適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上

サマリー

適応性のあるGibson Assembly分子クローニングモジュールは、分子生物学研究室の学生向けのコースベースの学部研究経験(CURE)形式で採用されました。学生の学習成果の評価では、CUREの完了後に分子クローニングに対する理解と自信が向上したことが示され、天然物生合成研究のために新規プラスミドがクローニングされました。

要約

分子生物学技術の継続的な進歩には、分子生物学のカリキュラムを定期的に改良して、学生が最新の能力で労働力に参入するための効果的な準備が必要です。特に、高度にカスタマイズ可能で適応性の高い分子クローニング技術であるGibson Assemblyの登場により、多くの研究環境における分子クローニングの状況が進歩しました。そこで、カリフォルニア・ポリテクニック州立大学サンルイスオビスポ校の分子生物学研究室に展開するためのGibson Assemblyクローニングモジュールを作成し、このモジュールによる学生の学習成果を評価しました。コースの3回の反復で、学生は、天然物生合成の研究プロジェクトを支援するために、3つのユニークなプラスミドライブラリをクローニングする実験ベースの独立したプロジェクトに参加しました。学生には、分子クローニングに関する理解度と分子生物学の用語と技術に対する自信を評価するための事前および事後アンケートが行われました。学生の回答は、分子クローニングの概念を学ぶことと、分子クローニングの用語と技術に対する自己申告の自信の両方で有意に増加したことを示しました。このモジュールフレームワークは、さまざまなアプリケーション向けのGibson Assemblyを教えるために一般化することができ、研究プロジェクトを進めながら適応性のある創発的なクローニング技術を教えるためのツールキットをインストラクターに提供します。

概要

基本的な分子生物学の概念と実験技術について学部生を訓練することは、これらの方法論が学界や産業界を含むさまざまな研究環境で一般的であるため、彼らの科学的および専門的な開発にとって非常に重要です。そのため、カリフォルニア工科大学サンルイスオビスポ校(Cal Poly)の生物学(分子細胞生物学集中)および生化学専攻の学生は、これらのトピックを学び応用するために、上位の分子生物学実験室コースを受講する必要があります(CHEM/BIO 475)。このコースの基本カリキュラムは、学生がトポイソメラーゼベース(TOPO)クローニングを行い、酵母相補的DNA(cDNA)テンプレート¹から調製されたアクチン含有プラスミドを組み立てるというものです。学生は、本物の研究仮説を模倣した問題に基づいて実験を設計し、実験室での実践と探究型学習への親しみを深めます。分子生物学の分野における継続的な進歩には、対応するカリキュラムが、労働力のための現代的な能力を持つ学生を準備するために適応する必要があります。特に、Gibson Assemblyの使用は、科学界でより支配的になっています。この方法はもともと人工染色体²を合成するために確立されましたが、このレポートの時点で5,000を超える出版物がGibsonらの元の研究を参照しています。Gibson Assemblyは、従来のクローニング法と比較して独特で、高度にカスタマイズ可能で、ジャンクションを生成するための制限部位を必要とせずに、複数の直鎖状DNAフラグメントを簡単にライゲーションできます。そこで、CHEM/BIO 475のカリキュラムを刷新し、最新の分子クローニング技術を取り入れ、探究型コースモデルを改善する機会を得ました。

学生の研究経験^が、科学における概念的理解、スキル開発、および持続性の向上に貢献することが確立されていますが3、すべての学部生が研究室に直接参加する機会があるわけではありません。研究室での学生の能力が限られているという課題に対処するために、コースベースの学部研究体験(CURE)が開発され、採用され、教室での本格的な研究を通じて科学のアクセシビリティが向上しています。CUREはその実施方法によって異なりますが、科学研究の5つの信条に対応する共通の実践が確立されています。適切に設計されたCUREでは、学生は1)科学的実践を使用し、2)研究プロジェクトに協力し、3)新しい発見を試みる、4)教室の外で関連する仕事に貢献し、5)^{実験が失敗した場合に}仮説と方法を再評価および修正します4。従来の学生の研究室での研究経験と同様に、CUREは、科学、科学スキル、プロジェクトのオーナーシップ、科学、技術、工学、数学(^{STEM)に対する}学生の自信、プロジェクトのオーナーシップ、粘り強さを強化することが示されています5。分子クローニングを含む硬化は以前に報告されています^が、6,7,8,9,10,11,12,13 本ですが、本物の研究プラスミドのライブラリーを作成するための Gibson Assembly の適応性を強調するものは認識されていません。

ここでは、カリフォルニア州立工科大学サンルイスオビスポ校で現在行われている調査ベースのCHEM/BIO 475カリキュラムの拡張について報告します。Gibson Assemblyを使用した実践的な体験と、全米科学財団(NSF-1708919およびNSF-2300890)が資金提供する研究プロジェクトにオリジナルのプラスミドコンストラクトを提供したCUREへの学生の参加という2つの主要な改善が加えられています。このカリキュラムの3回の実施を通じて、学生はActinomycetotaによって生成される生理活性分子の天然物生合成に焦点を当てた2つの異なる研究プロジェクトに貢献しました。天然物には、抗生物質、抗真菌剤、および/または抗がん作用を持つファーマコフォアが含まれていることが多く、これらの小分子は創薬活動において重要であり、臨床的関連性の可能性を示しています¹⁴。この研究では、細菌の生合成酵素の機能と工学的可能性の両方を調べるために、プラスミドライブラリーの作製が必要です。このCUREでは、学生はこれらの研究プロジェクトに関連するユニークなプラスミドライブラリをクローニングするためのGibson Assembly実験を設計および実施しました(図1)。さらに、モジュールの形式とデザインは、他の研究プロジェクトで関心のあるプラスミドを生成するために容易に適応できるという点で特徴的です。

図1:当研究室におけるGibson Assemblyの役割の概要。 放線菌は、生合成酵素をコードする遺伝子クラスターを使用して、臨床的に関連する生物活性を持つ低分子天然物を生成します。私たちの研究では、生合成遺伝子を含むプラスミドをGibson Assemblyを介してアセンブルし、コードされた酵素の機能をダウンストリームで調べます。Biorender.com の科学アイコン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

研究室概要

分子生物学研究室は、分子生物学と細胞生物学を集中して学ぶ生化学専攻と生物学専攻に必要な上位課程です。前提条件を満たす他の学生は、上位部門の選択科目としてコースを受講することを歓迎します。このコースは、Cal Polyの化学および生化学部門と生物学部門の間で共同リストされています。両学部の教員が各学期(生物学2学期、化学と生化学4学期)に交代で授業を行います。

クラスは、週に2回、170分、週に1回、50分の講義で研究室で開催されます。ラボセクションには最大16人の学生が含まれ、四半期ごとに2〜3のラボセクションが提供されます。コースは10週間で、最終試験は10週目の最後の会議で実施されます。講義時間は、研究室で実施されている多くの実験技術の背後にある理論や、研究室でカバーされていない分子生物学の現在のトピックについて議論するのに費やされます。ラボのコアカリキュラムには、酵母¹からアクチン遺伝子をクローニングするプロセスが含まれており、これには約7週間(13〜14回のラボミーティング)かかります。マイクロピペッティング、酵母RNA単離、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いた酵母遺伝子の増幅、TOPOクローニング、ブルーホワイトスクリーニング、プラスミド単離、制限酵素消化およびPCRによるインサートの検証、クローンの in silico 解析、DNA配列解析などの技術があります。コースの最後の3週間のカリキュラムはインストラクターの裁量に委ねられていますが、学生は未定義の結果を持つ「独立したプロジェクト」を完了する必要があります。

実験の概要

私たちの研究グループでは、放線菌の生合成経路に焦点を当てています。独立したプロジェクトを設計する際には、学生がGibson Assemblyを通じてプラスミドを作成し、天然物の生合成を研究する研究プロジェクトで使用することを想定していました。ここで評価するコースモジュールの反復は、生合成経路の操作を可能にするプラスミドに特有のものでしたが、Gibson Assemblyのワークフローは、他の分子クローニングプロジェクトにも非常に適応可能です(図2)。ワークフローは3つの異なる実験(A、B、C)に分割され、2つの講義期間と6つのラボ期間(合計3週間)で完了しました( 補足ファイル1 および 補足ファイル2を参照)。実験の前には、生徒の準備をサポートし、生徒の理解度を評価するためのワークシート(補足ファイル3、 補足ファイル4、 補足ファイル5)が行われました。ワークフローは、インストラクターのニーズと関心に柔軟に対応できる形式で提供されます。

図2:Gibson Assemblyモジュールのワークフロー。 1日目と4日目は講義期間で、 学生はin silico 配列解析と実験デザインを完成させます。2〜3日目と5〜8日目は研究室のミーティングで、Gibson Assemblyを介して新規プラスミドをクローニングする手順が行われ、その後、単離とスクリーニングが行われます。絵のフローチャートは、学生が実行する3つの実験(A、B、C)によってグループ化されています。より詳細な指示とプロトコルは、それぞれ 補足ファイル1 と補足 ファイル2 として提供されるインストラクターと生徒のマニュアルに記載されています。Biorender.com の科学アイコン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Gibson Assemblyの独立プロジェクトモジュールは、2019年春四半期にCHEM/BIO 475で初めて試験運用されました。2020年と2021年には、SARS-CoV-2のパンデミックにより、コースはオンラインで教えられました。2022年と2023年の春に対面式の指導が再開されたとき、コース内の学生は、研究に関連するオリジナルのプラスミドをクローニングするGibson Assembly独立プロジェクトの学習成果を評価する研究に参加するよう招待されました。2019年、学生たちは 、Micromonospora echinospora ATCC 15837のゲノムから得られた遺伝子カセットをpKC1132にクローニングしたプラスミドのライブラリを作成しました(図3)。このプラスミドライブラリーは、天然物TLN-05220¹⁵の推定生合成遺伝子クラスターで目的の遺伝子を不活性化するために、私たちの研究室で利用されています。私たちの遺伝子不活性化研究を補完するために、2022年の学生は、推定TLN-05220遺伝子クラスターからpUC19に遺伝子の小さなライブラリをクローニングしました(Figure 3)。私たちの研究グループでは、これらのプラスミドを利用して、タンパク質の過剰発現と精製のために、pET28bを含む発現ベクターに遺伝子をサブクローニングしています。2023年のコホートの学生は、エポキソマイシン合成酵素¹⁶の生合成工学プロジェクトの進行中の研究に貢献しました。3〜4人のチームで、学生は非リボソームペプチドシンテターゼ¹⁷ モジュールの遺伝子操作ドメインをさまざまなタンパク質発現ベクターにクローニングし、私たちの研究室でこれらの酵素の過剰発現と精製を最適化しました(図3)。冗長性は、各コホートのクローニング計画に組み込まれていました。例えば、2019年のコホートには44人の学生が含まれ、クローニングのために15のプラスミドがクラスに割り当てられました。したがって、各プラスミドのクローニングを2回または3回試みました。

図3:2019年、2022年、2023年の独立プロジェクト反復におけるプラスミドクローニングと学生参加者のまとめ。 Gibson Assemblyプロジェクトは3回展開されています。各オファリングでは、学生参加者は、生合成経路を探索する研究プロジェクトで利用するために、プラスミドの異なるライブラリをクローニングしました。2019年と2022年のプロジェクトは、2つのフラグメント(1つの遺伝子カセットまたは遺伝子とベクター)のギブソンアセンブリ反応を用いた天然物TLN-05220¹⁵ の進行中の研究を支援しました。2023年のプロジェクトでは、エポキソマイシン生合成に関与する非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)のモジュール1および2内のドメインスワッピングを行いました¹⁶。ハッチングされたフラグメントは、スワップされたドメインの2つの異なる変異体を表し、ソリッドカラーはスワップされなかったドメインを表します。合計で8つの異なる遺伝子フラグメント(モジュール1に4つ、モジュール2に4つ)が生成され、ギブソンアセンブリに適合するオーバーハングがありました。各モジュールについて、3つの遺伝子フラグメントの2つの異なる組み合わせを、2つの異なるベクター(pBAD33およびpET28、アセンブリあたり合計4つのフラグメント)のいずれかとアセンブルし、8つの遺伝子改変NRPSプラスミドを生成する可能性を秘めました。Biorender.com の科学アイコン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

評価の概要

Gibson Assemblyの独立プロジェクト開始の少なくとも1週間前に、2022年と2023年のコホートの学生は、Cal Poly¹⁸の生化学ラボコースの調査で実施された研究と同様に設計された学習成果調査に参加するよう招待されました。学生の参加者は、独立したプロジェクトの開始前にラボミーティングで多肢選択式の事前アンケートを完了し、最終ラボミーティング中(つまり、Gibson Assemblyモジュールを完了した後)に多肢選択式の事後アンケートを完了しました。事前アンケートと事後アンケートは、28の同一の質問で構成され、事後アンケートには2つの追加質問(合計30)が含まれていました。分子クローニングに関与する酵素とメカニズムに関する学生の知識を評価するために、10のコンテンツ問題が作成されました(例:ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、ギブソンアセンブリ、形質転換、青白スクリーニング)。次の7つの質問では、分子クローニング用語(DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼなど)への精通度を自己評価するよう学生に求めました。次の10問では、分子クローニング技術(DNA配列解析、制限消化反応、アガロースゲル電気泳動など)を行う能力を自己評価することができました。また、学生は、分子クローニング技術に関する知識に基づいて、分子生物学のキャリアを追求することに抵抗がないかどうかも報告しました。事後アンケートには、学生がコースでの学習への取り組みと、コースが貴重な学習経験であったかどうかを自己評価するための2つの追加の質問が含まれていました(補足ファイル6 および 補足ファイル7)。2022年と2023年の学生のアンケート前後の回答から得られたすべてのデータは、分析のために組み合わせられ、 補足表S1で入手できます。

プロトコル

ヒトの参加者を対象とした研究は、Cal Poly の Research Institutional Review Board (2022-113-CP (IRB)) でヒト被験者によってレビューされ、承認されました。参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームド コンセントを提供しました。

以下のプロトコルは、インストラクターの準備(ステップ1.1–1.3)、線状フラグメントを取得するためのPCRを含む3つの実験教育モジュールに対する学生の行動 (ステップ2.1–2.7)、ギブソンアセンブリ、形質転換、クローンの選択(ステップ3.1–3.5)、プラスミドの単離とスクリーニング(ステップ4.1–4.4)、および学習成果の評価(5.1–5.2). インストラクターによる調製では、プライマー設計の代表的な例と、in silicoでの目的とするプラスミドマップの調製について説明しています。プロトコルのすべてのセクションは、他の目的のプラスミドに適応可能です。各学生の実験は、2つの3時間のラボミーティングに分かれています。

1. 講師の準備

1. Benchling Assembly Wizard を使用した Gibson Assembly プライマー設計
   1. ゲノムDNA、プラスミド、合成DNAなど、遺伝子挿入物のDNAテンプレートソースを決定します。
      手記： 複雑なゲノムDNAテンプレートから増幅される遺伝子については、まず、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)²¹を使用して、目的の遺伝子に特異的なゲノムDNAテンプレート内のプライマーのユニークな結合部位を決定することが推奨される(補足 ファイル1に詳述されている)。プラスミドや合成DNAなどの単純なテンプレートの場合は、次のステップに進みます。
   2. 遺伝子インサートとベクターのDNA配列を取得します(例えば、 Supplemental File 8のGenBankファイルとして提供されているポリケチドヒドロキシラーゼ遺伝子配列とpUC19配列を参照)。目的のインサート配列と目的のベクター配列を、それぞれ新しいDNA配列ファイルとしてBenchlingにインポートします。Gibson Assembly反応に含める各インポートされたシーケンスを開きます。
      手記： GenBankやFASTAなど、いくつかの形式のDNA配列ファイルをインポートできます。また、アクセッション番号を使用してデータベースから直接配列をインポートしたり、別のファイルやビューアからコピーしたヌクレオチド配列に貼り付けたりすることもできます。
   3. 画面の下部で、 アセンブリ ウィザード ツールを見つけます。 「アセンブリ・ウィザード」をクリックし、「 新規アセンブリの作成」を選択します。表示されたオプションから「 Gibson 」を選択し、「 開始 」をクリックしてアセンブリを開始します。
   4. ベクトルシーケンスウィンドウで、アセンブリに含めるすべての塩基をベクトルバックボーンから選択します。遺伝子インサートの3'末端(例えば、pUC19の位置657)のヌクレオチド位置から選択を開始し、含めるべき全ての残りのヌクレオチドを選択する(例えば、位置656までで、pUC19配列全体を含む)。選択したら、画面下部の [Backbone] タブをクリックして [Set Fragment] をクリックします。
      手記： ベクターの Sequence Map ビューと Plasmid ビューを切り替えて、環状テンプレートの必要な塩基をすべて選択します。あるいは、Gibson Assemblyのために(PCRではなく)制限酵素消化物を介してベクターフラグメントを調製する予定の場合は、制限酵素切断部位(XbaIなど)でバックボーン配列を直鎖化します。これを行うには、 切り取りサイトをクリックし、 Shift キーを押しながら 切り取りサイト を再度クリックします。次に、「 フラグメントを設定 」をクリックしてバックボーンを設定します。 Assembly Wizardでバックボーンが制限酵素で直鎖化されている場合、ベクター特異的プライマーはBenchlingによって生成されないことに注意してください。
   5. 挿入シーケンスウィンドウで、アセンブリに含めるすべての挿入のベースを選択します。選択したら、画面下部の[挿入]タブをクリックします|フラグメントを設定します。
   6. 複数の遺伝子を挿入する場合は、Assembly Wizardの右側にある+ボタンをクリックします。挿入シーケンスウィンドウで、アセンブリに含めるすべての挿入ベースを選択します。選択したら、画面下部の[挿入]タブをクリックします|フラグメントを設定します。
   7. すべてのフラグメントを設定したら、アセンブリの名前を目的のプラスミド名に変更し、Assembly Wizardの右側にあるAssembleをクリックします。Sequence Folder と Primer Folder の両方に目的のフォルダーの場所を選択します。Createをクリックして、組換えプラスミド配列をアセンブルします。
   8. アセンブルされたプラスミドを開き、[ Assembly History ]をクリックして、基本的なプラスミドマップと、その派生元となった配列の概要を表示します。各フラグメントのヌクレオチド位置が目的のデザインと一致していることを確認してください。
   9. Assembly Parametersタブで、アセンブリ用に設計されたプライマーの名前を表示します。各インサート(フォワードとリバース)に対して2つのプライマーが設計され、プライマー名はDNA配列ファイルのタイトルから導出されることに注意してください。また、プライマーの融解温度と推奨アニーリング温度がこのウィンドウで互換性があることも確認してください(補足ファイル8、代表的なプライマーを参照)。
      1. プライマーの融解温度またはアニーリング温度が理想的でない場合は、プライマー配列ファイル内でプライマー配列を手動で調整します(例:ヌクレオチドを除去して融解温度を下げる)。または、Re-openをクリックし、Assembly WizardのAssembleボタンの隣にあるEnzyme/Primer Settingsボタンをクリックして、プライマー設定を調整します。次に、アセンブリステップを繰り返し、プライマー配列を再検討します。
      2. プラスミドのライブラリーを、同じベクターバックボーンにクローニングされた多数の異なる遺伝子でクローニングする場合、
      3. いずれの場合も、ベクターに同じプライマーペアを使用します。これを行うには、インサートに特異的なオーバーハングを取り付けるベクタープライマーからすべてのヌクレオチドを手動で除去します。これらのヌクレオチドは、プライマーの5' 末端に見られます。除去後、プライマーの融解温度とアニーリング温度が適合していることを確認してください( 補足ファイル8、代表的なプライマーを参照)。
      4. すべてのインサートプライマーペアの融解温度とアニーリング温度が非常に類似していることを確認してください。
         手記： これにより、すべてのペアのアニーリング温度最適化の必要性が減り、同じサーモサイクラープログラムを使用してすべての学生PCR反応を同時にサイクルできるようになります。
   10. 目的のプラスミドのプライマー設計が完了したら、Assembly WizardでFinalizeをクリックします。DNA合成会社にプライマーを注文し、インサートとベクター用のDNAテンプレートのサンプルを取り出します。
   11. DNAテンプレートを用いたグラジエントPCR実験を用いて、インサート特異的プライマーとベクター特異的プライマーの両方のペアを最適なアニーリング温度で試験します。Benchlingが推奨するアニーリング温度を最初に3 °C±テストします。
   12. アニーリング温度が決定したら、プライマー溶液、DNAテンプレート、および学生用のPCR反応に必要な試薬のアリコートを作成します。
2. 実験の前に、準備をサポートし、理解度を評価するためのワークシートを生徒に提出します(補足ファイル4、補足5、 補足6)。
3. 学習成果に関するデータ収集
   手記： Gibson Assemblyモジュールから学習成果データを収集し、その結果を公開することに関心がある場合は、機関のポリシーに従って、人間を対象とする研究の承認を得てください。
   1. ギブソンアセンブリの独立プロジェクトの開始の少なくとも1週間前に、学習成果の調査に参加するように学生を招待します。
   2. 学生参加者に、自主プロジェクト開始前に研究室会議で多肢選択式事前アンケート(補足ファイル6)に回答してもらいます。

2. 学生実験A:線状フラグメントを得るためのPCR

1. PCR用のプライマーとテンプレートDNA溶液をインストラクターから入手してください。
2. 学生用マニュアル( 補足ファイル2を参照)の指示に従って、DNAポリメラーゼMasterMix、DNAテンプレート、フォワードおよびリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリー水を含む25 μL反応をピペットで使用します。
3. サーモサイクラーで反応をサイクル化し、 補足ファイル2の学生マニュアルに従って行います。反応のアニーリング温度がプライマーに適切であること、および伸長時間が目的のアンプリコンの長さに対して適切であることを確認してください。詳細な手順については、 補足ファイル2 および 補足ファイル3 を参照してください。
4. PCR反応液は、次のラボ期間まで4 °Cまたは-20 °Cで保存してください。
5. 各反応の5 μLをアガロースゲル電気泳動で分析します。ゲルが泳動している間に、プラスミドDNAをテンプレートとして利用した各反応に1 μLのDpnI制限酵素を加えます。この混合物を37 °Cで1時間インキュベートします。
   手記： DpnIは、残っている環状プラスミドDNAテンプレートを分解するため、形質転換ステップで偽陽性を得る可能性が低くなります。
6. ゲルを画像化して、PCRが成功し、正しい増幅が達成されたことを確認します。成功したPCR反応は、市販のPCR精製キットで精製します。その後のギブソンアセンブリ計算で使用するために、微量分光光度計を使用して精製PCR産物の濃度(ng/μL)を測定します。
7. 次回のクラスミーティングの前に、Gibson Assemblyの反応レシピを設計してください( 補足ファイル2 および 補足ファイル4を参照)。

3.学生実験B:ギブソン クローンの組み立て、形質転換、選択

1. 設計されたレシピに従ってギブソンアセンブリの反応をピペットで掴みます。反応液を50 °Cで15分間インキュベートします。反応がインキュベートしている間に、化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞を氷上で解凍することにより、形質転換の準備をします。
2. 2 μLのGibsonアセンブリをヒートショックにより化学的にコンピテントな細胞に形質転換します。形質転換細胞100μLを2つの選択プレートにピペットで移動させ、滅菌したビーズで広げます。残りの細胞の^10-4、^10-5、および^10-6希釈液をLuria-Bertani(LB)寒天上に調製します。各段階希釈液100μLをLBでプレートし(選択なし)、滅菌したビーズで広げます。
   手記： このステップにより、変換効率を計算できます。
3. プレートを37 °Cで一晩インキュベートし、次のクラス期間までプレートを4 °Cで保存します。
4. すべてのプレート上のコロニーをカウントし、 補足ファイル2の指示に従って形質転換効率を計算します。いずれかの選択プレートから4つのコロニーを含む1つの選択プレートに再ストリークし、このプレートを37 °Cで一晩インキュベートします。
   手記： これは、ポジティブクローンのバックアップカルチャーとして機能します。
5. マーカーを使用して、選択プレート上の4つの異なるコロニーを選択し、丸で囲み、学生のイニシャルと番号(ABC1など)でラベルを付けます。抗生物質を含む新しいLB寒天プレートを取り出して選択し、マーカーを使用してプレートを象限(つまり、4分の1)に分割し、次に各コロニーの~1/2を使用して、それぞれ標識された象限に再ストリークし、残りの1/2を使用して、選択した4つのコロニーのそれぞれに5mLの液体LB培養物を接種します。チューブにはそれぞれのコロニー同一性(ABC1など)をラベル付けし、選択のために正しい濃度の抗生物質を追加してください。液体培養物を振とうインキュベーターで37 °Cで一晩インキュベートし、寒天プレートを37 °Cの静的インキュベーターでインキュベートします。液体培養物とプレートは、次のクラス期間まで4 °Cで保存してください。

4. 学生実験C:プラスミドの単離とスクリーニング

1. ミニプレップキットを使用して、実験Bの液体培養物からプラスミドDNAを単離します。単離されたプラスミドの濃度を測定します(単位:ng/μL)。
2. 単離されたプラスミドを解析するための制限消化物または PCR スクリーニングを設計します( 補足ファイル 2 の詳細な手順と 補足ファイル 5 の期待値を報告します)。
3. 制限酵素消化反応または設計されたレシピに従って反応をピペットでピペットで移動し、以前に設計された温度と持続時間でインキュベートします。
4. アガロースゲル電気泳動による結果の解析。

5. 評価

1. Gibson Assemblyモジュールが完了した後、学生の参加者に多肢選択式の事後アンケート(補足ファイル7)をラボミーティングに記入させます。
2. アンケート前後の回答から得られたすべてのデータを組み合わせて分析します。
   1. アンケート間の各個々のコンテンツ質問の平均スコアの増加の統計的有意性を、両側対応のt検定とCohenのd効果サイズを使用して調べます。
   2. 個々の学期と手法ごとに生徒の自信の増加を評価して、変化の程度とその統計的有意性を判断します。
   3. 正規化学習ゲイン (NLG) と対応のない t 検定を使用して、学生のバックグラウンドと学問的要因が学生の学習に与える影響を判断します。
   4. 平均スコアを評価することにより、プロジェクトの経験と分子生物学のキャリアに対する学生の態度 を評価します。

結果

クローン作成における学生の成功
Gibson Assemblyモジュールの各反復(2019年、2022年、2023年)で、学生は調査結果をまとめたレポートを作成するよう求められました。2019年には、44人中36人(81.8%)が、実験Cで設計したスクリーニングの結果に基づいてプラスミドのクローニングに成功したと報告しています。2022年には、20人の学生のうち合計14人(70.0%)が割り当てられたコンストラクトのクローニングに成功したと報告し、2023年のチームベースのプロジェクトでは、27人の学生のうち12人(44.4%、8グループ中4グループ)がスクリーニング分析に基づいて成功したと報告しました。学生レポート内の結論は、インストラクターまたは学生研究者によってレビューされました。スクリーニング結果が彼らの主張を裏付けていないことが判明した場合、学生の解釈は修正されました。各プラスミドの1つのサンプルをサンガーシーケンシングで解析し、2019年に目的のプラスミド15種すべて、2022年に12種のプラスミドすべてのプラスミドインサートの配列を確認しました。2023年には、全プラスミドOxfordナノポアシーケンシングを使用して、8つのプラスミドすべてを分析しました。しかし、8種類のプラスミドのうち、目的の配列に一致したのは1種類だけでした。

分子生物学の概念のコンテンツベースの評価
アンケートの内容セクションは、分子生物学と分子クローニングの概念に対する学生の理解をテストする10の多肢選択問題で構成されていました。10の質問すべての質問について、アンケート前後の平均コンテンツスコアを比較すると、63.7%から80.4%に有意に増加したことが明らかになりました(p < 0.05、両側対応 のあるt検定; 図4)、Gibson Assemblyの独立したプロジェクトが、分子生物学とクローニングの概念に対する学生の理解を深めたことを示唆しています。A:コーエンの d 検定では、この有意な増加は大きな効果サイズ(d = 0.891)に対応し、内容問題に対する学生の事前回答と事後回答の間に強い差があることを裏付けました。

図4:独立プロジェクト後の分子生物学と分子クローニングに関する学生の理解の向上。 独立プロジェクトの完了前後に分子生物学と分子クローニングの内容をテストする質問に対する学生の回答の箱ひげ図(サンプルサイズ、 n、46;Gibson Assembly Pre- and Post-Questionnaires in Supplemental File 6 and Supplemental File 7, respectively)。平均事前スコアと事後スコアは、両側対応の t検定を介して分析され、これは学生の正解の有意な増加を示しています(p < 0.5)。ボックスはスコアの中央の50%(つまり、25^パー センタイルから75^パー センタイル)を表し、ひげは最小スコアと最大スコア(%)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

次に、各個々のコンテンツ質問の平均スコアの増加が、アンケート前とアンケート後の間で統計的に有意であるかどうかを調べました。両側対応 t検定を用いた解析では、PCR反応、DpnI制限消化物、Gibson Assembly酵素、およびGibson Assemblyインサートおよびベクター配列に関する質問に対する学生の回答は、独立したプロジェクトの完了後に有意に増加したことが示されました(p < 0.05)。これらの内容ベースの質問は、全体の内容平均である63.7%と比較して、アンケート前のスコアが比較的低く、DpnI消化物とGibson Assembly酵素に関する質問のスコアが最も低かった(それぞれ34.8%と47.8%)。前述の質問のプロジェクト後平均は、それぞれ71.7%と89.1%に増加し、全体のコンテンツ平均である80.4%に近づいています。これらのデータは、プロジェクトの終了までに、DpnI消化物とGibson Assembly酵素の両方に対する学生の理解が、アンケートの全体的な内容セクション(d = 0.982)よりも大きな効果サイズで改善したことを示しています。

分子生物学の用語と実験技術の態度評価
態度に関する質問は、学生アンケートで2つのセクションに分かれていました。最初のセクションでは、7つの分子生物学用語に関する知識を1〜4のスケールで自己評価しました(1 =「この用語が何を意味するのかまったくわからない」から4 =「この用語が何を意味するのかを知っていて、他の人に簡単に説明できる」)。平均期間信頼度は3.52から3.87に有意に増加し、効果量は大きかった(p = 5.32 × ^10-15およびd = 1.40;図5A)。2番目の態度セクションでは、生徒に「私は快適に演奏しています...」という声明に同意するかどうかを尋ねました。1〜5のスケールで11のさまざまな分子生物学ラボ技術(1 =「強く同意しない」から5=「強く同意する」)。これらの11のテクニックに対する学生の平均信頼度は、効果サイズが大きい(p = 2.08 × ^10-11、d = 1.09;図5B)。

図5:独立したプロジェクトの後、分子生物学とクローニングの用語と技術についての理解に対する学生の自信が高まった。 分子生物学に対する学生の自信の箱ひげ図(A)用語と(B)事前および事後アンケートの手法( それぞれ補足ファイル6 および 補足ファイル7のギブソンアセンブリ事前および事後アンケート)。学期の自信(パネル A)では、学生は4段階の尺度で自信を選択しました(1-「この用語の意味がわからない」から4-「この用語の意味を知っていて、他の人に簡単に説明できる」;サンプルサイズ n は45)。ラボ技術の信頼性(パネル B)は、5つの部分からなるスケール(1-強く同意しない、5-強く同意する;サンプルサイズ n /42)で評価されました。平均の事前スコアと事後スコアは、両側の対応 のあるt検定を介して分析され、学期データセットと手法データセットの両方で学生の信頼度が大幅に増加したことを示しています(p < 0.5)。このボックスには、回答の中央の50%(つまり、25^パー センタイルから75^パー センタイル)が表示され、ひげは主観的な信頼度の最小ランキングと最大信頼度ランキングを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

個々の学期と技術ごとに学生の自信の増加を評価し、DNAポリメラーゼと形質転換を除くすべての学期が統計的に有意な増加を示したと判断しました（p < 0.05、両側対応 t検定; 表 1)。1人を除くすべての学生は、事前アンケートと事後アンケートの両方でDNAポリメラーゼという用語について「この用語の意味を知っており、他の誰かに簡単に説明できる」とマークしたため、その用語に改善の余地はありませんでした(表1)。トランスフォーメーションの用語では、学生の73.91%が事前調査で最も高い信頼水準(スケールの4番目)を選択しましたが、事後調査では80.4%でした。評価された11のラボ技術のうち9つは、学生の自信の大幅な増加を示しました。これには、モル濃度の計算とゲル電気泳動は含まれていません(表1)。平均して、学生はこれらの手法の両方で高いアンケート前スコアを報告しました(それぞれ4.71と4.57、技術平均は3.81)ことから、Gibson Assemblyプロジェクトの前から学生がこれらの用語に自信を持っていたことを示しています。一般的な生物学の問題(DNAポリメラーゼ、ゲル電気泳動、モル濃度計算など)に対する学生の自信を評価した質問は、一般的に統計的に有意な変化を示さなかった(表1)。しかし、ギブソンアセンブリの専門化された問題はすべて、効果サイズが最大(d > 1.6)で有意な増加を示し、「ギブソンアセンブリ」という手法は学生の自信に最も大きな変化を示しました(表1 および 図6)。

コンテンツの種類	用語/テクニック	Avg Questionnare レスポンス		統計的有意性		エフェクトサイズ(d)
		前	投稿	p 値	はい/いいえ
一般生化学	DNAポリメラーゼ用語	3.98	3.98	未定義	いいえ	0
	モル濃度計算技術	4.71	4.77	4.45E-01	いいえ	0.130
	ゲル電気泳動技術	4.57	4.68	1.68E-01	いいえ	0.254
分子クローニング	プライマー技術の設計	3.05	3.57	7.23E-04	はい	0.536
	インシリコクローニング技術	3.61	4.07	5.75E-04	はい	0.533
	青白上映期間	3.59	4.34	4.10E-06	はい	0.655
	PCRスクリーニング期間	3.78	4.31	1.02E-06	はい	0.936
	ギブソンアセンブリー用語	2.87	3.78	7.41E-13	はい	1.69
	ギブソン組立技術	2.59	4.20	1.14E-15	はい	1.61

表1:分子クローニングに焦点を当てた態度の問題に関して有意に増加したが、一般的な生化学には焦点を当てなかった。 選択した用語と技術の質問に対する事前アンケートと事後アンケート(それぞれ補足 ファイル6 と 補足ファイル7のギブソンアセンブリ事前アンケートと事後アンケート)の平均。両側対応 のあるt検定を使用して、有意性を評価しました( p < 0.05の場合、はい、 p ≥ 0.05の場合、いいえ)。DNAポリメラーゼという用語については、学生の回答はアンケート前とアンケート後で同一であったため、 p は未定義です。各事前問題と事後問題に対する学生の回答を比較する効果量は、Cohenの d 値を使用して決定されました(d ≥0.8は大きな効果と見なされます)。効果サイズが大きいほど、サンプルセット内で前後の反応が異なる可能性が高くなります。サンプルサイズ n は、用語と技術の質問でそれぞれ45と42です。略語:AVG =平均。

図6:ギブソンアセンブリに関する態度に関する質問の増加。 ギブソンアセンブリに対する学生の回答数、(A)学期、および(B)アンケートの前後のテクニックに対する自信。用語の信頼性の回答は、4つの部分に分かれていました(1-「この用語の意味がわからない」から4-「この用語の意味を知っていて、他の人に簡単に説明できる」)。ラボ テクニックの信頼度の回答は、1 - 非常にそう思わない - 5 - 非常にそう思う までの範囲でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

次に、生徒の背景要因が、生徒が独立したプロジェクトからどれだけ学んだかに影響を与えるかどうかを評価しました。達成度認識¹⁹ とパフォーマンス²⁰ の両方のギャップは、性別のために学部のSTEMコースで持続することが示されています。したがって、正規化学習ゲイン(NLG)と対応のない t検定を使用して、これらの独立したプロジェクトで同様の性別ギャップが観察されたかどうかを判断しました。これらの統計的検定に基づいて、生徒の性別が生徒の学習成果に影響を与えることはわからなかった。また、専攻、GPA、以前のコースワークの成績、BIO/CHEM 475の最終成績などの学術的要因が、独立したプロジェクトの学生の学習成果と有意な関連があるかどうかも確認しました。生化学を専攻した学生(補足表S1 および 補足表S2)は、GPAと最終コースの成績が高く、それぞれが平均NLGを高く示したが、対応のない t検定では、これらの個々の背景因子と学習成果との間に統計的有意性は示されなかった。対応のない t検定は、2022年と2023年のコホート間のNLGの違いを評価するためにも使用されました。2023年のコホートは、内容の質問について、2022年のコホートよりも有意に高い学習ゲインを持つことがわかりました(補足表S3)。これは、2023年のコホートのクローニング成功率が低かったにもかかわらず、2022年のコホートよりも分子生物学と分子クローニングの概念についてより深く理解したことを示しています。この違いの理由は不明ですが、これらのデータは、このモジュールを使用した効果的な教育にクローニングの成功が必要ではないことを示しています。

学生の実験技術の習熟度を評価するだけでなく、プロジェクトの経験や分子生物学のキャリアに対する学生の態度も評価しました。プロジェクトの前後の評価で取り上げられた1つの質問は、分子生物学の技術を含むキャリアを追求することに対する彼らの快適さのレベルを測定するものでした。その結果、このプロジェクトにより、分子生物学のキャリアにおける学生の快適性が大幅に向上し(p = 8.46 × ^10-5)、平均スコアは1〜5スケールで3.60から4.09に増加したことが明らかになりました。さらに、プロジェクト後のアンケートには、学習体験を最大化するための学生の献身的な取り組みと、プロジェクトの価値の評価に関する問い合わせが含まれていました。回答者は、自分たちのコミットメントを平均4.48と評価し、プロジェクトは非常に価値のある学習機会であると考えており、平均評価スコアは4.73でした。まとめると、これらの調査結果は、学生の学問的成長における独立したプロジェクトの価値と、分子生物学への取り組みに対する熱意と自信を強調しています。

補足表 S1: 匿名化された生データ。 2022年と2023年のGibson Assembly CUREモジュールの反復中に収集された事前および事後アンケートからのすべての学生の回答と専攻。 補足ファイル6 と 補足ファイル7 を参照して、それぞれ対応する事前質問と事後質問を確認してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:アンケートの各セクションの専攻別の正規化学習ゲインの違い。 対応のない t検定では、どの質問タイプもメジャーによる正規化学習ゲイン(NLG)に有意差を示さなかった(p < 0.05)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S3:アンケートの各セクションのコホートごとの正規化学習ゲインの差。 対応のない t検定では、2023年のコホートでは、2022年のコホートと比較して、内容の質問に対する正規化学習ゲイン(NLG)が有意に高いことが示されました(p < 0.05)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:Gibson Assembly CUREモジュールのインストラクターマニュアル。 インストラクターがGibson Assembly CUREモジュールを実装するためのガイド。インストラクターが関心のあるテンプレートに基づいてGibson Assembly Primersを設計およびスクリーニングすることにより、コースの準備をするための段階的な手順が提供されています。実験A〜Cの各講義と実験期間中にインストラクターが取り上げるべきトピックと活動が概説されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:Gibson Assembly CUREモジュールの学生マニュアル。 ギブソンアセンブリに関連する背景情報と各実験(A-C)の段階的なプロトコルを含む、学生に提供するマニュアル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:実験A計画ワークシート(個人およびチーム)。 学生がGibson AssemblyフラグメントのPCR増幅を理解し、準備するための個人およびチームのワークシート。これらのワークシートのうち1つだけを、独立したプロジェクトの構造(個人またはチームベース)に基づいてインストラクターが割り当てる必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:実験B計画ワークシート。 Gibson Assembly反応のセットアップに必要な計算を支援するための学生用ワークシート。ワークシート内のフラグメントの数は、目的のプラスミドのクローニングデザインに基づいて調整できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル5:実験C計画ワークシート。 目的のプラスミドをスクリーニングするための制限消化物または PCR 実験の設計を支援する学生用ワークシート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル6:ギブソンアセンブリ事前アンケート。 Gibson Assembly CURE Moduleの開始前に学生に与えられた28問の質問票。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル7:ギブソンアセンブリポストアンケート。 Gibson Assembly CURE Moduleを修了した後に学生に与えられた30問の質問票。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル8:ポリケチドヒドロキシラーゼ遺伝子、pUC19ベクター、およびGibsonアセンブルプラスミドのGenBank(.gb)配列ファイル、および代表的なプライマーの表を含むZipフォルダー。 これらのファイルを参照して、Benchling Assembly Wizardでの例示的なプライマー設計と実験計画ワークシートの完成にお役立てください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、コースベースの研究環境でGibson Assemblyを通じて学生に分子クローニングを教える調整可能な学部教室の実験室プロジェクトを提案します。合計で28種類の新規プラスミドが、学部生によって教室でクローニングされました。個々の学生が報告した成功率は、3つのコホートで44.4%から81.8%の範囲であり、全体のクローニング成功率は80%でした(割り当てられたプラスミドの合計35個のうち28個が成功裏にクローニングされました)。2023年にクローニングの成功率が低下したのは、2つの複合要因によるものと考えられます。まず、テンプレートDNAサンプルのチューブに非常に密接に関連する名前で標識しました。学生研究者が調製したDNAテンプレートに取り違えがあり、教育研究室の学生が行ったギブソンアセンブリ反応中に不適合な線状断片の組み合わせにつながった可能性があります。このプロジェクトの将来の反復では、学生に提供する前に、テンプレートDNAを最初に配列決定するか、制限消化物でスクリーニングして正しいアイデンティティを確認する必要があります。次に、このプロジェクトの2023年のイテレーションは、前年の2つのフラグメントアセンブリ(1つのベクターと1つのインサート)とは対照的に、4つのフラグメントアセンブリ(1つのベクターと3つのインサート)で構成されていました。これは、Gibson Assemblyのフラグメントが多いと反応効率が低下する可能性があるため、このプロジェクトのクローニング成功率も低下させた可能性がある²²。このプロジェクトの将来の反復では、より多くのグループで同じプラスミドをクローニングしたり、グループで複数のGibson Assembly反応をさまざまな挿入対ベクター比で設定したりすることで、より多くの冗長性を組み込むことができます。さらに、フラグメント間のオーバーラップを長くし、ギブソンアセンブリ反応のインキュベーション時間を増加させることで、4〜6個のフラグメント²³を持つアセンブリの成功率が向上する可能性がある。

新規プラスミドのクローニングに加えて、プロジェクトの前後の調査結果では、学生が分子生物学と分子クローニングの概念についての理解を深めたことが示されており、Gibson Assemblyクローニングに関連する質問では最も大きな効果がありました。さらに、分子生物学の用語と実験技術に対する学生の自己申告の自信は、評価された学生の大多数について、プロジェクトを完了した後で大幅に改善されました。Gibson Assemblyは、学術研究や^{バイオテクノロジー業界で使用される}重要で汎用性の高い分子クローニング技術です2。これらの概念と実践的なスキルを実験室のコースで教えることで、すべての学部生は、就職や継続的な教育を受ける際に、研究能力と採用可能なスキルを身に付けて卒業する機会を平等に得ることができます。

説明されているギブソンアセンブリのカリキュラムには、CURE⁴を成功させるための5つの要素が含まれています。学生は、PCRアンプリコンのサイズと制限消化カットに基づく目標と期待を含む独自のプロトコルを設計することにより、科学的な実践を使用しました(補足ファイル3、 補足ファイル4、および 補足ファイル5)。この独立したプロジェクトでは、必要な各フラグメントの調製をグループ内のメンバー間で分担し、最終的に各グループのメンバーからのフラグメントを1つのライゲーション反応に活用することで、学生のコラボレーションを促進します( 補足ファイル3の実験A計画ワークシート(チームベース))。これらの独立したプロジェクトがクローニングを目指したプラスミドは、教室以外の研究プロジェクトに関連する新規発現プラスミドであり、出版可能な研究のためのデータを提供する可能性があります。従来の研究経験と同様に、CUREコースでのクローニング成功率は100%ではありませんでした。学生には、否定的な結果をもたらした可能性のある変数を評価し、プラスミドが成功裏にクローニングされなかった理由を説明する仮説を提案するよう求められました。これは、研究結果に関する学生にとって真の学習体験となります。

このGibson Assembly CUREの反復では、学生は放線菌の天然物研究に関連するプラスミドをクローニングしました。ただし、ワークフローは、他のプロジェクトにも高度に適応できるように設計されています。ここで紹介するプロトコルは一般化されており、学生は6回の研究室会議と2回の講義で、さまざまな研究目的に使用できるプラスミドをクローニングすることができます。このフレームワークにより、学生は新規プラスミドを個別にクローニングしたり、チームベースのアプローチで>2の直鎖状フラグメントから単一のプラスミドをクローニングするために協力することができます。全体として、このアプローチは、Gibson Assemblyのさまざまな利用を必要とする可能性のある幅広い研究プロジェクトに合わせて調整できます。

この研究では、GIBSON Assemblyを教えるためのCUREベースのアプローチを通じて学生の学習成果を評価しましたが、研究の拡大を通じて追加の洞察を得ることができました。事前アンケートとアンケート事後形式では、独立したプロジェクトにより学習成果の評価が可能でしたが、ギブソンアセンブリの講義ベースの教育との比較は行われませんでした。実験ベースのCUREを講義ベースまたは従来の実験室活動と比較すると、実験結果がすでに学生向けに設計されているため、Gibson Assemblyの学習成果が改善されたのがCUREコースモデルに固有のものである場合、より多くの洞察が得られます。最後に、Gibson Assemblyに関連する一部のコンテンツ質問では理解が大幅に向上しましたが、他の質問ではそうではありませんでした。Gibson Assemblyで使用される相同オーバーラップ、それらがどのように設置され、Gibson Assemblyクローニング反応でどのように再結合するかに関する問題は改善されませんでした。このことは、これらのトピックに関するさらなる説明や追加の学習評価が、このカリキュラムの将来の実施における学生の理解を向上させる可能性があることを示唆しています。

Gibson Assemblyの独立したプロジェクト構造は、Cal Polyで引き続き実施されています。コースの将来の反復では、このプロジェクトは、より高い学生の自立性、仮説の生成、および実験計画を可能にするように変更されます。Cal Polyでは、近日中に予定されているカリキュラムの変更により、学生主導のプライマーデザイン、ベクターバックボーンの選択、配列解析、および/またはタンパク質発現などのプラスミドの下流試験を含む独立したプロジェクトを延長する機会を提供します。さらに、独立したプロジェクトは、進行中の研究プロジェクトのニーズに応じて、部位特異的突然変異誘発や遺伝子編集などの他の関連する分子生物学技術を教えるためにカスタマイズすることができます。独立したプロジェクトで学生が利用する手法を変更することで、CURE形式に適したトピックと実装が難しいトピックについて、より識別力を高めることができます。

まとめると、このレポートでは、創発的クローニング方法論に対する学生の理解を深め、科学的プロセスの能力を向上させるためのCUREを実装する、適応性のあるGibson Assembly教育モジュールについて詳しく説明しています。この独立したプロジェクトは、評価された分子生物学の用語と技術の大部分において、学生の学習成果と自信を向上させました。私たちは、新しい研究プラスミドを作成するだけでなく、研究技術に対する学生のアクセシビリティと自信を向上させ、学部生がSTEMでの将来のキャリアに備えるために、このモジュールの使用と適応を奨励します。理想的には、この研究が分子生物学のカリキュラムの改善を刺激し、科学研究方法論が進化し続けるにつれてSTEMコースの適応性を促進することです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs, 10  mM)	フィッシャーサイエンティフィ	FERR0191	自家製のマスターミックス成分
ジチオスレイトール(DTT)	フィッシャーサイエンティ	FERR0861	自家製のマスターミックス成分
DpnI	ニューイングランドバイオラボ	R0176S	1000ユニット
フィッシャーブランドIsotemp微生物学的インキュベーター	フィッシャーサイエンティフィック	15-103-0513
ッシャーブランドイソテン	ュウォーターバスフィッシャーサイエンティフィック	S28124
レッド核酸ゲルステイン	ビオチウム	NC9594719	10,000XGeneJET
ゲル抽出およびDNAクリーンアップマイクロキット	サーモサイエンティフィック	FERK0831	100 Preps
GeneRuler 1 kb DNA ラダー	フィッシャーサイエンティフィック	FERSM0314	100 アプリケーション
LB ブロス、ミラー	フィッシャー バイオ試薬	BP9723-500	500 g
塩化マグネシウム六水和物	フィッシャーサイエンティフィック	BP214-500	自家製 MasterMix コンポーネント
マスターサイクラー ネクサス X2 グラジエント サーモサイクラー	エッペンドルフ	6337000027
マイクロフュージ 16 遠心分離機	ベックマン・コールター	A46474
マイクロモノスポラ エキノスポラ バクテリア	アメリカンタイプカルチャーコレクション	ATCC 15837
	電子レンジ ゼネラル・エレクトリック
分子生物学グレード アガロー	フィッシャー バイオ試薬	BP160-100	100 g
ナノドロップ 1 マイクロボリューム分光光度計	Thermo Scientific	13-400-518
NEB 5-α コンピテント大腸菌	ニューイングランド バイオラボ	C2987H	20 x 0.05 mL
NEBuilder HiFi DNA アセンブリ マスターミックス	ニューイングランド バイオラボ	E2621S	10 反応
ニューブランズウィックInnova 40ベンチトップオービタルシェーカー	ニューブランズウィック	M1299-0090
ヌクレアーゼフリーウォーター	フィッシャーバイオ試薬	BP248450	50mL
PEG-8000	フィッシャーサイエンティフィック	BP233-100	Homemade' MasterMixコンポーネント
Phusion DNAポリメラーゼ	New England Biolabs	M0530	Homemade' MasterMixコンポーネント
ポータブルバランス	Ohaus	SKX123
pUC19 vector	New England Biolabs	N3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S	100 反応
T5 エキソヌクレアーゼ	エピセンター	T5E4111K	Homemade' MasterMix component
Taq DNA Ligase	New England Biolabs	M0208	Homemade' MasterMix component
Tris-HCl	Fisher Scientific	AAA1137918	Homemade' MasterMix component
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoScientific	FERR1161	5 x 1 mL
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4019	100 Preps
&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD+)	New England Biolabs	B9007S	Homemade' MasterMix component