このプロトコルは、ホールマウントマウス網膜を単離し、免疫染色を実施してすべての網膜神経節細胞(RGC)を標識する手順を説明しています。このプロセスに続いて、AIベースのソフトウェアを使用してRGCをイメージングし、自動的にカウントし、マウス網膜全体のRGCを定量するためのシンプルで高速かつ正確な方法を提供します。
方法論記事
マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
緑内障は、世界的に失明の主な原因であり、視力回復を困難にする複雑な病原性メカニズムを特徴としています。マウスは、比較的均質な遺伝的背景と、構造的にヒトに類似した網膜神経節細胞(RGC)により、緑内障の病因と治療を研究するための貴重な動物モデルとして機能します。マウス緑内障モデルにおけるRGC損傷と治療結果を正確に評価するには、網膜全体にわたるRGC数を決定する必要があります。このプロトコルは、網膜全体の単離、特定の抗体によるRGCの標識、AIベースのプログラムを使用したRGCの迅速で正確な自動カウントを含む包括的な方法を概説しています。この合理化されたアプローチにより、マウス網膜のRGC数を効率的かつ正確に定量化することができ、RGC変性の評価や治療介入の可能性を高めることができます。研究者がRGC損傷の程度を評価できるようにすることで、このプロトコルは緑内障の病因のより深い理解に貢献し、視力喪失を管理および予防するための効果的な治療戦略の開発を支援します。
概要
緑内障は、神経節細胞の進行性の死を特徴とし、視力回復に大きな課題をもたらします1,2。この病気は、その有病率と視力への影響により、眼科研究の主要な焦点です3.マウスモデルは緑内障に欠かせません
その均質な遺伝的背景、高い生殖能力、および神経節細胞の特性とヒトとの類似性による研究4。この方法の主な目標は、マウスモデルにおける網膜神経節細胞(RGC)を正確に定量することであり、これは緑内障の病因を理解し、関連する治療法を開発するために不可欠です。
この手法を開発した根拠は、マウスモデルにおけるRGC変性を評価するための信頼性と効率性に優れた方法の必要性に起因しています。網膜切片におけるRGCの標識などの従来の方法では、網膜5におけるRGCの分布が不均一であるため、信頼性の低い結果が得られることがよくあります。網膜全体にわたるRGCの定量化は、その数の変化をよりよく反映し、疾患の進行と治療介入を評価するために重要です。
この方法には、他の手法に比べていくつかの利点があります。例えば、40,000〜60,000個のRGCを含む正常な成体マウス網膜における網膜神経節細胞(RGC)の手動カウントは、時間がかかり、エラーが発生しやすい場合がある6,7,8。当社が開発した自動RGCカウント用ソフトウェアにより、3分以内に正確なカウントが可能になり、研究者の時間を大幅に節約できる可能性があります。さらに、自動カウントに使用されるAIベースのソフトウェアは、バイアスを最小限に抑え、再現性を向上させます。
さらに、この手法は、さまざまなマウスモデルや実験条件でRGCの変性を評価するための標準化されたアプローチを提供し、緑内障研究の分野に貴重なデータを提供します。この方法は、疾患における網膜の変化を理解するためのホールマウント網膜解析の重要性を強調する他の研究と一致しています9。
この方法が自分のアプリケーションに適しているかどうかを判断するために、この手法は、緑内障または他の網膜疾患のマウスモデルで網膜神経節細胞(RGC)変性を研究する研究者にとって特に有利であることに注意することが重要です。この方法は、さまざまな実験設定に適応でき、RGCカウントにおいて高い精度と効率を提供するため、小規模および大規模の研究の両方に最適です。さらに、このプロトコルは分かりやすいデザインで、ユーザーフレンドリーなソフトウェアが利用できるため、網膜解析のさまざまなレベルの専門知識を持つ研究者が利用することができます。
プロトコル
この手続きは、研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(視覚眼科学研究協会)のガイドラインに準拠しており、四川省人民病院の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。この研究では、C57Bl/6J雄マウス(生後2か月)を使用しました。 図 1 は、ここで説明する全体的な手順を示しています。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。
1. ホールマウント網膜の分離
- 動物の犠牲
- 子宮頸部脱臼を使用してマウスを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)(図2A)。頸部脱臼の前に、
イソフルラン(酸素中3%〜5%)を吸入するか、ケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射により、マウスに麻酔をかけます。.
- 子宮頸部脱臼を使用してマウスを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)(図2A)。頸部脱臼の前に、
- 核形成と眼球処理
- 眼球の背側にある角膜の端に青いマーカーで印を付けて、その後の解剖時に向きを覚えておきます。
- 眼球に付着した残存筋組織をハサミで取り除きます。除核した眼球を、1x PBSを充填した2 mLの丸底マイクロ遠心チューブに移し、短時間すすぎます(図2C)。
- 固定
- 眼球を、新たに製造した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む別の2 mL丸底マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで10分間固定します(図2D)。
- 解剖顕微鏡で細かいハサミを使用して角膜に小さな切開(約1〜2 mm)を行います。
- 眼球を固定液に戻し、さらに4°Cで3時間固定して組織の形態を維持します(図2D)。
- 角膜とレンズの除去 1,9
- 角膜と強膜の境界である角膜辺縁部の周囲を、細い手術用ハサミを使用して約1mmの小さな切開を行います。
- 角膜の周囲を慎重に切り取り、角膜を完全に切除して下にある構造を露出させます。
- 細い鉗子を使用して、網膜の損傷を防ぐために、レンズを周囲の組織からそっとつかみ、慎重に持ち上げます。繊細な操作で網膜の構造的完全性を維持します。
- アイカップをマイクロ遠心チューブに移し、さらに処理します。
注:角膜を切除し、「クロススリット」技術10を使用してレンズをより効率的に抽出します。角膜を横切って2つの垂直なスリットを作り、鉗子を使用してレンズを抽出します。
- 強膜切開
- 細い眼科用ハサミで強膜に正確なスリットを切って、その後の解剖ステップを容易にします(図2J)。
- 網膜の分離
- 強膜と網膜の間の切開部に歯のある鉗子を挿入します。強膜の端をそっとつかみ、過度の力を入れないようにして組織の裂け目を防ぎます。
- 鉗子を強膜と網膜の境界に沿って動かし、ゆっくりと安定した手の動きで切開部を徐々に拡大します。鉗子の歯のある部分を使用して、強膜を網膜から慎重に分離し、網膜が損傷しないようにします(図2J)。
- 網膜切断
- 鋭利なハサミを使用して、網膜をほぼ同じサイズの4つのフラップに分割します。カットが視神経の約半分にあり、互いに90°向きであることを確認します。
- 網膜クリーニング
- 解剖した網膜を柔らかい毛のブラシでそっと広げ、表面の破片を丁寧に取り除きます(図2K)。
- 最終固定
- 分離した網膜を、使い捨てのパスツールピペットを使用して、新鮮な4%PFAを含む微量遠心チューブに移します。組織保存のために、さらに5時間から一晩氷上に固定します。
2. 免疫染色
- 洗浄
- 分離されたホールマウント網膜を1x PBSで5分間穏やかに攪拌しながら洗浄します。PBSソリューションを破棄します。このプロセスを2回繰り返して、残留固定剤と破片を取り除きます。
- ブロッキング
- 洗浄した網膜をブロッキング緩衝液(4%正常ロバ血清(NDS)および0.2%Triton X-100を含む1x PBS)に30分間浸漬して、非特異的抗体の結合を防ぎ、透過処理を強化します(図3A)。
- 一次抗体のインキュベーション
- ブロッキングバッファーを一次抗体BRN3A(ブロッキングバッファーで1:200に希釈)と交換します。網膜を4°Cで一晩インキュベートし、特異的抗原-抗体の結合を可能にします(図3B)。
- 洗浄
- 網膜を1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄して、未結合の一次抗体を除去し、バックグラウンド染色を減らします(図3C)。
- 二次抗体インキュベーション
- Alexa594またはAlexa488標識抗ウサギ二次抗体(1:300に希釈)と網膜を室温で2時間インキュベートし、標的抗原を可視化します(図3D)。
- 洗浄
- 1x PBSで3回連続して5分間ずつ洗浄することで、余分な二次抗体を除去し、非特異的結合を最小限に抑えます。
- マウンティング
- 免疫染色した網膜をガラス製の顕微鏡スライドにそっと移し、折り畳みや歪みを最小限に抑えるために慎重に平らにします。
- 網膜の中心に色あせ防止用埋込剤を少量塗布し、組織全体に均一に分布させます。
- 気泡を避けて、取り付けられた網膜の上にカバースリップを慎重に配置します(図3E、F)。
3. 画像処理
注意: 画像をRGC自動カウントソフトウェアにインポートし、カウントを開始します。網膜全体のBRN3A陽性細胞の数は数分で取得できます。AutoCount ソフトウェアを GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs) からダウンロードします。以下のソフトウェアの詳細なインストール手順に従います。
- GitHub のリンクからコードをダウンロードします。「Intelligent-quantifying-RGCs.zip」という名前のファイルを受け取ります。このファイルを解凍します。
- 必要なファイルをクラウドディスクからダウンロードし(資料の表を参照)、解凍します。ダウンロードしたファイルの名前は「yolov5_cpu」です。予期しない問題を回避するために、このパッケージを現在のフォルダーに解凍します。
- 手順 1 の Config ファイルを見つけ、その内容を "yolov5_cpu" パスを指すように変更します。
注: たとえば、ダウンロードした "yolov5_cpu" が "D:\1me\yolov5_cpu_" に配置されている場合は、手順 1 の "config.ini" ファイルを "D:/1me/yolov5_cpu" に変更します (\ の代わりに / を使用します)。(図 4A)。 - userinterface.exeをクリックしてグラフィカルインターフェースを開きます。初期読み込みが遅い場合があります (管理者として実行) (図 4B)。
- ソフトウェアを開いた後、「pmse_plus.pt」モデルファイルが存在するかどうかを確認します file ドライブCのルートディレクトリに。存在しない場合は、このディレクトリにコピーします。
注意: 「pmse_plus.pt」モデルファイルは、抽出されたIntelligent-quantifying RGCsフォルダ(図4C)にある「yolov5」フォルダのweightsフォルダにあります。 - 検出する画像を準備します。
メモ:ソフトウェアでは、一度に読み取れる画像は1枚または5枚のみです。さらに読み取るとエラーが発生します。
4. 自動セルカウント
- カウントソフトウェアを開きます(図5A)。
- [画像を開く]をクリックして、画像をインポートします(図5B)。
- [実行]をクリックすると、ソフトウェアが自動的にセルをカウントできます(図5C)。
注:ソフトウェアは、カウントされたセルを赤い四角いボックスでマークし、右上隅にセルカウントを表示します(図5D)。
結果
このプロトコールでは、マウス網膜のホールマウント免疫染色の方法論を詳しく説明し、綿密な組織調製、正確な抗体インキュベーション、信頼性の高い自動細胞カウントを保証します。この手順により、網膜神経節細胞(RGC)の堅牢な標識と定量が容易になり、さまざまな実験状況での細胞集団の正確な評価が可能になります。この方法は、野生型および緑内障モデルマウスのRGCをカウントするために使用され、一貫した結果が得られました。代表的な結果から、生後2ヶ月の時点での正常な成体マウスのRGC数は約45,000であることが示されています(図6)。
AIソフトウェアが正常モデルと疾患モデルでBRN3a標識RGCを正確に定量できるかどうかを評価するために、緑内障7のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)誘導マウスモデルを生成しました。このモデルのホールマウント網膜を抗BRN3Aで免疫染色し、自動計数ソフトウェアを使用してRGCを定量しました。その結果、バックグラウンド染色が比較的高いことが示されました(図7)。それにもかかわらず、ソフトウェアはほぼすべてのRGCを正確に識別することができました。この網膜では合計15,231個のRGCが同定されましたが、正常なマウス網膜では約45,000〜50,000個のRGCが同定され、重度の変性を示しています。したがって、AIソフトウェアは、最適な染色品質が低い網膜のRGCをカウントするためにも効果的に使用できます。
図1:RGC準備の概略図。 (A)眼球を取り出し、1x PBSに入れます。(B)眼球を氷上で4%PFAに3時間固定します。(D)レンズの抽出。(E)アイカップはハサミで4つのフラップに分割します。(F)強膜を剥がし、柔らかいブラシで網膜表面から破片をやさしく取り除きます。(G)網膜は抗BRN3Aで免疫標識されています。(H)蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡を使用してイメージングされます。(I) RGCの自動カウント この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ホールマウントマウス網膜の分離 (A)マウスは頸部脱臼により安楽死させられる。(B)マウスを平らな面に置きます。(C)ハサミで眼球を丁寧に取り除きます。(D)眼球を1x PBSにそっと置きます。(E)眼球は角膜の縁に鉗子で固定されています。(F)角膜の端に針で小さな切開を行います。(G)角膜を取り外した後、ボウル状の構造を取り除きます。(H)レンズは鉗子で慎重に取り外します。(I)網膜の損傷を避けるために、角膜の縁に沿って強膜の視神経に向かって小さな切開が行われます。(J)強膜は、鉗子で切開部に沿って引き裂かれます。(K)網膜を平らにし、絵筆でクリーニングします。(L)網膜を平らにし、氷冷したメタノールで急速に固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ホールマウントマウス網膜の免疫染色 (A)1x PBSで洗浄した後、網膜をブロッキングバッファーでブロックします。(B)網膜を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。(C)網膜を1x PBSで3回洗浄します。(D)網膜を二次抗体と室温で2時間インキュベートします。(E)網膜は、RGCが上を向いたスライドガラスに取り付けられています。(F)画像はレーザー共焦点顕微鏡を使用して取得されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:自動カウントソフトウェアのインストール。 (A) ステップ 1 では、ファイルパスを "yolov5_cpu" ディレクトリに更新します。(B)グラフィカルインターフェースが起動します。(C) ドライブ C のルート ディレクトリにモデル ファイルが存在することを確認します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:自動RGCカウントソフトウェアの操作 (A)カウントソフトウェアが開いた状態。(B)[ 画像を開く ]ボタンをクリックして、画像をインポートします。(C) RUN ボタンをクリックすると、自動カウントが開始されます。(D)カウントされたセルは赤い四角いボックスでマークされ、セル番号は右上隅に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウスRGCの自動カウント。 トップパネル(左)は、抗BRN3Aで免疫染色したフラットマウント網膜の代表的な結果を示しています。トップパネル(右)は、以前に開発されたソフトウェアによるRGCの自動カウントを示しています。スケールバー:100μm。上部パネルからの挿入図は拡大され、それぞれ下部パネルに表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:NMDA誘導緑内障マウスモデルにおけるRGCカウント。 左パネル:AIソフトウェアによって認識されたRGCを示すホールマウントRetinaの概要。右パネル:網膜の一部を拡大した画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
このプロトコルは、マウス網膜中のすべての網膜神経節細胞(RGC)を決定する方法を提供し、これは、緑内障研究のためのマウスモデルにおけるRGC変性の進行を監視するために使用することができます。マウスの網膜はデリケートな神経組織5であり、マウスの眼から全身網膜を分離するには繰り返しの練習が必要です。実験中に、固定時間が網膜の形態に大きく影響することがわかりました。生後2週齢前後のマウスの場合、強膜が薄くて弱いため、20分の固定時間で良好な結果が得られます。しかし、生後2ヶ月以上の成体マウスでは、20分間の固定では不十分です。3時間の固定時間は、無傷のホールマウント網膜を得るのに最適です。
網膜の分離の過程で、最も困難なステップは、網膜10から強膜を分離することです。強膜は、歯の先端を持つ2セットの鉗子を使用して、網膜から比較的簡単に剥がすことができます。2セットの鉗子を使用して強膜をつかんで引き離すことにより、強膜は細かく引き裂かれ、網膜から分離されます。
網膜神経節細胞(RGC)の高品質な画像は、正確な計数に不可欠です。網膜は三次元であるため、フラットマウントされた網膜8では、すべてのRGCが同じレベルにあるわけではありません。網膜をスライドガラスに取り付けるときは、その後のイメージングを容易にするために、網膜をできるだけ平らに広げる必要があります。イメージング中、画像は複数のフォーカスレベルで取得され、網膜全体のさまざまな領域にわたってすべてのRGCがキャプチャされます。
要約すると、このプロトコルは、フラットマウントマウス網膜内のすべてのRGCを自動的にカウントするための標準化された手順を提供します。この方法により、科学者はマウスモデルにおけるRGC変性を正確に評価することができ、RGC定量の効率と精度が向上します。このような精度は、緑内障および関連疾患の理解と治療に不可欠です。
開示事項
著者には開示すべき対立はありません。
謝辞
本研究プロジェクトは、中国国家自然科学基金会(82371059(H.Z.))、中国四川省科学技術局(2023JDZH0002(H.Z.))、成都科学技術局(2022-YF05-01984-SN (H.Z.))、四川省人民病院(30320230095(J.Y.)、30420220062(J.Y.))の支援を受けて行われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1×PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594-conjugated ヤギ抗ウサギIgG (H+L) | ThermoFisher | A-11012 | |
| 抗BRN3A抗体 [EPR23257-285] | Abcam | ab245230 | |
| AutoCountソフトウェア | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| クラウドディスク | Googleドライブ リンク | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| クラウドディスク | Baiduリンク | 抽出コード:g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| マーカー | シャーピー | ||
| ノーマルロバ血清 | バイオシャープ、ラボジック | 25030081 | |
| パラホルムアルデヒドマッ | クリン | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| 糖 | BBI、サンゴン | A610498 | |
| トリトンX-100 | フロックス、neoFroxx | 1139ML100 |
参考文献
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
再版と許可
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト