方法論記事

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

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DOI:

10.3791/66986

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2024年9月27日

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

この記事について

サマリー

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。

要約

多形性膠芽腫(GBM)は、治療法がない原発性脳悪性腫瘍の最も一般的で侵攻性の形態です。血液脳関門は、GBMへの治療の提供における大きなハードルです。ここで報告されているのは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍領域に蓄積してペイロードを送達できる、画像誘導酸化鉄ベースの治療送達ナノプラットフォームです。この25 nmナノプラットフォームは、Cy5.5蛍光色素で標識され、ペイロードとしてアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む架橋デキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子で構成されています。磁性酸化鉄コアは 、in vivo 磁気共鳴イメージングによるナノ粒子の追跡を可能にし、Cy5.5色素は光学イメージングによる追跡を可能にします。このレポートでは、静脈内注射後の同所性移植性膠芽腫腫瘍におけるこのナノ粒子プラットフォーム(MN-anti-miR10bと呼ばれる)の蓄積のモニタリングについて詳しく説明します。さらに、RNA治療薬の臨床への翻訳を妨げてきた問題であるRNAオリゴヌクレオチドの in vivo 送達に関する洞察を提供します。

概要

多形性膠芽腫(GBM)は、事実上治療法がない星状細胞腫の最高グレードです。膠芽腫と診断されるのは年間約15,000人で、生存期間の中央値は約15カ月、5年生存率は5%と悲惨な結果となっています1。過去数十年間、治療の選択肢を前進させるための複数の努力にもかかわらず、予後はわずかに改善されてきました。GBMの現在の標準治療には、可能な場合は最大限の外科的切除が含まれ、その後に放射線療法と化学療法が行われます2。テモゾロミド(TMZ)は、選択された化学療法であり、顕著な臨床効果を示すことが発見された膠芽腫の最新の治療法でした。ただし、GBM腫瘍の少なくとも50%はTMZ抵抗性を示しています3。この厳格な治療レジメンにもかかわらず、改善された膠芽腫治療に対する臨床的ニーズは依然として大きいです。

GBMやその他の脳関連疾患の治療法の開発は、血液脳関門(BBB)の選択的性質によって大幅に妨げられています。BBBは、内皮細胞、周皮細胞、および星状細胞の足端からなる生理学的バリアであり、循環器系と脳との間に半透膜を作り出し、分子と細胞の脳への自由な通過を制限する4。BBBは、正常な生理機能を保護し、脳の恒常性維持に重要ですが、多くの治療薬が脳に到達するのを防ぎ、GBMの治療を複雑にします。GBMへの治療薬の送達を強化するための努力は、ナノ粒子ベースの送達手段、集束超音波薬物送達強化、および受容体媒介薬物送達の開発につながっています5,6。

ナノ粒子は、がんを含む無数の疾患の治療法を開発するための有望な媒体として浮上しています。GBMにおけるイメージングおよび治療目的のためのナノ粒子の適用は、種々のナノ粒子コンストラクト7,8を用いて試みられてきた。提案されたアプローチは、送達のin vivoイメージングと併せてGBMに薬物を送達することに焦点を当てており、酸化鉄コアで構成され、安定性のためにデキストランで覆われた磁性ナノ粒子(MN)を利用します。これらのナノ粒子の磁気特性は、磁気共鳴(MR)イメージングによる検出を可能にし、一方、アミノ化デキストランコーティングへの単純な結合化学により、RNA分子などの治療部分、追加の標的部分、またはイメージング部分(Cy5.5近赤外光学色素など)の結合が可能になります9,10。.イメージング機能に加えて、nanoプラットフォームは、オリゴヌクレオチドを内因性ヌクレアーゼから保護することにより、RNA治療薬の半減期を延長し、治療送達を改善することができます。ここでは、このナノプラットフォームを、治療用オリゴヌクレオチド(MN-抗miR10bと呼ばれる)のGBMへのin vivo送達に応用し、in vivoイメージングでモニタリングする方法を紹介します。以前に、このナノプラットフォームの蓄積能力は、in vitroでGBM細胞で実証され、腫瘍細胞の生存率の大幅な損失を引き起こしました11。治療的なin vivo研究を行う前に、このナノプラットフォームのGBM腫瘍へのin vivo送達を動物モデルで実証する必要があります。これを達成するために、同所性GBM動物モデルを作成し、コンストラクトの静脈内投与を行った後、in vivoイメージングを行いました。ここでは、in vivoイメージングおよびex vivo顕微鏡法によって確認された腫瘍領域への蓄積を示すこれらの研究のプロトコルを概説します。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。雌の近交系無霊科ヌードマウスをJackson Labs(株#007850)から7週齢で購入し、着床手術の1週間前に順応させました。マウスは移植時に約21〜25gであった。ホタルルシフェラーゼを発現するU251細胞をAna deCarvalho博士によって作製し、提供した12。

1. 細胞培養と移植準備

  1. D-グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でルシフェラーゼ標識ヒト膠芽腫細胞U251を培養し、37°Cで10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを5%CO2で補充します。
  2. 細胞が70%のコンフルエント度に達したら、0.25%トリプシン/EDTAで37°Cで1〜2分間トリプシン化します。 T-75フラスコには2〜4mL、T-175フラスコには4〜6mLを使用してください。
  3. 細胞がフラスコから分離した後、補充したDMEMを2:1の比率で反応を急冷し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞を解離して単一細胞懸濁液にします。細胞を円錐管に移し、300 x g で5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
  4. 上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。トリパンブルー染色を使用して血球計算盤で細胞をカウントし、死んだ細胞を除外し、生細胞の総数を計算します。上記のように、細胞を再度ペレット化します。
  5. 細胞ペレットをPBSで1 x 108 細胞/mLの濃度に再懸濁し、頭蓋内移植のために細胞懸濁液を氷上に保存します。

2.フリーハンドの同所性腫瘍移植術

注:このプロトコルは、Irtenkaufら(Ana deCarvalho博士の手順;ヘンリーフォードヘルスハーメリン脳腫瘍センター)12。すべてのステップは、被験者と研究者の両方の安全を確保するために、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。フリーハンドの移植法では、頭蓋内移植の品質を維持しながら、より大きなサンプルサイズを達成するための迅速な手順が可能になります。あるいは、脳定位固定装置を使用して、以下に説明するのと同じ座標で腫瘍を移植することができる。

  1. ヌードの無気力マウスの体重を量り、ケタミン/キシラジン (100 mg/kg/10mg/kg) の麻酔薬溶液を 28G 注射器で腹腔内注射します。マウスを温熱パッドの上のリカバリーケージに入れて、体温を維持します。ペダル反射を確認して麻酔を確認します。
  2. 眼科用眼軟膏を塗布し、ケトプロフェン(5 mg / kg)を28Gシリンジで皮下投与し、耳のパンチを特定します。.
  3. 頭頂部の手術部位を70%エタノールで滅菌し、続いてベタジンスクラブで3回繰り返します。次に、頭の正中線の右側にある小さな手術用ハサミで5〜7mmの切開を行い、細い鉗子で皮膚を引っ込めて頭蓋骨と頭蓋骨の縫合線を露出させます。
  4. 綿棒で頭蓋骨をこすり洗いして骨膜を取り除き、骨にアクセスできるようにします。新しい綿棒を使用して3%過酸化水素の溶液を塗布し、骨を乾かします。新しい綿棒を使用して、余分な過酸化水素と形成される可能性のある泡を拭き取ります。ブレグマが頭蓋骨に見え、骨が穴あけに十分に乾くまで、この手順を3回繰り返します。十分に乾燥した頭蓋骨は、縫合糸のラインがはっきりと白くなり、最初の外観からの赤みが減少します。
  5. ブレグマに対して、定規で-2.5 mmの内側/外側と-1 mmの前後/後部を測定し、マーカーでドリルサイトをマークします。穴を開ける前に再度測定して、マークが正しい位置にあることを確認してください。
  6. 0.5mmのドリルバリが付いた電動マイクロサージェリードリル(11,000RPM)を取り、以前にマークされた頭蓋骨に慎重に穴を開けます。ドリルサイトに蓄積する可能性のある血液や体液を、新しい綿棒で吸収します。
  7. 33Gマイクロリットルの注射器を準備し、3mmの露出した針の長さに針スリーブを取り付けます。ピペットで短時間再懸濁した後、以前に調製した1 x 108 細胞/mL細胞懸濁液を5 μL引き出し、注入溶液に気泡がないことを確認します。ニードルとニードルスリーブの外側に残った余分な細胞懸濁液を70%イソプロパノールワイプで慎重に拭き取ります。
  8. ニードルスリーブが針のさらなる挿入を停止するまで、針をドリル部位に垂直に挿入します。針を約0.5mm慎重に引っ込めて、注入した細胞が蓄積するスペースを作ります。
  9. 細胞懸濁液を1分間かけてゆっくりと注入します。全量が注入されたら、注射液の排出を減らすために、針をさらに深さで保持します。次に、針を慎重に引っ込めます。
  10. 清潔な綿棒で、注入部位に溜まった液体を拭き取り、ボーンワックスを塗布して穴を塞ぎます。
  11. 切開部を獣医用ボンドで閉じ、乾燥させます。清潔な綿棒で、鎮痛剤として局所リドカインを塗布します。.
  12. 完全に回復して歩行できるようになるまでマウスを監視します。ケトプロフェン(5 mg / kg)を移植後2日間皮下投与し、疼痛管理を行います。.

3. ナノ粒子プラットフォーム合成

  1. 前述したように、ナノ粒子をCy5.5およびオリゴヌクレオチド(抗miR10b)と合成し、結合させる11。

4. MN-抗miR10b投与

注: この研究では、注射は移植の 7 日後から 6 週間、週に 1 回行われましたが、同じプロトコルをさまざまな注射頻度に使用できます。

  1. マウスの体重を量り、マウスに投与するMN-anti-miR10bの量を計算します。MN-抗miR10bの用量は、マウスGBMモデルで20 mg Fe / kgで投与されます。.例えば、20 gのマウスに80 μLの5 mg Fe/mL MN-anti-miR10bを投与します。対照マウスは、この投与計画と一致する同量のPBSを投与されます。
  2. MN-anti-miR10bの用量で28Gシリンジを準備し、注射液に気泡がないことを確認します。.
  3. 誘導ボックス内で1.5 L / minの流量で、誘導のために2%〜4%のイソフルラン、メンテナンスのために1.5%〜2%でマウスを麻酔します。マウスをノーズコーンに移動し、麻酔を続けます。麻酔の深さを確認し、獣医用軟膏を塗布します。
  4. 70%イソプロパノールワイプで尾を滅菌し、余分なアルコールを乾かします。
  5. 尾を回転させて、外側尾静脈を尾の上部に配置します。次に、静脈を狙って針を尾部に挿入し、プランジャーを引き戻して真空にします。
  6. 血液がシリンジに入るまで針を挿入し、静脈への正常な侵入を示します。
  7. MN-anti-miR10bをゆっくりと注入し、完全送達後に針を引っ込めます。出血が止まるまでガーゼで注射部位に圧力をかけます。.
  8. マウスをノーズコーンから取り外します。完全に回復して歩行できるようになるまでマウスを監視します。
    注:ナノ粒子のボーラス投与は、呼吸困難を引き起こす可能性があります。マウスを注意深く監視し、呼吸困難の兆候がある場合はすぐに軽い胸骨圧迫を適用してください。

5. in vivo 生物発光および蛍光イメージング

注: In vivo 生物発光および蛍光イメージングは、ナノ粒子が注入される前と注入後24時間後に In vivo イメージングシステム(IVIS)で行われます。

  1. 滅菌ろ過されたD-ルシフェリンを30 mg / mLの濃度でPBSに調製し、Mg2+ およびCa2+を含まない。
  2. IVIS操作ソフトウェアを開き、初期化を開始して本機を準備します。システムの初期化中に、[ 取得] > [自動保存先 ] を選択して画像を保存するフォルダーを選択し、ファイルを保存するフォルダーを定義します。
  3. イメージングの時点で、マウスの体重を量り、150 mg / kgの投与量で投与するD-ルシフェリンの量を計算します。容量の28Gシリンジを準備し、溶液を直射日光から保護します。この研究では、移植手術の 2 日後に播種を確認するための画像検査と、毎週の治療の直前に移植後 7 日目に毎週の画像検査が開始されました。
  4. 誘導チャンバー内で1.5 L / minの流量で、誘導のために2%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔し、メンテナンスのために1.5%〜2%でマウスを麻酔します。麻酔をかけたら、手術部位をさらに傷つけないようにマウスを優しく首筋に切り、D-ルシフェリンの用量を腹腔内に注射します。マウスを回復させ、イメージングする前に10分間待ってから、生物発光シグナルが発生して安定するのを待ちます。
  5. 生物発光シグナルが発達している間に、IVISスキャナーを生物発光イメージング用に準備します。黒色の低蛍光マットをイメージングステージに置き、イメージングする被写体の数に合わせてノーズコーンアレイを設定します。
  6. ソフトウェアで、[ イメージングウィザード]をクリックします。 「Bioluminescence Imaging 」を選択し、「 Open Filter」を選択します。次の画面で、[イメージング対象] と [視野] を選択します。IVISは現在、生物発光イメージング用に設定されています。
  7. イメージングの3分前に、イソフルラン/酸素混合物をボックス内に充填させることにより、誘導ボックスのプライミングを開始します。イメージングの2分前に、マウスを麻酔用の誘導ボックスに入れます。
  8. 麻酔をかけたら、マウスを誘導ボックスからIVISに移動してイメージングし、それぞれを腹臥位に寝かせます。イメージング中に2%イソフルランを使用して維持麻酔を提供します。
  9. マウスをIVISスキャナーにセットしたら、 Acquire Sequenceをクリックします。自動露出設定を使用して、最小信号しきい値が3,000カウントの画像を撮影します。生物発光イメージングは、ルシフェラーゼ標識U251神経膠芽腫細胞の局在を視覚化します。自動露出は、ユーザーが定義した最大長である 5 分まで、ビュー内の最も明るい信号に基づいて計算された露出長で画像をキャプチャします。
    注:一般的なマウスのケージには、播種が一般的に均一であるため、1つの画像が必要です。1匹以上の明るいマウスを装着した場合、マウスを取り出し、薄暗いマウスからの信号をよりよく捕捉するために、反復捕捉を行うことができる。
  10. 生物発光イメージング後、IVIS設定を変更して落射蛍光イメージングを準備し、蛍光スキャンを行います。
    1. イメージングウィザードで、「 蛍光>フィルターペアとエピ照明付き」を選択します。次の画面で、イメージ化するプローブ (Cy5.5 など) を選択します。撮像対象と視野を選択します。これで、IVISスキャナーは、前の画面で選択したプローブの蛍光イメージング用に設定されています。
  11. 自動露出設定を使用して、最小信号しきい値が6,000カウントの画像を撮影します。Cy5.5蛍光イメージングは、MN-anti-miR10bの局在を可視化します。自動露出は、ユーザーが定義した最大長である 5 分まで、ビュー内の最も明るい信号に基づいて計算された露出長で画像をキャプチャします。
    注:蛍光イメージングは、対照PBS注入マウスであっても、1分以上の曝露を要することはめったにありません。治療したマウス間のシグナル偏差が小さいため、常に1つの画像で十分です。
  12. イメージング後、マウスをIVISから取り外します。麻酔と外来から完全に回復するまで監視します。

6. 生体内 磁気共鳴画像法

注:MRイメージングは、ナノ粒子注入前および24時間後に実施され、光学イメージングおよび生物発光イメージングを受けるのと同じ動物で実施することができる。

  1. 導入の場合は 2%-4% イソフルラン、メンテナンスの場合は 1.5% 〜 2% 未満の誘導ボックスで、対象のマウスを麻酔します 1.5 L/分の流量。麻酔をかけたら、マウスをうつ伏せにして、呼吸モニタリングバルーンの上のMRIベッドに置きます。ノーズコーンを鼻にぴったりとフィットさせて、イメージング中に麻酔を行い、眼科用眼軟膏を塗布します。
  2. バイトバーとイヤーバーを使用してスキャンするために頭を固定して配置します。
  3. 潤滑された直腸温度プローブを取り付け、呼吸と温度監視が機能していることを確認します。マウスベッドのペグをコイルの穴にはめ込んでマウスブレインコイルを頭の上に置き、コイルを所定の位置にテープで固定してスキャン中の動きを減らします。
  4. マウスの上部に小さな温水循環パッドを置き、麻酔中に体温を維持します。コイルとヒーティングブランケットの間にある程度の距離を空けて、水の干渉による画像の歪みを制限するように注意してください。
  5. マウスとイメージングベッドをスキャンの位置に移動します。
  6. MRIコイルの調整とマッチングは、アクイジションソフトウェアでWobbleのセットアップステップを開始して行います。MRIのサービス終了時には、コイルのチューンノブとマッチノブを使用して、トレースが中央に配置され(チューン)、できるだけ深く(一致)ことを確認します。
  7. 3平面ローカライザースキャンを取得し、必要に応じてイメージングベッドを調整して、脳を磁石のアイソセンターに配置します。
  8. 次のパラメータで腫瘍に注入された薬剤を検出するために、2D T2 加重スキャンを取得します:繰り返し時間(TR)= 2500ミリ秒、エコー時間(TE)= 25ミリ秒、視野(FOV)20 x 20 mm、18冠状スライス、0.2 mmスライスギャップ、150 x 150 μm面内分解能、0.5 mmスライス厚さ。
  9. 全脳のB0マップを取得し、Mapshimユーティリティを使用してローカライズされたシムを計算します。次に、3D T2 強調画像を使用して、TR = 30 ms、TE = 10 ms、FOV 20 x 15 x 12 mm、解像度 100 μm の等方性でナノ粒子を視覚化します。
  10. 腫瘍上の位置スキャンへの参照として2D T2強調画像を使用して、さらなるナノ粒子イメージングのためにT2*マップを取得します。TR = 800 ms、TE = 3.5 ms. FOV 20 x 20 mm、5 コロナ スライス、スライス ギャップなしを使用します。平面内の分解能は平面内100μm。5msのエコー時間間隔で10枚のポジティブエコー画像を取得します。
  11. イメージングシーケンス全体を通して呼吸と体温をモニタリングし、必要に応じてイソフルランと水温を調整します。
  12. イメージング後、マウスをMRIスキャナーから取り外し、加熱されたリカバリーケージに入れます。マウスが麻酔と歩行から完全に回復するまでマウスを監視します。

7. ex vivo 生物発光および蛍光イメージング

  1. IVISでは、in vivoイメージングと同様に、ex vivo生物発光および蛍光イメージングを行います。上記のようにIVISの初期化とスキャン設定の手順を実行します。
  2. 実験エンドポイントで、マウスの体重を量り、150 mg / kgの投与量で投与するD-ルシフェリンの量を計算します。D-ルシフェリンの用量を注射し、前述のように注射後10分でライブイメージングを行います。
  3. 最終的な in vivo 生物発光および蛍光イメージングの後、麻酔下でマウスを子宮頸部脱臼により迅速に安楽死させ、マウスを解剖し、脳を含む主要な臓器をペトリ皿に集めます。
  4. 切除された臓器を装着したペトリ皿をIVISスキャナーにセットし、 in vivo イメージングと同じ取得設定を使用して、生物発光モダリティと蛍光モダリティの両方で臓器をイメージングします。
  5. OCTでのさらなる分析に必要な臓器を急速凍結するには、OCTで試料を採取したクライオモールドを、長い鉗子で液体窒素の浅いプールにゆっくりと下げ、OCTが完全に白くなるまで加熱します。液体窒素が液体OCTに触れたり、OCTの泡立ちが発生するため、金型を急激に下げたりしないでください。凍結サンプルは-80°Cで保存してください。
  6. 腫瘍を含む脳をOCTで保存し、凍結切片のために瞬間凍結します。分析に必要になるまで-80°Cで保存してください。

8. 蛍光顕微鏡

  1. クライオセクショニング用のクライオスタットを準備します。チャンバーと試料ヘッドの温度を-15°Cから-20°Cの間に設定します。
  2. OCTで急速凍結した脳を-80°Cで保存した状態から取り出し、クライオスタットチャンバー内に置きます。切片作製する前に、サンプルをチャンバー温度(-20°C)まで温めます。
  3. 片刃のカミソリを使用して、注射部位で脳を冠状に切ります。これは通常、脳の表面にくぼみとして見えます。少量のOCTを使用してサンプルを検体ディスクにマウントし、脳の切断面を切片に配置します。チャンバー内で冷やしたおもりで十分な圧力をかけることで、サンプルを安定して装着することができます。
  4. マウントされたサンプルと試料ディスクを試料ヘッドに移動し、切片化の準備をします。20 μmの切片を取り、サンプルの角度を調整して、組織をできるだけ組織と同じ高さに近づけるように切片にして、組織を希望の深さにトリミングします。
  5. 目的の組織深度に達したら、クライオスタットを調整してサンプルの5〜7μmの切片を取ります。マウスID、切片組織、スライド番号などの記述子があらかじめラベル付けされたスライドガラスに切片をマウントし、顕微鏡スライドの帯電面を切片上に素早く下ろします。
  6. 新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)を作ります。スライドを組織と一緒にPFA溶液に15分間浸し、組織を固定します。固定後、スライドをDPBS 3xですすいでください。
  7. スライドガラス上に固定した組織切片に、細胞核を染色する4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を40 μL滴下します。24 mm x 50 mmのガラスカバースリップを封入剤の上に慎重に置き、ティッシュ全体が封入剤に包まれていることを確認します。
  8. DAPI(359 nmでの発光(em)、457 nmでの励起(ex))およびCy5.5(ex:683 nm、em 703 nm)蛍光顕微鏡を使用して組織を視覚化します。

結果

MN-抗miR10bは、前述のように合成され、特性評価された11。MN-anti-miR10bの透過型電子顕微鏡は、ナノプラットフォームの形態と多分散性を示しています(図1B)。このナノプラットフォームの平均サイズは25.12 ± 0.34 nmで、ゼータ電位は13.18 ± 1.47 mVです(図1C、D)。これらの研究では、ヌードの無腺マウスに、上記のプロトコルに従ってU251ヒト膠芽腫細胞を同所的に移植しました。MN-抗miR10bの全身静脈内注射を20 mg Fe/kgで行いました。マウスを安楽死させ、ナノドラッグの最終投与の7日後に組織を採取しました。MN-抗miR10bを注入したマウスのCy5.5蛍光および生物発光シグナルは、腫瘍へのナノ粒子の送達を示す明確な共局在を示しましたが(図2A、B)、対照マウスは蛍光シグナルを示さなかった。生体外蛍光イメージングでは、このタイプのナノ粒子に期待される肝臓や腎臓などの主要なクリアランス臓器におけるナノ粒子の局在が示されました(図2C)。別の研究では、上記のようにマウスにGBM細胞を同所的に移植し、in vivo MRイメージングを行いました。T2*強調画像およびT2*マップは、ナノ粒子の投与前および20mg Fe/kgの単回投与の24時間後に取得された。T2強調MRI信号の特徴的な減少は、MN-抗miR10bが血液脳関門を通過し、腫瘍領域に蓄積するMRI造影剤としての可能性を示しています(図3)。in vivoイメージングに続いて、腫瘍へのナノ粒子の送達をさらに確認するために蛍光顕微鏡法を実施しました。上述したように、組織を切片化し、DAPI染色による顕微鏡観察のために調製した。腫瘍領域にCy5.5蛍光シグナルが示され、送達が確認されました(図4)。

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図 1.MN-anti-miR10bの特性評価(A) MN-anti-miR10bの概略図。ナノプラットフォームは、デキストランで覆われた酸化鉄コアをCy5.5光学色素で標識し、治療用オリゴヌクレオチド(抗miR10b)で結合させたものです。BioRender.com で作成。 (B) MN-anti-miR10bの透過型電子顕微鏡 (C) コンストラクトの流体力学的サイズは25.12±0.34nmです。 (D) MN-anti-miR10bのゼータ電位は1.47mV±13.18である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 2. GBMモデルにおける in vivoおよびex vivo研究。(A)In vivo生物発光イメージング(左)と蛍光イメージング(右)は、腫瘍領域における磁性ナノ粒子シグナルの共局在を示しています。(B)切除された脳のex vivo生物発光および蛍光イメージングにより、シグナルの共局在が確認されます。(C)臓器の生体内分布は、主要なクリアランス臓器への蓄積を示しています。B:脳;H:ハート;ルー:肺;李:肝臓;S:脾臓;K:腎臓;M:筋肉;(すべてのグループで n=6)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 3. インビボ GBMモデルのMRI。 MN-anti-miR10b の注入前 (左) と 24 時間後 (右) に取得した T2* 加重 (上段) および T2* マップ (下段) の画像。注入後の画像におけるシグナル強度の減少は、酸化鉄の蓄積(n=3)を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 4.腫瘍組織の Ex vivo 蛍光顕微鏡。 代表的な顕微鏡画像は、ナノ粒子の蓄積を示しています。ブルー - DAPI、マゼンタ - Cy5.5。スケールバー = 100 μm;(すべてのグループで n=6)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

BBBを介したナノ粒子の蓄積を検証するさまざまな方法にわたるいくつかの重要なステップは、プロトコルの成功にとって決定的なものとなり得ます。GBM細胞の同所性移植から始めて、骨を乾燥させた後に頭蓋骨の縫合線が見えるようにすることが重要です。これにより、腫瘍細胞の正確な配置が可能になります。頭蓋骨を穴あけするには、穴あけ部位に軽い圧力を加え、骨に浅い印象を与えるために穴あけを開始するのが最善です。最初のマークが適切な位置に付けられると、ドリルの滑りを最小限に抑えてドリルを簡単に掘削できます。頭蓋骨を突き破った後は、脳へのダメージを最小限に抑えるために、すぐに穴あけをやめてください。ナノ粒子やその他の薬剤の静脈内注射では、致命的な静脈性空気塞栓症を避けるために、注入液中に気泡がないことを確認することが重要です。このプロトコルに従って尾静脈への侵入が成功したことを示すいくつかの指標は、血液が注射器に引き込まれることと、針の先端の周りの尾静脈の色が失われることです。切除された組織の ex vivo 生物発光および蛍光イメージングでは、生物発光シグナルが時間の経過とともに減衰し始めるため、迅速に作業するのが最善です。生物発光シグナルの動態は細胞株によって異なる可能性があるため、特定のモデルを理解することが重要です。

特定のステップは、ナノ粒子の局在化の検出を支援するために変更できます。 in vivo 生物発光イメージングでは、腫瘍細胞の移植や腫瘍増殖速度の変動が生物発光シグナルの違いにつながる可能性があります。特定の状況では、BLI信号が最も高いマウスはスキャンの露光時間を短縮し、他のマウスで検出される信号が減少する可能性があります。この場合、BLIおよびFLIの共局在化のためにマウスが同じ位置に留まるように、蛍光スキャンを継続することが推奨される。次に、最初のBLIスキャンでシグナルを示したマウスを除去した後、生物発光のために再イメージングします。これにより、曝露時間の計算はこれらの低信号マウスに基づいて行われ、最終的には腫瘍の検出が行われます。 in vivo 蛍光画像を撮影する際には、尾部を黒い紙で覆うことで体内のナノ粒子の局在をよりよく確認できる可能性があり、これは尾静脈注射からの残留ナノ粒子の存在から高い蛍光シグナルを持つ可能性があります。同様の推論として、臓器の ex vivo 蛍光スキャン中に、脳のみをイメージングすると、細網内皮系臓器におけるナノ粒子の蓄積が信号検出を不明瞭にする可能性があるため、脳および腫瘍領域におけるナノ粒子の局在をよりよく示すことができる。

この治療用RNA送達方法の限界は、体内のナノ粒子の全身分布です。他のすべての全身注射の場合と同様に、治療薬は肝臓、腎臓、脾臓などの臓器によって血流から除去され、最終的にはナノ粒子の関心領域への送達が減少します。この問題に対処するために、MN-抗miR10bは、体内の循環時間を増加させるために架橋-デキストランコーティングと合成されている13。ナノ粒子の構造を最適化することにより、循環時間と蓄積を増加させる努力にもかかわらず、特定のモデルおよび疾患状態によっては、腫瘍領域における有意な蓄積のために、ナノ粒子の複数回の注入が必要な場合がある。

GBMにおける治療用分子の送達は、選択性の高いBBBのために大きな課題となっています。多くの研究がナノ粒子ベースの送達体をテストしてきましたが、最終的にはそのサイズと電荷5,6,7のためにBBBの浸透に効果がありません。ここで説明する25 nmナノ粒子コンストラクトであるMN-anti-miR10bは、全身注射すると、この生理学的障壁を通過し、腫瘍領域に蓄積することができます。このナノ粒子プラットフォームは、GBMへのRNA分子の送達を媒介する可能性を秘めており、イメージングを使用して送達ビヒクルの蓄積をモニタリングすることができます。酸化鉄ナノ粒子の生体内分布は、予想されるパターンに従い、細網内皮系の器官に蓄積してクリアランスを確保します。同様の生体内分布は、イメージングまたは治療目的で使用される類似のナノ粒子で報告されています。重要なことに、これらの以前の研究では、30 mg Fe / kg14,15の投与量でも、主要な臓器に関連するオフターゲット毒性の兆候はありませんでした。.

このナノ粒子プラットフォームシステムの利点は、その蓄積を非侵襲的に追跡できる in vivo イメージング機能です。デキストランコートに結合したCy5.5近赤外蛍光色素により、その存在を検出するための迅速な光学イメージングが可能になります。このモダリティに加えて、MN-anti-miR10bの超常磁性酸化鉄ナノ粒子コアは、このコンストラクトをMRI造影剤として適しており、セラノスティクス16の発展分野を表しています。MRIの解剖学的分解能と酸化鉄ナノ粒子のコントラストを組み合わせることで、ナノ粒子が脳内のどこに蓄積するかを正確に示すことができます。これら2つのモダリティを組み合わせることで、ナノプラットフォームの前臨床 in vivo 追跡が可能になり、BBBを介したRNAまたはその他のペイロードの送達をモニターすることができます。

開示事項

Z.M.とA.M.は、TransCode Therapeutics Inc.の共同設立者であり、株主です。残りの著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究の資金の一部は、ヘンリーフォードヘルスシステムズミシガン州立大学健康科学アライアンスからAMおよびADCへの助成金によって提供されました。ミシガン州立大学で動物研究を監督し、このビデオを承認してくださったダニエル・R・ファーガソン博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アチミックヌード "J:NU" マウスジャクソン研究所RRID:IMSR_JAX:007850免疫不全マウスモデル
0.25% トリプシンGibco25200-056U251
1.7 mL 微量遠心チューブDOT ScientificRN1700-GMT組織コレクション用
10 & micro;L、Neurosシリンジ、モデル1701 RN、33ゲージ、ポイントスタイル4ミルトン65460-06腫瘍細胞の頭蓋内移植用シリンジ
3M Vetbond3M1469SB手術部位閉鎖用組織接着剤
4%パラホルムアルデヒド Thermo ScientificJ199943-K2組織固定液
70% イソプロポイルアルコールワイプCardinalMW-APL腫瘍移植および尾静脈注射用局所消毒ワイプ
Aperio VersaLeica染色された組織切片スライドのスキャン用
Betadine Surgical ScrubPurdue6761815101腫瘍移植
用局所消毒剤BioSpec 70/30Bruker磁気共鳴画像スキャナー
Bone WaxMedlineDYNJBW25インプラント部位をシールするための骨ワックス
マイクロドリルF.S.T.19007-05腫瘍移植のために頭蓋骨に穴を開けるために使用されるドリルバリ
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20DAPI染色ダル
ベッコ 'を含む組織封入剤Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065U251
Extra Fine Graefe ForcepsF.S.T.11150-10腫瘍移植のためのSugicalツール
シ胎児血清Corning35-010-CVU251 Fine Scissors用細胞培養培地サプリメント
- シャープ 10.5cmF.S.T.14060-10腫瘍移植のためのSugicalツール
Glydo(リドカイン)Sagent673-76手術部位のための局所鎮痛薬
理想的なマイクロドリルCellPoint Scientific67-1200A腫瘍移植のための頭蓋骨に穴を開けるために使用されるドリル
インスリン注射器 1CC 29G X 1/2インチベクトン、ディキンソン324704D-ルシフェリン注射および尾静脈注射用注射器ナノ粒子
イソフルランコベトラス11695067772アネセシア
イソフルラン気化器SOMNI ScientificVS6002アネセシア装置
IVIS SpectrumCT In Vivo イメージングシステムPerkinElmer/Revvity128201生物発光および蛍光イメージングスキャナー
IVISbrite D-ルシフェリン カリウム塩PerkinElmer/Revvity122799-100MG生物発光イメージング用基質
ケタセット(ケタミン)ゾエティス10004027腫瘍移植手術用麻酔薬
ケトフェン(ケトプロフェン)ゾエティス10004031腫瘍移植手術用鎮痛薬
ライカCM1950ライカCM1950OCT包埋サンプルの凍結切片用
PBSGibco14190-144U251の移植のための細胞培養試薬と細胞懸濁液
ニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122U251
Puralube獣医軟膏MWI 獣医27505腫瘍移植中の保護のための眼科用軟膏
定規F.S.T.18000-30インプラネーションの掘削場所の測定に使用
Tissue-Tek Cryomold 中級 15 x 15 x 5 mmSakura4566組織サンプル収集用採取型
Tissue-Tek O.C.T. コンパウンドSakura4583組織サンプル採取用凍結化合物
U-251 MG 細胞株 ヒトミラポア シグマ9063001ヒト神経膠芽腫細胞株
キシラジン注射液、100 mg/mlCovetrus1XYL006腫瘍移植手術のための麻痺
用細胞培養試薬 ハ用バリ 用細胞培養培地 ウペ

参考文献

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

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