ゼブラフィッシュの電気生理学的信号を記録するための新しいシステムとしてのZebra II

サマリー

この研究では、ゼブラフィッシュの長期心電図取得と分析のための高度なシステムであるZebra IIを紹介しています。このシステムは、制御された環境で複数の魚を処理するための独立した灌流システムとマルチポイント電極を特長としています。アミオダロンの急性影響を野生型ゼブラフィッシュで評価し、解析しました。

要約

ゼブラフィッシュとその変異株は、生物医学研究、心血管研究、薬物スクリーニングで広く使用されています。現在の研究では、新しいシステムの商用バージョンであるZebra IIが提示されています。このプロトコルは、制御可能な作業環境内で複数のゼブラフィッシュから心電図(ECG)を取得し、分析する方法を示しています。このデバイスは、外部の独立した灌流システム、4点電極、温度センサー、および組み込み電子システムで構成されています。これまでの研究では、デバイスのプロトタイプは、確立されたiWORXシステムに対するいくつかのテストを通じて検証され、薬物介入に対する同様のデータ品質とECG反応が実証されました。その後、麻酔薬や温度変動がゼブラフィッシュの心電図に及ぼす影響について調査し、迅速なデータ評価が必要となりました。麻酔薬や薬剤を一貫して送達する装置の能力のおかげで、現在のシステムでサポートされていた5分よりも大幅に長い1時間までECGデータ収集を延長することができました。この論文では、4匹のゼブラフィッシュのデータを活用した先駆的なクラウドベースの自動解析を紹介し、組み合わせ実験を効率的に行う方法を提供し、時間と労力を大幅に削減します。このシステムは、心電図の捕捉と解析、特に野生型ゼブラフィッシュの薬物誘発性不整脈の検出に有効であることが証明されました。さらに、複数のチャネルでデータを収集する機能により、ゼブラフィッシュモデルを用いたランダム化比較試験の実施が容易になりました。今回開発した心電図システムは、既存の限界を克服し、ゼブラフィッシュの創薬や心血管系研究を大幅に加速する可能性を示しています。

概要

心血管疾患(CVD)は、世界の主要な死因です。2024 AHA Update Reportによると、米国では毎日約2552人がCVDで死亡しており、CVDの直接的および間接的なコストの平均は、2017年から2018年にかけて3,780億ドルと推定されています¹。心房細動(AF)は、米国で最も一般的な心不整脈の1つであり、²であり、予後不良と関連しており、CVDと非心血管疾患のシナリオの両方で脳卒中と死亡のリスクを高め、有害な結果のリスクを高めます³。このタイプの不整脈は、心房内の急速で不規則な電気的活動によって区別され、通常は速く不規則な心室リズムをもたらします⁴。さらに、COVID-19の最近の出来事を考えると、COVID-19に関連して不整脈の出現が増加していることを示す研究と証拠の数が増えており、主に洞性徐脈⁵に関連しています。AFの反対側では、洞性徐脈は心臓のリズムが低下し、遅くなり、心拍数は毎分60拍(bpm)を下回ります。この診断には、60 bpm 未満の速度で正常な洞調律を示す心電図 (ECG) が必要です。

ゼブラフィッシュ、ダニオ・レリオは、形態学、生理学、遺伝学の両方でヒトと相同性があるため、心血管および医薬品開発研究の理想的なモデルであることが証明されています^6,7.ゼブラフィッシュは、ヒトの4つの心臓室と比較して2つの識別可能な心室しか持っていませんが、同様の伝導システムを持つ同様の収縮構造を持っています^8,9。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、心不整脈の研究や、ECG解析を通じて関連する遺伝的経路と電気生理学的特性との関連を探るのに適しています。ゼブラフィッシュの心電図記録用のセンサー設計については、従来の針電極が一般的に使用されています¹⁰。他の研究では、記録されたデータの品質を評価するために、タングステンフィラメント、ステンレス鋼、銀線などの材料を組み込んだ、異なる材料で作られた異なるタイプの針を設計することにより、従来の針の代替案を提示しました¹¹。ポータブルECGキットとともに、彼らは研究ラボと教育ラボの両方のためのユニバーサルプラットフォームの確立を目指しました。

針システムは他の研究でも展開されました^11,12,13,14 生物学的および/または薬物誘発性効果に関する研究を実施し、有望な結果を示しました。しかし、最適なシグナルを得るためには、ゼブラフィッシュの真皮に針を慎重に挿入する必要がありました。この侵襲的な処置は、針の鋭さのために魚の心臓に損傷を与える可能性があり、したがって、信号の形態を変える可能性があります¹³。さらに、電極を小さな心臓に正確に配置して、明確な心電図キャプチャを確保するには、大きな学習曲線があります。その結果、微小電極アレイ(MEA)や3Dプリントセンサーなど、さまざまな代替プローブシステムが導入されています。私たちのチームと他の研究者は、データ収集にMEAを成功裏に活用し、良好な信号対雑音比(SNR)と高い空間的および時間的分解能を提供するデータを達成しました^15,16,17。たとえば、魚の心臓を包み込むMEAを導入し、サイト固有のECG信号をキャプチャできるようにしました^15,16。対照的に、別のチームは、てんかん研究用の複数の脳波(EEG)を記録することを目的としたポリイミドフィルムから作られたフレキシブルプリント回路基板(FPCB)に基づいて、異なる種類のMEAを開発しました¹⁸。MEAは多数の信号の記録を可能にしますが、電極チャネルの数が限られているため、一度に1匹の魚しか評価できないという制限があります。この制限に対応して、最近、複数の魚からの同時ECG記録が可能な高度なシステムを紹介しました¹⁹。このシステムは、厚さ125μmのポリイミド製の電極を2種類採用し、ハウジングの底部に金スパッタ電極を配置してデータ取得を容易にします。しかし、水循環ポンプを含めるとノイズが発生し、ECG信号の信号対雑音比(SNR)の品質に影響を与えました。さらに、かさばり、高価なデータ収集ツールを使用する必要があり、コンピュータへの有線接続が必要でした。市場では、iWORXのようなシステムは、コンパクトなアンプを通じて携帯性が向上していますが、未解決の問題に直面しています:(i)記録時間が短すぎる(3〜5分)など、急性の薬物効果を含む実験など、より長い時間を必要とする実験には。(ii)動物に麻酔をかける必要性、これは動物にストレスを与え、自然的な心臓電気生理学的データを歪める可能性がある。(iii)手動の逐次測定は、多数の魚の研究を妨げます。(iv)オフラインの労働集約的なECGデータ処理の必要性。重要なことは、変異体の表現型を解析するためのマイクロエレクトロニクスを組み込んだハイスループットシステムはまだ登場していないことです。したがって、不整脈表現型と変異型遺伝子型との関連性を明らかにし、単一の変異型遺伝子型に関連する複数の不整脈表現型を特定し、ゼブラフィッシュモデルを用いた心血管薬の有効性を検証するためには、長時間の心電図記録を可能にするハイスループットシステムの構築が重要です。その結果、2022 年に Zebra II システムの画期的なプロトタイプを発表しました。この新しいシステムは、一度に複数の魚から拡張されたECG記録を実行するように装備されています。そのために、IoT(Internet of Things)技術を活用した無線データ伝送や、モバイルアプリケーションによるデータ分析など、社内に電子システムを構築しました。IoTテクノロジーを取り入れたことで、システムの柔軟性と移植性が向上しただけでなく、ゼブラフィッシュモデルの研究のためのリモートコラボレーションも容易になりました。以前の研究では、広範なテストを通じてシステムの有効性を検証し、1)4匹の魚から同時にECGデータを取得する能力を示しました。2)最大1時間の連続ECG記録を実行しますが、これは数分しかキャプチャしない既存のシステムの容量を大幅に超えています。3)トリカインの濃度を50%下げて使用することにより、麻酔の交絡効果を最小限に抑えます。さらに、このシステムは、制御された実験条件下で、Tg(SCN5A-D1275N)変異体と野生型魚の両方において、ナトリウム誘発性洞房(SA)ブロック、温度誘発性心拍数変化、薬物誘発性不整脈など、さまざまな実験で長時間の心電図記録に対して高い能力を示しました。このシステムは、拡張ECG記録のために複数の電極チャネルを採用することで、ランダム化比較試験の実行をさらに可能にし、実験グループごとに2匹の魚を同じ条件下で研究することが可能になります²⁰。このホワイトペーパーでは、4点電極を特徴とするシステムのアップグレードバージョンを紹介します。この機能強化により、ユーザーは魚のさまざまな場所からECG測定値をキャプチャできるようになり、低品質のECG信号を取得する可能性が大幅に減少します。さらに、このイテレーションは、以前の研究で概説した機能の大部分を基に構築^19を改良しています。この進化した心電図システムは、既存の制限に対処する上で大きな期待が寄せられており、それによってゼブラフィッシュの不整脈表現型の解析や薬物のスクリーニングが大幅に容易になります。4点電極の革新的な追加は、野生型ゼブラフィッシュの薬物誘発性不整脈に関する簡単な研究を通じて厳密にテストされ、その有効性がさらに検証されました。

プロトコル

倫理ガイドラインを厳格に遵守することで、実験に関与するゼブラフィッシュの健康と適切な取り扱いが保証されます。すべての実験活動は、動物施設管理委員会(IACUC)が定めた基準に従って実施されました。ここで詳述されている実験と調査結果は、認定プロトコルAUP-21-066の下でIACUCの承認を得て実施されました。

1. 原液の調製と保管

注意:トリカイン原液は、適切な個人用保護具(PPE)を着用し、ヒュームフードで調製してください。

1. 400 mgのトリカイン粉末を測定し、97.9 mLの脱イオン(DI)水に溶解します。.マグネチックスターラーを容器に入れ、溶液を徐々に混合します。
2. 17 mL未満のNaOH溶液を段階的に添加してpHを調整します。pHが6.8.-7.2の範囲に達するまで、NaOH滴を添加し続けます。
3. pHを調整して保存するために必要な添加されたNaOHを考慮して、トリカイン溶液の最終濃度を決定します.
   注:トリカイン溶液は光に敏感であるため、使用しないときは4°Cで琥珀色の容器に保管する必要があります。
4. アミオダロン258.13 mgを測定し、1 Lの脱イオン水に溶解します。.マグネチックスターラーを容器に挿入し、溶液が完全に溶解して粉末がなくなるまで数分間攪拌します。使用しないときは、溶液を4°Cで冷蔵庫に保管してください.
   注:アミオダロンはドラフト内で調製し、4°Cの冷蔵庫内に保管する必要があります。

2. 魚の飼育

1. 魚は循環水システムに接続された個々のタンクに保持し、温度を28〜29°Cに保ちます。
2. 水質の継続的な監視を確保し、14時間/10時間の昼夜サイクルを順守します。
3. 40匹の魚を4つのグループに分け、それぞれが10匹の魚で構成され、別々の水槽に収容します。

3. デバイスのセットアップ

注:ステップ3.2で概説した手順は、デバイスの各チャンバーに対して実行する必要があります（図1)を実行する必要があります。各チャンバーは異なる方法で設定することができますが、実験の一貫性を保つために、すべてのチャンバーで均一な設定を維持することが推奨されます。

1. デバイスを電源に接続し、フロントパネルにある赤いボタンを押して操作を開始します。
2. デバイスのタッチスクリーンをナビゲートして、設定するチャンバーを選択します。
   1. ローパス・フィルタの設定を 0.1 Hz に、ハイパス・フィルタの設定を 500 Hz に調整します。ゲインの設定を 10,000 に調整します。
3. 前面蓋を持ち上げて、4つのチャンバーにアクセスします。実験を開始する前に、各チャンバーのスポンジ(標準的なセルローススポンジ)をトリカイン溶液に浸し、余分な液体を絞り出します。
4. 魚を導入する前に、4電極アレイを回転させて、スポンジにアクセスできることを確認します。

4. アミオダロン治療

注:水槽からの水(魚の水)を利用して、アミオダロンとトリカインの希釈溶液を準備します。ステップ4.3と4.4は、ステップ4.1で調製した各溶液について、ステップ2.3で分離したグループごとに繰り返す必要があります。

1. 以下に説明する手順に従って、アミオダロンストック溶液を希釈します。.
   1. 8.75 mLのストック溶液を41.25 mLの魚水に希釈して、70 μMの濃度にします。
   2. 12.5 mLの原液を37.5 mLの魚水に希釈して、100 μMの濃度にします。
   3. 25 mLの原液を25 mLの魚水に希釈して、200 μMの濃度にします。
2. 4 mLのトリカインストック溶液を100 mLの魚水に希釈して麻酔液を調製し、トリカイン濃度を0.16 mg / mLにします
3. 調製したアミオダロン溶液に各魚を個別に5分間浸漬し、タイマーを使用して浸漬時間を正確に監視します。
4. 麻酔のために魚をトリカイン溶液に2〜3分間移します。治療が魚の死を引き起こさないようにしてください。魚が色を失ったり、えらの動きが大幅に減少したりするなどの異常な行動を示した場合は、すぐに溶液から魚を取り除き、きれいな魚の水に戻します。

5. 心電図データ収集

注:手順4.4を完了した後、すぐにこれらの指示に従ってください。デバイスを密封する前に、各チャンバーでこのプロセスを繰り返します。チャンバーは、幅が4〜10mm、長さが25〜50mmの魚を収容するように設計されています。

1. 魚をトリカイン溶液から持ち上げてスポンジの上に置き、腹側が上を向くようにします。
2. 電極アレイを魚の胸部にひし形に配置して、4つの異なるポイントから同時にECG信号をキャプチャします（図2A,B)。すべてのピンが魚の皮膚に接触するように、各電極を慎重に調整してください。
   1. 各電極を回転させ、ピンが魚の下側に接触するまでピンを下げます。ピンが高すぎる場合は、対応するつまみネジを時計回りに回して、魚に触れるまで下げます。
   2. すべてのチャンバーの電極について、上記の調整を行います。
3. すべての電極アレイが操作チャンバー内の魚の上に正しく配置されたら、チャンバーの蓋を閉じます。
4. タッチスクリーンで各チャンバーを選択して録音用にマークし、画面上の[録音]ボタンをクリックして録音を開始します。
5. 2分後に[停止]ボタンをクリックし、停止後に画面にポップアップするプロンプトウィンドウから[保存]ボタンをクリックします。特定の研究ニーズに応じて、情報をディスクまたはクラウドに保存します。

6. 4電極アレイ位置決めシステムのトラブルシューティング

注:時折、1つまたは複数の電極が明確なECG信号をキャプチャできず、再配置が必要になることがあります。必要に応じて、次の手順を使用して電極アレイのトラブルシューティングを行います。

1. デバイスインターフェースのStopボタンを押して、録音プロセスを停止し、信号に一貫性のないチャンネルを特定します。
2. 電極チャンバーにアクセスするために、前面蓋を持ち上げます。問題の原因となっているチャンバーと特定の電極を特定します。
3. 上部のつまみネジを時計回りに回して、電極と魚の接近を調整します。この動作により、電極が魚に近づきます。
4. 必要に応じて手順6.3を繰り返します。単に近づくだけでは問題が解決しない場合は、満足のいく信号が得られるまで、電極を魚の別の場所に回転させます。

7. データの抽出と分析

注:このホワイトペーパーで紹介されているすべての基本的なデータ分析では、ウェーブレット手法^{21を使用して}、さまざまな種類のノイズと正常な洞拍の標準偏差(SDNN)を低減し、1分間のセグメントでのHRの心拍分散を計算します。

1. データがディスクまたはクラウドに保存されたら、分析のためにデータを取得するか、さらに処理するためにクラウドサーバーに直接送信します。
2. 画面上の「参照」ボタンをクリックして保存したデータに移動し、使用するデータセットを選択します。
3. 画面上のオプションで[抽出]ボタンを選択し、USBドライブをデバイスの背面部分に接続してデータを抽出します。
4. デバイスの指示に従って、選択したデータセットを外付けドライブに保存し、後で取得および分析できるようにします。

結果

複数の魚から同時にECG信号を記録できる能力はこのデバイスの大きな特徴であり、ゼブラフィッシュやその他の類似種を用いた薬剤研究や心臓研究に要する時間を大幅に短縮できるという大きな利点があります（図1）。魚の個体間の解剖学的差異、特に電極の配置に関しては、正確なECG信号の記録が困難な場合があります。従来、鮮明なECG信号を得るには、機械的な拍動やモーションアーチファクトの混入を避けるため、アクティブ電極を心臓の上に配置し、リファレンス電極を下腹部に向けて配置する必要がありました。しかし、心臓が組織の深い位置にあることや、魚の体表が不均一であることから、心臓の正確な位置を特定することは困難な場合があります。場合によっては、正確に配置するためにマイクロマニピュレーターで電極を操作する必要があり、質の高い信号を捕捉できるまで、何度も試行を繰り返さなければならないことがあります。

これらの課題を克服するため、本システムでは従来の単一作用電極ではなく、4つの電極で構成される革新的なアプローチを導入しています。各電極は独立して動作し、...

ディスカッション

現在の手順は、私たちのチーム²⁰ によって行われた以前の研究からのこの新しいデバイス バージョンに従って変更および改善されました。ここには、デバイスのラベル付きコンピュータ支援設計 (CAD) も含まれています。

プロトコルのトラブルシューティング ガイドで強調されているように、これらのステップは ECG 信号の品質に決定的な影響を与えるため、ユーザーは特定の重要なステップを勤勉かつ正確に実行する必要があります。以前の研究²⁰の結果と一致して、電極の位置は、ゼブラフィッシュサンプルから高品質で鮮明なECG測定値を取得する上で重要な役割を果たします。この方法では、作動電極の数が 1 つから 4 つに拡大され、追加の自由度が導入されるため、最適な結果を得るには、補足的なトラブルシューティング手順と魚の腹側領域への洗練された電極配置が必要です。

この装置の利点と新しい特徴は、1時間にわたる研究に限定されたマルチステップ実験のための拡張測定...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミオダロン塩酸塩	Sigma-Aldrich	PHR1164-1G	アミオダロン粉末
卓上型pH/mVメーター	Sper Scientific	10500308
エチル3-アミノ安息香酸、メタンスルホン酸塩、98%、ACROS Organics	フィッシャーサイエンティフィ	AC118002500	カインパウダー
イソテンプホットプレートスターラー	フィッシャーサイエンティフィック	SP88854200
ゼブラIIシステム	Sensoriis	N / A	商用ゼブラフィッシュECG記録システム
ゼブラフィッシュECGシステム	iWorx	ZS-200	商用ゼブラフィッシュECG記録システム

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