精度向上のためのマウス尿流動態技術の最適化

Summary

このプロトコルは、毛皮や皮膚による尿の吸収を防ぐために、シアノアクリレートで皮膚を防水するためのガイドを提供します。これには、接着剤を皮膚に塗布する方法、膀胱カテーテルを埋め込む方法、覚醒マウスの膀胱内測定および外部尿道括約筋電図記録用の電極の手順が含まれています。

Abstract

覚醒マウスの尿パラメータの正確な測定は、特に神経因性膀胱、心的外傷後脊髄損傷(SCI)などの状態における下部尿路(LUT)機能障害を理解するために重要です。しかし、マウスで膀胱測定の記録を行うことには、顕著な課題があります。録音セッション中にマウスがうつ伏せで制限された姿勢にあると、尿が毛皮や皮膚に吸収される傾向があり、排尿量(VV)が過小評価されます。この研究の目的は、覚醒マウスにおける膀胱測定および体外尿道括約筋電図(EUS-EMG)記録の精度を高めることでした。シアノアクリレート接着剤を使用して、尿道口と腹部の周囲に防水性の皮膚バリアを作成し、尿の吸収を防ぎ、正確な測定を保証する独自の方法を開発しました。結果は、シアノアクリレートを適用した後、VVとRVの合計が注入された生理食塩水の量と一致したままであり、実験後に濡れた領域が観察されなかったことを示しており、尿の吸収が成功したことを示しています。さらに、この方法は、外部尿道括約筋(EUS)に接続された電極を同時に安定化し、安定した筋電図(EMG)信号を確保し、覚醒したマウスの動きと実験者の操作によって引き起こされるアーチファクトを最小限に抑えました。方法論の詳細、結果、および影響について議論し、前臨床研究における尿流動態技術の改善の重要性を強調しています。

Introduction

尿の貯蔵と放出は、膀胱と外尿道括約筋(EUS)の協調活動に依存します。神経因性膀胱などの一部の病状では、膀胱排尿筋と括約筋の両方が機能不全になり、特に外傷性脊髄損傷(^SCI)1後に重大な膀胱の問題を引き起こす可能性があります。

小型のげっ歯類は、下部尿路(^LUT)2の前臨床機能を研究するための実験モデルとして一般的に使用されます。充填膀胱測定法(FC)およびEUS筋電図法(EUS-EMG)記録技術は、方法の選択、正確な測定、および結果の解釈に応じて、正確な客観的情報を提供することができます³。尿流動態テストは、排尿量(VV)、排尿効率(VE)、および膀胱容量⁴を評価するために一般的に使用されます。VEは、膀胱がどれだけ効果的に自己を空にできるかを測定します。これは、ボイドボリュームをボイドボリュームと残余ボリュームの合計(VV + RV)で割ることによって計算されます。一方、膀胱容量は、RV(排尿後に膀胱に残る尿^の量)にVV(排尿時に排出される尿の量)を足して算出されます5。したがって、VVとRVの測定は、他のパラメータを推論するための鍵となります。

尿流動態試験中にマウスのVVを正確に測定するには、さまざまな課題があります。げっ歯類の尿は、腹臥位で物理的に拘束されているとき、重力6の影響により腹側腹壁を通って下方に引き込まれる^{傾向がある。}この現象は、腹部の毛皮や皮膚による尿の吸収につながる可能性があり、その結果、排泄される尿の量が過小評価されます。マウスが産生する尿の量が少ないことを考えると、この吸光度が結果の精度に与える影響はさらに顕著です⁷。さらに、SCIのモデルでは、排尿筋括約筋の相乗障害(DSD)の影響により、VVは正常なマウスよりも低くなることが多く、これにより漏れ点の圧力と毛皮⁸による尿の吸収のリスクが増加します。これらの要因は、結果に大きな影響を与えます。したがって、マウスの終末尿流動態研究中のVVとRVの正確な測定は非常に重要です⁹。現在、マウスモデルで尿量を正確に測定する方法について、公開された文献で提供されている方法論には詳細が不足しています。

シアノアクリレート接着剤は、その迅速かつ効果的な接着特性10,11,12のために、人間および動物モデルの外科的処置で一般的に使用される接着剤の一種です。この接着剤は、皮膚¹³に塗布すると強力で柔軟な結合を形成するため、創傷や裂傷を閉じるのに特に有用である。さらに、それは毛皮や傷と接触する可能性のある尿や湿気に対する大きな障壁となり得る¹¹。

この記事では、シアノアクリレート接着剤を利用して、覚醒マウスの膀胱測定およびEUS-EMG記録で正確な結果を達成する、新しく費用対効果の高い技術を開発しました。この方法は、膀胱機能障害の根本的な原因を理解し、LUT障害のより効果的な治療法を考案するのに有益です。

Protocol

動物実験のプロトコルは、インディアナ大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。承認コード:21098MD / R / MSS / HZ承認日:2021年9月29日。

1. カテーテルの調製

1. 30 cmポリエチレンPE-30チューブ(.017インチx .030インチ)をカットします。ライターを使用してチューブの一方の端をフレアし、炎に触れないようにし、チューブが適切な丸いベル型の先端を形成したらライターを引き出します。
2. 25Gの針の約3/4をチューブのもう一方の端に慎重に挿入します。1mLのシリンジを調製し、滅菌済みの0.9%NaClで満たします。シリンジを25Gの針に接続します。
3. 生理食塩水を静かに注入して、適切な丸い先端と針の端からの漏れがないことを確認します。圧力が感じられず、生理食塩水がカテーテルをスムーズに流れることを確認してください。

2. 電極の調製

1. 長さ20cmの鋼線を2本用意します。鋼線を取り、コーティングゾーンの両端にサンドポリッシュを塗布して、ワイヤーの5mmを剥がします。
2. 25Gの針を取り、ワイヤーの片側に挿入します。ワイヤーを傷つけないように、針を慎重に挿入してください。ワイヤーの剥がれた部分をフックのように曲げます。フックは、ワイヤーをEUS筋に接続するのに役立ちます。
3. はんだを使用して、ストライプワイヤのもう一方の端にピンを取り付けます。はんだ付けは、ピンをワイヤに固定し、強力な接続を確保するのに役立ちます。錫鉛はんだ付けは、溶けてワイヤーとピンを覆うまで加熱してください。

3.動物の調製

1. Institutional Animal Careによると、動物施設に収容されている雌のC57BL/6マウス(8週齢、体重18-20 g)で、明暗サイクルは12時間で、水と標準的な食品ペレットに無制限にアクセスできます。

4. 手術中の麻酔

1. 動物を2%イソフルランと純酸素(1L / min)チャンバーに入れます。マスクに移す前に、陰性のつま先つまみ検査を使用して動物の完全な麻酔を確認してください。確認したら、ガスの状態をマスクに変更します。
2. 麻酔マスクが滅菌手術野の適切な位置に固定されていることを確認してください。動物の仰臥位を滅菌ドレープに置き、鼻を吸入用小さなマスク(2%イソフルランで0.8-1 L / min)に入れて、麻酔を続けます。.

5. 手術の準備

1. 動物の手足をテープで固定します。電気カミソリを使用して、下腹部と尿道口(生殖器領域)の周りの毛を剃ります。
2. 目の乾燥を防ぐために、目の軟膏を塗布します。ポビドンヨード溶液を使用して削った部分を準備し、70%エタノールで溶液を拭き取ります。手術部位に滅菌ドレープを敷きます。

6. 外科的処置

1. 膀胱カテーテルの埋め込み
   1. 手術用顕微鏡下で、メッツェンバウムのまっすぐな鈍いハサミを使用して、腹部骨盤の皮膚の正中線に1〜2cmの切開を作成します。正中線の筋膜と筋肉を切開して、切開創を通して膀胱を露出させます。
   2. 切開創を通して膀胱が見えたら、必要に応じて周囲の臓器や組織を引っ込めて、手術野をはっきりと見ることができます。膀胱に不必要な操作や張力をかけないように注意してください、これは尿漏れや周囲の構造の損傷などの合併症につながる可能性があるためです。
   3. 膀胱ドームをつかみ、テーパーチップ針付きの5-0非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して巾着を置きます。
   4. マイクロハサミを使用して、巾着のひもの内側に小さな膀胱瘻造設術を作成し、尿が流出するまで穴を開けます。
   5. カテーテルの丸い先端をつかみ、穴に挿入します。チューブの先端が穴を通過したら、チューブの周りに巾着のひもを縫合します。次に、先端が縫合糸の下に感じられるまで、チューブをゆっくりと外側に引きます。
   6. チューブのもう一方の端から1mLの生理食塩水をゆっくりと注入して、膀胱を膨張させます。カテーテルの周囲に漏れがないか確認してください。漏れがある場合は、追加の縫合糸を留置します。
   7. 生理食塩水が尿道から出てきたら、生理食塩水を抜いて膀胱を減圧します。
2. EUS電極の埋め込み(図1)
   1. 手術用ハサミを使用して、腹部切開部を骨盤底まで延長します。
   2. 膀胱に沿って、筋肉と膜を陰部管に移動し、尿道と外括約筋を見つけます。腸骨血管や中尾血管、陰部神経を傷つけないように注意してください。
   3. 電極を含む針を使用して、尿道口から1cm離れた両側に皮膚に穴を開けます。
   4. 鉗子でフックの先端を慎重につかみ、針を皮膚からそっと引き離します。
   5. 電極の先端を使用して、EUS筋を慎重に両側に引っ掛けます。深く打ちすぎると筋肉に害を及ぼし、尿漏れの可能性につながる可能性があるため、避けてください。
   6. 3-0非吸収性モノフィラメントを使用して、骨盤と腹部の筋肉と皮膚を縫合します。
3. 肌の防水性
   1. 電極が出る皮膚にシアノアクリレート接着剤の薄層を塗布して、電極を所定の位置に固定します。
   2. シアノアクリレート接着剤を尿道口を囲むように1 cm離し、さらに腹部と縫合領域まで3 cm伸ばして塗布します。接着剤との接触を避けるために、鉗子で口を慎重に持ち上げます。
   3. 0.5〜10μLのマイクロピペットを使用して加速剤液を引き出し、接着剤を乾燥させます。
      注意: 加速剤液は可燃性液体です。
   4. 適切な接着反応を確保するために、促進剤液を追加します。これにより、接着剤がより早く乾燥し、しっかりと固まるようになります。
4. 尿流動態の準備。
   1. 長さ、幅、深さが4.5cmの倒立ポリスチレン計量ボートを準備します。底面が4cmの三角形に切り、このスペースにマウスの尿道口を入れます。尿を採取するスペースの下に、37 mm x 24 mm x 5 mmの使い捨てベースモールドを置きます。
   2. マウスを腹臥位に再配置し、ガスマスクを装備したカスタムメイドのプレートに慎重に移動します。
   3. 尿道口が溝内に適切に配置されていることを確認してください。マウスの頭と手足をテープで優しく拘束し、マウスが完全に意識を取り戻すまでプレートを加熱パッドに置きます(図2)。
   4. マウスが完全に覚めているとき、つまり麻酔からの回復後少なくとも40分後にのみ、膀胱内測定を行います。

7. 膀胱内測定とEUS-EMG記録の準備

1. 製造元の指示に従って、輸液ポンプをセットアップして校正します。
2. 直径19.05 mmの20 mLシリンジを用意し、室温で滅菌0.9%NaClで満たします。シリンジを輸液ポンプに固定します。注入速度を0.01mL/minに設定します。
3. PE-30チューブでシリンジを三方コネクタの片側に接続します。膀胱カテーテルを反対側の圧力トランスデューサーに接続します。膀胱カテーテルを接続する前に、必ずすべての気泡を取り除いてください。
4. 圧力トランスデューサーをマウスの膀胱と同じレベルに固定します。圧力トランスデューサは、アンプを介してデータ収集システムに接続されています。
5. 1つのアースラインフックをスキンに取り付け、もう1つを電極コネクタサイトに接続します。ソフトウェアに圧力を記録します。
6. ソフトウェアを起動した後、膀胱内圧(IVP)とEUS-EMG信号を確認してください。サンプル名を保存し、時刻を設定します。
7. ポンプの注入を開始します。信号を録音します。

Results

膀胱測定法とEUS-EMG活動追跡法を用いてデータを分析した。連続膀胱測定法では、膀胱に生理食塩水を注入すると同時に、膀胱内の圧力と体積の変化を測定します。VVを測定するために、0.4 mLの生理食塩水を0.01 mL / minの速度で注入し、キャップ内で40分かけて尿を採取しました。排尿後の残留物 (PVR) は、カテーテルを通して生理食塩水を吸引することによって得ることができます。接着剤を使用しない正常なマウスでは、VVとRVの合計は0.4mL未満であることがよくありました。実験後、尿の吸収により腹部と口蓋の周囲の毛皮が濡れていました(図3A)。小さな毛皮を覆うために接着剤の薄い層を塗布した後、VVとRVの合計は0.4mLであり、濡れた領域はありませんでした(図3B、C)。

得られた膀胱内測定のトレースにより、最大排尿膀胱収縮圧(27.2 cmH₂O)、収縮時間(16.26 秒)、収縮間間隔(4.48 分)など、さまざまなパラメーターの詳細な分析が得られました。同時に、 図4に示すように、マウスの膀胱内圧とEUS-EMG信号の良好な記録が得られました。

多くのマウスの尿流動態測定は麻酔下で行われます¹⁴。これは、電気信号のノイズと動物の動きに起因する尿の損失を減らすための便利な方法のように思えるかもしれませんが、麻酔薬が尿の流れに影響を与える可能性があることを考慮することが不可欠です。これにより、不正確または信頼性の低い結果^{につながる可能性があります15}。したがって、覚醒状態の動物における尿流動態記録は、生理学的条件により近い結果を得るためにより人気があります。覚醒している動物の尿流動態記録は、通常、イソフルラン¹⁶からの回復の40〜50分後に開始されます。このプロセスには、マウスを綿密に監視して、マウスが麻酔を必要とせずにリラックスして快適であることを確認することが含まれます。意識のあるマウスの動きが尿流動態信号^5,14に影響を及ぼし、リークポイント圧力、VV、および^VE17などの特定のパラメータの不正確な測定につながることが、いくつかの実験を通じて観察されている。その結果、意識のあるマウスを部分的に拘束する方法を実装して、より信頼性の高い尿流動態結果を確保しました。しかし、限られた拘束でも、意識のあるマウスは麻酔からすぐに目を覚ますときにまだ苦労しており、電極フックとEUSとの間の接触が外れたり不安定になったりして、EUS-EMG信号に大きなノイズが発生する可能性があります。図3Bに示すように、これらのアーチファクトを最小限に抑えるために、皮膚からの出口点に電極を接着剤で固定するアプローチをとっています。この方法は、電極の動きとその後の電極が生成する可能性のあるアーティファクトを最小限に抑えるのに効果的であることが証明されています。

図1:筋電図電極の変位。 電極(黄色のアスタリスク)を外側の尿道筋に両側に埋め込む(EUS;黒矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:覚めているマウスの拘束。 カテーテルと電極を移植した後、マウスをプレート上に拘束して、尿流動態記録中の安定性を確保しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:尿流動態記録後の腹部と尿道の領域 (A)腹部と生殖器領域に大きな湿った領域(赤い破線で輪郭が描かれている)が見られました。(B)乾燥した防水性の腹部および生殖器領域は、記録後にシアノアクリレート接着剤(赤い破線で輪郭が描かれた)で作成されました。(C)尿流動態記録中に鼻道に形成された尿滴(黄色の矢印)は、皮膚や毛皮に吸収されずに滴として長時間留まりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:覚醒状態および拘束された雌マウスにおける膀胱測定法および体外尿道括約筋電気検査(EUS-EMG)の代表的な痕跡 (A)トレースA:連続膀胱測定法(CMG)とEUS-EMG(それぞれ上部と下部のトレース)の同時記録。(B)トレースBは、トレースAの拡張部分であり、異なる時間スケールの長方形のボックスで示されます。排尿期では、断続的な排尿は、EUS-EMG活動の低強直期および減少期(下図;矢印)に発生したCMG記録の膀胱内圧の低下と一致しました(上のトレース;矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

この尿力学技術は、覚醒マウスと拘束されたマウスの尿量とEUS-EMG信号を測定するための改善された手順を説明しています。尿道口や腹部の周囲に毛皮が存在すると、尿を吸収してVV測定の精度に支障をきたすことがあります。尿道口と腹部の周囲の被毛は手術前に慎重に剃られていましたが、これらの領域と皮膚に残った小さな被毛はまだ尿を吸収しており、通常は記録後に腹部に濡れた部分が残っています。この問題は、尿道口と周囲の皮膚との間の距離が極めて短いため、雌のげっ歯類において特に顕著である¹⁸。この技術では、シアノアクリレート接着剤を腹部と周囲の尿道皮膚に塗布して防水性のある皮膚表面を作成し、尿流動態記録中の尿量を正確に評価することで、膀胱の機能をよりよく理解することができました。接着剤は正確に塗布され、ミータスの周囲と近くの皮膚を確実に覆いました。接着剤を塗布する目的は、毛皮が尿を吸収するのを防ぐ防水バリアを作成することでした。接着剤は、尿道口の凝集や詰まりを避けるように注意しながら、均等に広げられました。手順の記録された結果は、VVとRVの合計が注入量で一定に保たれ、それ以上の湿った領域が観察されなかったため、私たちの目的が完全に達成されたことを確認しました。測定の精度を確認するために、実験後に膀胱を確認したところ、膀胱は空であることがわかりました。膀胱をチェックするこの追加のステップは、尿貯留の可能性を排除し、注射器を介して引き出した量とRVの実際の量との間に不一致を引き起こすため、非常に重要です。

この方法には制限があります:1)縦断的および複数の時点の研究には適していません。2) 自由に動くマウスには適用できません。3)EUSから電極が外れると、腹部を開いて再度取り付けることが困難になります。4)シアノアクリレート接着剤は、その使いやすさと有効性により、多くの外科手術現場で貴重なツールですが、潜在的なリスクを最小限に抑えるために、慎重に使用し、適切な安全プロトコルに従うことが重要です。シアノアクリレートは一般的に皮膚にとって安全ですが、頻繁に接触することは避け、研究者は適切な個人保護対策を講じる必要があります。シアノアクリレート接着剤は、吸入すると有毒な蒸気を放出する可能性があります。これらの蒸気を吸い込むリスクを最小限に抑えるために、研究者はより高いレベルの湿度を維持し、作業環境内の部屋の換気を最適化する必要があります¹⁹。特殊な空調フィルターを使用して、蒸気の毒性をさらに低減することもできます。

全体として、この実験は、尿流動態記録中の排尿測定の精度に関する重要な洞察を提供し、注入後のVVとRVの総量の不一致につながる可能性のあるエラーの潜在的な原因を特定するのに役立ちました。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アクセラレータ	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
シアノアクリレート	TED PELLA, Inc	14478
使い捨てベースモールド	TED PELLA, Inc	27147-4
輸液ポンプ	ハーバード装置 PHD ULTRA	70-3006
イソフルラン	ヘンリー・シャイン 1182097
PIN	ワールド精密機器	5482
ポリエチレンチューブ 30	ブレインツリー・サイエンティフィック	PE30
滅菌計量ボート	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ インスツルメンツ	249022