO型の比較、または非標的型と標的siRNAの比較)の場合、修復は通常、親サンプル(野生型細胞または非標的制御siRNAで処理された細胞)に対して正常化されます。薬理学的調節の場合、化合物処理されたサンプルからの値は、ビヒクル処理によって生成された値に正規化されます。

説明されているレポータースイートの完全な検証が最近公開されました⁷。DSBRの遺伝的および薬理学的調節の特性評価を例示するデータを図4に示します(⁷から適応)。PolθはMMEJの主要なメディエーターであり、この酵素の喪失または阻害は細胞のMMEJを特異的にアブリューブすると予測されています^3,10。Polθをコードする遺伝子であるPOLQをノックアウトした細胞株^{を用いて11}、切除に依存しないMMEJレポーターアッセイは、MMEJが実際にほぼ完全に抑制されていることを実証しています。NanoLuc と Firefly の発光シグナルを評価すると、観察された修復欠陥は NanoLuc シグナル(レポーター基板によってエンコード)の減少によって引き起こされ、Firefly シグナル(制御)は乱されていないことが示されています(図 4A-C)。対照的に、鈍端のNHEJレポーターを使用したNHEJ習熟度の評価では、POLQノックアウトがレポーター基質の修復を阻害しないことが示されました(図4D-F)。これらの遺伝データは、MMEJを介した修復におけるPolθの特異的な役割を裏付けています。これらの観察結果は、最近報告されたPolθのポリメラーゼドメインの非常に強力で特異的な阻害剤であるART558^12,13(図4G)で薬理学的に完全に再現されており、MMEJの滴定可能な阻害が観察されます。これは、ホタルシグナルではなくNanoLucの特異的な減少に由来します(図4H)。さらに、遺伝データと一致して、NHEJへの影響はありません(図4I、J)。これらのデータを総合すると、これらのレポーターを使用してDSBR経路の遺伝的調節を特徴付け、低分子の細胞効力と標的/経路特異性を示す方法が浮き彫りになります。

図4:MMEJおよびNHEJレポーターシグナルに対するPolθの遺伝的ノックアウトおよび薬理学的阻害の影響。 eHAP1 WTおよびPOLQ^(-) 細胞に、Fireflyコントロールプラスミドと(A-C)切除非依存性MMEJレポーターまたは(D-F)平滑末端NHEJレポーターをトランスフェクションしました。MMEJまたはNHEJ修復の割合は、トランスフェクション後24時間でDMSO処理されたコントロールに正規化された、ホタル発光に対するNanoLuc発光の比率です。データは±3つの生物学的複製の平均SEMを表し、それぞれが平均8回の技術的複製です。HEK-293細胞にFireflyコントロールプラスミドと(G,H)切除非依存性MMEJレポーターまたは(I,J)鈍末端NHEJレポーターをトランスフェクションし、Polθポリメラーゼ阻害剤ART558で処理しました。修復の割合は、トランスフェクションの24時間後におけるDMSO処理されたコントロールに正規化された、ホタル発光に対するNanoLuc発光の比率です。(G)および(I)における個々の発光シグナルの阻害割合をDMSO処理コントロールと比較して計算し、それぞれ(H)および(J)に示した。データは、2 つの生物学的レプリケートの平均 ± SEM を表し、それぞれが平均 4 回のテクニカルレプリケートを表します。この図は、Rajendra et ^al.7 から採用されました。略語:NanoLuc = Nanoluciferase;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;WT = 野生型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:RAD51阻害剤CAM833によるHRレポーターシグナルの阻害 (A)HEK-293細胞に長テンプレートHRレポーター基質であるホタルルシフェラーゼコントロールプラスミドをトランスフェクションし、RAD51阻害剤CAM833で処理した¹⁴。NanoLucおよびFireflyの発光は、トランスフェクションの16時間後に読み取られました。HR修復の割合は、NanoLuc発光とFirefly発光の比率であり、DMSO処理されたコントロールに正規化されています。破線は、曲線EC₅₀でのHR阻害率とCAM833濃度を示しています。データは、2 つの生物学的レプリケートの平均 ± SEM を表し、それぞれが平均 4 回のテクニカルレプリケートを表します。(B)(A)の個々の発光シグナルの阻害率は、DMSO処理されたコントロールに対して計算されました。破線は、3.33 μM CAM833(EC₅₀)でのNanoLucおよびFirefly阻害率を示しています。CAM833濃度が10μM≥でのホタルシグナルの減少は、高用量での化合物毒性を示しています。しかし、NanoLucシグナルの減少は、Fireflyシグナルが影響を受けない濃度で観察され、CAM833がオンターゲットHR阻害を誘導することを示唆しています。この図は、Rajendra et ^al.7 から採用されました。略語:NanoLuc = Nanoluciferase;HR = 相同組換え。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

レポーター基板		ソースプラスミド (サイズ(kb)、抵抗)	DSBの生成			最終レポーター基板の予想サイズ (kb)
切除非依存性MMEJ		4.0、菅	キャップのライゲーションにより3フィートテールを切除			1.6
切除依存性MMEJ		6.5、菅	I-SceI(非凝集性)、HindIII(凝集性)			6.5
ブラントNHEJ		4.3、菅	EcoRVによるプラスミドからの切除により鈍化が終了します			1.7
ノンブラントNHEJ		6.7、菅	I-SceI(非凝集性)、HindIII(凝集性)			6.5
長いテンプレートHR		9.2、菅	I-SceI(非凝集性)、HindIII(凝集性)			9.2
ショートテンプレートHR		9.3、アンペア	I-SceI(凝集性)			9.3
SSAの		9.5、菅	I-SceI(非凝集性)、HindIII(凝集性)			9.5

表1:レポーター基質プラスミド。 略語:DSB =ダブルストランドブレーク;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング;Kan = カナマイシン;アンプ=アンピシリン。

シーケンス (5'-3')			サプライヤー	浄化	機能
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			シグマ	ページ	左キャップ、長鎖オリゴヌクレオチド
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			シグマ	ページ	左キャップ、ショートオリゴヌクレオチド
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			シグマ	ページ	右キャップ、長鎖オリゴヌクレオチド
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			シグマ	ページ	右キャップ、ショートオリゴヌクレオチド

表2:切除非依存性MMEJレポーター基質を作製するためのキャップ用オリゴヌクレオチド。 略語:ssDNA =一本鎖DNA;dsDNA = 二本鎖DNA;MMEJ = マイクロホモロジー媒介エンドジョイン;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動。マイクロホモロジーには下線が引かれています。

レポーターアッセイ	NanoLucレポーター基質DNA(μg DNA/1x106 細胞)	ホタルコントロールルシフェラーゼプラスミド(μg DNA/1x106 細胞)
切除非依存性MMEJ	0.5	0.66
切除依存性MMEJ	1	0.66
ブラントNHEJ	0.5	0.66
ノンブラントNHEJ	0.5	0.66
長いテンプレートHR	1	0.66
ショートテンプレートHR	2	0.66
SSAの	1	0.66

表3:NanoLucレポーター基質およびFirefly制御ルシフェラーゼプラスミド(HEK-293、96ウェルプレートフォーマット)の一過性トランスフェクションのDNA量。 略語:MMEJ =マイクロホモロジー媒介エンドジョイン。NHEJ = 非相同端結合;HR = 相同組換え;SSA = 一本鎖アニーリング。

ディスカッション

ここでは、4つの主要なDSBR経路(HR、NHEJ、MMEJ、およびSSA^)の細胞能力を測定するための染色体外発光ベースのレポーターのスイートの生成と実装のためのプロトコルについて説明しました7。レポーター基質は、一過性トランスフェクションによって細胞に導入し、NanoLucルミネッセンスの高感度で堅牢なプレートベースの読み出しを使用してDSBR活性を評価するために使用できます。

レポーター基質の生成、細胞への基質のトランスフェクション、およびデータ解釈のいくつかの段階は、これらのアッセイを成功させるために重要です。レポーター基質の生成には標準的な分子生物学的手法が使用されますが、ゲル電気泳動でプロセスを可視化することで、トランスフェクション前に基質の最高品質と純度が保証されます。これらのアッセイは一過性トランスフェクションに依存しているため、これらの方法に共通の考慮事項が適用されます。これには、播種密度、トランスフェクション条件(試薬やDNA量を含む)の最適化、フォワードおよびリバーストランスフェクションフォーマットでの適合性の評価が含まれます。これらのレポーターアッセイは、さまざまなエレクトロポレーションおよびリポフェクションプロトコルで成功裏に実施されており、これらのアッセイを実行する前にオプションを十分に検討する必要があります。また、NanoLuc信号(レポーター基板)をFirefly信号(制御)に正規化して得られる複合修復信号だけでなく、NanoLucおよびFirefly信号の検査にも注意が必要です。アーティファクトは、Firefly信号の変化によって駆動される比率から発生する可能性があります。例えば、特異性の高い化合物を用いて用量反応モードでの阻害を評価すると、Fireflyシグナルを乱すことなくNanoLucシグナルを滴定可能な方法で抑制できるはずであり、これは安定しているはずです(図4G、H)。しかし、Fireflyの信号が摂動されている場合でも、Fireflyの信号が影響を受けない線量ウィンドウを特定することで、修復への有用な影響を判断できます(図5)。

最も頻繁に使用されるDSBRレポーターアッセイと比較して、これらの染色体外発光ベースのレポーターアッセイにはいくつかの明確な利点があります。DSBR経路は高度に保存されているため、細胞モデル間で細胞機構が異なる場合でも、アッセイはDSBRの習熟度と経路の選択を報告できます。これにより、最適な一過性トランスフェクション条件が事前に確立されている限り、ユーザーが関心のある任意のモデルに対してDSBRの評価が可能になります。

レポーター遺伝子としてナノルシフェラーゼを使用することは、DSBRレポーターアッセイで伝統的に使用されてきた蛍光オプションよりも利点もあります。NanoLucは成熟が早く、プレート^{リーダー8}を用いて発光を高感度に検出します。このフォーマットのDSBRレポーターアッセイは、基質修復の速度(レポーター基質がすぐに修復可能なDSB末端を持つ細胞にトランスフェクションされる)と相まって、工業創薬カスケードの一部として低分子をスクリーニングするために必要な迅速なターンアラウンドと定量的堅牢性に最適です。実際、私たちは最近、Polθポリメラーゼドメイン¹³の低分子阻害剤の同定に使用される発見カスケードにおける切除非依存性MMEJレポーターアッセイの実施について説明しました。

また、レポーターアッセイの実施には柔軟性があり、DSBRの遺伝的および薬理学的摂動に関する特定の問題に対処することができます(図3)。例えば、レポーター基質のトランスフェクションに先立ち、細胞に目的の遺伝子に対するsiRNAを48〜72時間トランスフェクションすることができる。あるいは、DSBR経路に対する遺伝子過剰発現の影響は、レポーター基質のトランスフェクションの24〜48時間前にプラスミドトランスフェクションを行うことで試験できます。薬理学的研究のために、本プロトコルは、低分子の使用を標準的なワークフローにどのように組み込むことができるかをすでに説明していますが、代替フォーマットには、プレインキュベーションまたはウォッシュアウトなどの化合物処理レジメンの変更が含まれる場合があります。

一過性トランスフェクションのスケーラビリティは、スクリーニングの前にレポーター基質のバッチトランスフェクションを実行する大規模なスクリーニングアプローチもサポートできます。さらに、トランスフェクションからリードアウトまでのアッセイの期間も変化させることができます。標準的な持続時間は16〜24時間ですが、一部のアッセイはわずか6時間⁷で読み出される場合があります。また、低分子やsiRNAによる毒性が細胞の生存率を損なう可能性があることも、アッセイ期間を決定する際に考慮する必要があります。

要約すると、この研究で概説され、最近の出版物⁷ で詳細に説明されているアッセイは、細胞のDSBR習熟度の迅速かつ堅牢な評価を提供します。それらは非常に感度が高く、滴定可能なため、遺伝学的研究と薬理学的研究の両方に適しています。重要なことは、レポーター基質は一過性トランスフェクションによって細胞に導入できるため、染色体DSBRレポーターのように安定した統合によって特定の細胞株に限定されるのではなく、目的のトランスフェクション可能な細胞モデルで利用できる可能性があるということです。しかし、これらのレポーター染色体外アッセイの明確な制限は、ゲノムへの統合の欠如が、DNA修復の生理学的、クロマチン化された状況、およびそれに関連する調節手がかりおよびオーケストレーション¹⁵を完全に再現しない可能性があることである。この目的のために、染色体外レポーターアッセイは、既存のDSBR評価法を補完し、基礎研究と創薬の両方に適したリソースのツールキットを拡大します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x TBE バッファー	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-アクリルアミドゲル	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE バッファー	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple	NEB	B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	DNAのビーズベースの精製用
南極ホスファターゼと10Xバッファー	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	プレートリーダー
Countess II 自動セルカウンター	サーモフィッシャー	AMQAX1000	セルカウンター
カスタムオリゴヌクレオチド	Sigma-Aldrich	カスタムオーダー	切除に依存しないMMEJ基質用。表 2 を参照してください。
D300e	Tecan	30100152	DMSOベースのコンパウンドディスペンサー
D300e D4+カセット	テカン	30097371	D300eコンパウンドディスペンサー用大容量カセット
D300e T8+カセット	テカン	30097370	D300eコンパウンドディスペンサー用少量カセット
ジメチルスルホキシド、細胞培養グレード	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	図4で使用図5
DSBRレポーターソースプラスミド	Artios		、リクエストに応じて学術コミュニティに利用可能
EcoRV-HF および 10x CutSmart バッファー	NEB	R3195M
エタノール絶対	VWR	20821.365
ウシ胎児血清	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler 超低範囲DNAラダー	サーモフィッシャー	SM1211	低分子量DNAラダー
HEK-293細胞	ATCC	CRL-1573	プロトコルで使用される細胞株の例
HindIII-HFおよび10x CutSmartバッファー	NEB	R3104M
HyClone 分子生物学グレード水	フィッシャーサイエンティフィック	10275262
I-SceIおよび10x Tango バッファー	Invitrogen	ER1771
イソプロパノール	VWR	20842.33
JetPRIME 試薬およびバッファー	PolyPlus	114-15	脂質ベースのトランスフェクション試薬
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	15 mL または 50 mL チューブ用遠心分離機
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	HEK-293 細胞用培地
マイクロプレートシェーカー	フィッシャーブランド	15504070	マイクロプレートオービタルシェーカー
マイクロスター 17R	VWR	521-1647	1.5mLまたは2mLチューブ用遠心分離機
マルチドロップ	サーモフィッシャー	5840300	細胞または水性試薬ディスペンサー
マルチドロップ標準カセット	サーモフィッシャー	24072670	マルチドロップ試薬ディスペンサー用カセット
NanoDLR ストップ&Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630またはN1650	Reporterルシフェラーゼ(NanoLuc)試薬を使用して、ホタルの発光を消光し、NanoLucの発光を検出します。Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 or N1650	Control luciferase (Firefly) assay reagent for detecting Firefly.Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (カルシウムまたはマグネシウムなし)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly プラスミド(または同等品)	Promega	E1310 (または同等品)	Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc プラスミド(または同等品)	Promega	N1091 (または同等品)	NanoLuc 制御プラスミド(装置設定/最適化実験の調整用)
QIAquick ゲル抽出キット	Qiagen	28706
クイックロード パープル 1 kb DNA ラダー	NEB	N0552S	高分子量 DNA ラダー
酢酸ナトリウム (3 M)、pH 5.5	サーモフィッシャー	AM9740	QIAquick ゲル抽出キット
SYBR Gold (10,000x)	Invitrogen	S11494	ssDNA および dsDNA の視覚化用
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	DsDNA Only
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer	NEB	M0202L
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	細胞計数中の生存率の測定用
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoIおよび 10x CutSmart バッファ	NEB	R0146M