このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

1.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/67077

⸱

2024年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR 61 Biopolis Drive, 2Department of Radiation Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, 3Key Laboratory of Head and Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 4Department of Thyroid Surgery of Zhejiang Cancer Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ADCCバイオアッセイキットを使用した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)アッセイのプロトコールを紹介します。この方法は、がん免疫療法におけるADCCメカニズムの解明と抗体の治療可能性を評価するための貴重なツールを提供します。

要約

抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)の方法は、がん免疫療法における治療用抗体の有効性を評価するための重要なツールです。がん細胞におけるADCC活性の評価は、抗体ベースの治療法の開発と最適化に不可欠です。本研究では、甲状腺がん細胞をエフェクター細胞としてADCC反応を定量的に評価するために、ADCCバイオアッセイキットを活用する方法論的アプローチを提案する。このプロトコルでは、治療用抗体の存在下で、エフェクター細胞と標的がん細胞を異なる比率で共培養します。この実験で使用したADCCバイオアッセイキットには、活性化T細胞の核因子(NFAT)応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変エフェクター細胞が含まれています。標的細胞上の表面抗原が抗体やエフェクター細胞と結合すると、エフェクター細胞はルシフェラーゼを放出し、発光シグナルの測定による細胞毒性の定量化が可能になります。従来のADCCアッセイとは対照的に、この方法は標的抗原と抗体およびエフェクター細胞との結合を証明し、短期間で信頼性の高い結果を得ることができます。

概要

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)は、抗体が免疫介在性細胞死害効果を発揮する重要なメカニズムです1,2,3。免疫細胞は、治療用抗体に結合することによって活性化され、抗体は標的細胞の表面抗原と相互作用してグランザイム、パーフォリンを放出し、標的細胞死につながります。これらの免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞と好中球2,3,4,5,6,7が含まれます。ADCCアッセイは、治療用抗体8,9の有効性を評価するための重要なツールとなっています。

従来のADCCアッセイでは、末梢血単核細胞(PBMC)またはナチュラルキラー細胞をエフェクター細胞として使用し、標的の細胞死率を定量することで治療用抗体の有効性をモニタリングしていました。本法では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変エフェクター細胞を、Nuclear Factor of Activated T-cell(NFAT)応答エレメントの制御下で配合したADCCバイオアッセイキットを用いています。次に、標的細胞上の表面抗原と抗体およびエフェクター細胞との結合を定量化します。この方法は、ヒトPBMC細胞を必要とせずに短時間で起こるADCC反応に基づいています。実験ステップには、治療用抗体の存在下でのエフェクター細胞と標的細胞の共培養が含まれます。

インキュベーション中、治療用抗体は標的細胞の表面上の標的抗原に結合し、エフェクター細胞と抗体のFcフラグメントが結合します。これにより、NFAT応答素子が活性化され、ADCC反応の定量的評価のための発光シグナルが放出されます。

実験を行う前に、標的細胞における標的抗原の発現をフローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングのいずれかで確認する必要があります。標的細胞を培養し、実験前に24時間96ウェルプレートに継代します。異なる濃度の治療用抗体を、エフェクター細胞の異なる細胞数とともに添加し、計算されたエフェクター対標的細胞比を達成します。

この方法の主なステップには、(1)標的細胞とエフェクター細胞の調製、(2)エフェクターと標的細胞の比率、(3)異なる濃度の抗体の調製、(4)インキュベーション期間の変動などがあります。インキュベーション後、発光シグナルはルミノメーターを使用して測定され、ADCC活性の定量的な読み出しが得られます。ADCCを測定する他の方法と比較して、この方法は操作が比較的簡単で、結果は正確です。

ADCCレポーターバイオアッセイは、標的抗原、治療用抗体、および免疫細胞がADCC経路の活性化に結合することを示しています。この結合は、安定して発現するFcγRIIIa受容体であるV158(高親和性)バリアントを持つエフェクター細胞操作Jurkat細胞のNFAT経路を介して遺伝子転写を活性化します。NFAT応答要素は、エフェクター細胞10,11におけるルシフェラーゼの発現を媒介する。ADCCの作用機序(MOA)における抗体の生物学的活性は、NFAT経路から生成されるルシフェラーゼシグナルを通じて定量されます。エフェクター細胞(FcγRIIIa受容体発現ジャーケット細胞)のルシフェラーゼシグナルを発光リーダーを用いて定量します(図1)。アッセイのS/N比は高いです。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 標的細胞におけるEGFRおよびVEGFR発現の検出

注:ウェスタンブロッティングを使用して、標的細胞における標的抗原の発現を検出します。

  1. サンプル調製
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地を使用して、T75フラスコで細胞(BHT-101およびSW-1736ヒト甲状腺癌細胞株)を培養します。
    2. 細胞が80%コンフルエントになったら、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄して回収します。PBSを5mL加え、細胞スクレーパーを使用して細胞をスクラップし、培養フラスコから細胞を取り出します。細胞を15mLのコニカルチューブに移します。
    3. セルカウンターでセルをカウントします。
    4. BHT-101およびSW-1736細胞の5×10、6 を15mLの円錐管に分注します。
    5. 細胞を室温で5分間、135 × g でスピンダウンします。上清PBSを取り除きます。
    6. プロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤を含むRIPA溶解バッファー100 μLを氷上で5分間加えて、細胞ペレットを溶解します。ライセートを2 mLチューブに移し、15,000 × g で15分間遠心分離し、上清を新しい2 mLチューブに移します。
    7. ビシンコニン酸(BCA)アッセイキットを使用して、細胞ライセートのタンパク質濃度を測定します。
    8. 各サンプルの細胞ライセートから70 μgのタンパク質を分量し、10% 2-メルカプトエタノールを添加した2x Laemliサンプルバッファーを加え、サンプルを100°Cで5分間煮沸してサンプルを変性させます。
  2. ゲル電気泳動とメンブレントランスファー
    1. 蒸留水(4.7 mL)、30%アクリルアミド(2.7 mL)、1.5 M Tris Buffer、pH 8.8(2.5 mL)、10%ドデシル硫酸ナトリウム(0.1 mL)、10%過硫酸アンモニウム(100 μL)、およびTEMED(10 μL)を使用して、8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルを調製します。
    2. 変性させたサンプル70 μgを8% SDS-ポリアクリルアミドゲル中で80 Vで20分間、120 Vで100分間分析します。
    3. ゲル上のタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに100Vで90分間移します。
    4. 移した後、TBS-Tバッファー(20 mM Tris pH 7.6、140 mM NaCl、0.2% Tween-20)で希釈した7%スキムミルクでメンブレンを1時間ブロッキングします。
  3. 抗体インキュベーション
    1. ブロックしたメンブレンをマウスの抗上皮成長因子受容体(EGFR)およびウサギの抗血管内皮成長因子受容体(VEGFR)モノクローナル抗体(7%スキムミルクで1:1,000に希釈)と4°Cで一晩インキュベートします。
    2. インキュベーション後、メンブレンをTris-buffered saline-Tween(TBS-T)バッファー(20 mM Tris pH 7.6、140 mM NaCl、0.2% Tween-20)で7分間十分に洗浄し、4回繰り返します。
    3. メンブレンをHRP標識二次抗体(7%スキムミルク(TBS-T)で1:4,000に希釈)と1時間インキュベートします。
    4. インキュベーション後、TBS-Tバッファーでメンブレンを7分間十分に洗浄し、4回繰り返します。
  4. タンパク質検出
    1. 1 mLのHRP基質過酸化物溶液と1 mLのHRP基質Luminol Reagent(両方の試薬は化学発光基質キットに由来)を混合して調製した化学発光HRP基質でメンブレンをインキュベートします。
    2. イメージングシステムを使用してメンブレンを視覚化します。

2. 標的細胞の調製

  1. T-75フラスコに10%FBS、1%L-グルタミン、および1%抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加したRPMI培地で80%コンフルエントになるまで、標的T細胞、BHT-101およびSW-1736細胞を指数関数的に培養します。
  2. 培地を取り除いた後、細胞をPBSで一度洗浄します。細胞を1 mLの非酵素的細胞解離バッファーと5分間インキュベートして、接着細胞を取り除きます。PBSを添加して、非酵素細胞解離バッファーの反応を停止します。細胞を135 × g で5分間スピンダウンし、PBSを5 mL加えます。
    注:ここでは、膜表面タンパク質の完全性を維持するために、非酵素的細胞解離バッファーを使用します。
  3. 細胞をカウントし、15,000個の細胞/ウェルで、底が透明で平坦な96ウェルの白色ポリスチレンマイクロプレートに播種します。

3. 抗体の濃度を変化させるための調製

  1. このプロトコルに従うには、セツキシマブ (キメラ抗 EGFR 抗体) を使用して EGFR に結合し、ベバシズマブ (ヒト化抗 VEGF-A 抗体) をネガティブ コントロールとして使用します。
  2. 1.4 mLの低IgG血清を33.6 mLのRPMI-1640(キットに付属)に加えて、ADCC Bioassay Bufferを調製します。
  3. 抗体の希釈にはADCC Bioassay bufferを使用してください。各抗体を3つの異なる濃度(30 μg/mL、3 μg/mL、0.3 μg/mL(3倍濃度))で調製し、最終濃度10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mLを得ると、最適な用量を検出するためのワイドスペクトラムカバレッジが得られます。
    注:最終抗体濃度は、96ウェルプレートの各ウェル中の25 μLの培養標的細胞、25 μLのエフェクター細胞、および25 μLの抗体に基づいています。

4. エフェクター細胞の調製

  1. エフェクターセルは-80°Cで保存してからご使用ください。
  2. ADCC Bioassay Buffer を 37 °C のウォーターバスで少なくとも 30 分間予熱してから使用してください。
  3. ADCC Bioassay Effector細胞を-80°Cの低温保存から37°Cのウォーターバス(約2〜3分)に入れて解凍します。バイアルを静かに揺らし、目視検査しますが、解凍プロセス中にバイアルを反転させないでください。
  4. 630 mLのエフェクター細胞を、3.6 mLのADCC Assay Bufferが入った15 mLチューブに移します。チューブを2倍に静かに反転させてよく混ぜます。

5. エフェクター細胞と抗体細胞および標的細胞とのインキュベーション

  1. 一晩インキュベートした後、標的細胞(ウェルあたり15,000個のがん細胞)から培地を取り出し、25 μLのADCC Bioassayバッファーと25 μLのセツキシマブ(EGFR拮抗薬)およびベバシズマブ(VEGF拮抗薬)を加えて、 図2に従って各ウェルの標的細胞の最終濃度を0.1 μg/mL、1 μg/mL、または10 μg/mLにします。
  2. ウェルあたり25 μLのADCCバイオアッセイバッファーに75,000個のエフェクター細胞を、標的細胞を含む96ウェルマイクロプレートに加えます。No mAbとラベル付けされたウェルは、No Antibody Controlとして機能します(図2)。
  3. AB(ADCC Bioassay buffer)とラベル付けされたウェルにADCC Bioassay bufferを添加し、ブランクコントロールを行います。
  4. プレートを6時間インキュベートします。

6. ADCC活動の定量的な読み出し

  1. 測定の4時間前に、ルシフェラーゼアッセイバッファーをルシフェラーゼアッセイ基質(凍結乾燥)に添加して、ルシフェラーゼアッセイ試薬を調製します。
  2. 標的細胞、抗体、およびエフェクター細胞を6時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイ試薬75μLを各ウェルに加え、30分間インキュベートします。
  3. インキュベーション期間の後、ルミノメーターを使用して各ウェルの発光シグナルを測定し、ADCC活性を定量的に読み出します。
  4. データ分析では、フォールドインダクションを次のように計算します。
    フォールド誘導 = RLU (抗体誘導 - バックグラウンド) / RLU (抗体制御なし - バックグラウンド)。
    ここで、RLUは相対発光単位です。誘導される抗体は、ウェルB3〜B8およびC3〜C8です。抗体制御なし = B2 および C2;バックグラウンド = A2 から A5 までの平均 RLU (図 2)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

標的BHT-101およびSW-1736細胞におけるEGFRおよびVEGFRの発現をウェスタンブロッティングを用いて検出しました。BHT-101細胞とSW-1736細胞の両方でEGFRの発現が検出されましたが、VEGFRの発現は検出されませんでした(図3)。

ADCCバイオアッセイキットを用いて、EGFR陽性細胞株BHT-101およびSW-1736を標的細胞として、抗EGFR抗体セツキシマブのADCC反応を検出しました。VEGF不活化剤であるベバシズマブは、ネガティブコントロール抗体として使用されました。異なる濃度の抗体およびエフェクター細胞を標的細胞とインキュベートした。発光信号は、プレートリーダーを使用して検出しました(図2)。セツキシマブ(抗EGFR抗体)群ではADCC活性誘導の倍率が高いことが認められましたが、ベバシズマブ(VEGF拮抗薬)では両細胞株のADCC活性は見られませんでした。これにより、両細胞株のEGFR細胞外膜抗原を標的としたADCC効果が実証...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、治療用抗体のADCC反応を評価するためのADCC Bioassay法について紹介しました。この方法は簡単で、測定に単純な「追加-ミックス-読み取り」形式を採用しています。

実験を行う前に、標的細胞における標的抗原の発現をフローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングのいずれかで確認する必要があります。フローサイトメトリーは、表面抗原を検出するためのより優れたツールとなるでしょう。しかし、フローサイトメトリーを使用すると、細胞にストレスがかかり、アポトーシスを引き起こし、細胞の生存率、ひいては全体的な解析に影響を与える可能性があります。さらに、ウェスタンブロッティングよりも高価です。この実験では、標的抗原が既知の細胞表面抗原であるため、より迅速で費用対効果の高い方法としてウェスタンブロッティングを使用しました。

エフェクター細胞として、FcγRIIIa受容体、V158(高親和性)変異体、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答因子を安定...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この度は、本研究をご支援いただいたZeng教授(IMCB, A*STAR)に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC)(82202231)の青年基金会、および中国浙江省医学健康科学技術プロジェクト(2021KY110,2024KY824)の支援を受けて行われました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% トリプシン-EDTAGibco15400-054PBSで10倍希釈して0.05%トリプシン
を作る 1x トリスバッファー生理食塩水(TBS)1st BASEBUF-3030-1X1Lウェスタンブロッティングでのメンブレン洗浄用
1.5 Mトリスバッファー、pH 8.81st BASEBUF-1419-1L-pH8.8SDSゲル調製用
2-メルカプトエタノールSigma AldrichM7522-100MLのサンプル調製用ウェスタンブロッティング
30% アクリルアミド/ビス溶液Bio-Rad#1610158SDSゲル調製用
4x Laemmli BufferBio-Rad#1610747ウェスタンブロッティング
96ウェル白色ポリスチレンマイクロプレート、透明平底コーニングインコーポレイテッド3610ADCC アッセイ用
ADCC バイオアッセイ エフェクター細胞 (0.65 mL)PromegaG7011ADCCレポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 1バイアル
ADCCレポーターバイオアッセイコアキットPromegaG7010この実験でADCCアッセイ用のADCCバイオアッセイキットとして言及
過硫酸アンモニウムSigmaAldrich A3678-25GSDSゲル調製用
ベバシズマブ(ヒト化抗VEGF抗体)MVASI-ADCCアッセイ
のネガティブコントロール抗体として使用BHT-101ライプニッツ研究所 DSMZACC279ヒト未分化甲状腺乳頭がん細胞株 
Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイバッファーPromegaG7941ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010) に含まれ、1 x 10 mL
Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイ基質 (凍結乾燥済み)PromegaG7941ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010)、1 x 1 バイアル
セルスクレーパーGenFollowerGD00235培養フラスコから細胞を除去するには
セツキシマブ (キメラ抗EGFR抗体)ERBITUX-ADCCアッセイの治療用抗体として使用
化学発光HRP基質メルクミリポアWBKLS0500ウェスタンブロッティングにおけるタンパク質検出用
蒸留水Gibco15230-162SDSゲル調製用
ウシ胎児血清(FBS)Gibco10270-106培地サプリメント
iBright CL1500イメージングシステムThermo Scientific2462621100038ウェスタンブロッティング
L-グルタミン、200 mMGibco25030-081培地サプリメント
低IgG血清PromegaG7110ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 4 mL
Megafuge 8RThermo Scientific42876589Centrifuge
Mouse 抗 EGFR モノクローナル抗体BD Biosciences610016ウェスタンブロッティング中の一次抗体
マウス抗VEGFRモノクローナル抗体BD Biosciences571194ウェスタンブロッティング中の一次抗体
非酵素的細胞解離バッファーSigma AldrichC5789-100MLT75フラスコからの細胞回収用
ペニシリン-ストレプトマイシンPAN BiotechP06-07100抗菌剤培地
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、滅菌ろ過1st BASECUS-2048-1x1L細胞の洗浄液として使用
Pierce BCAアッセイキットThermo Scientific23225タンパク質濃度の測定
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤Thermo ScientificA32959ウェスタンブロッティングPVDFのサンプル調製におけるタンパク質消化用
メンブレン(Immobilin-P)Merck MilliporeIPVH00010ウェスタンブロッティング
抗マウスIgG、Fc&γにおけるタンパク質転写用;HRP標識二次抗体Jackson ImmunoResearch315-035-046ウェスタンブロッティング中の二次抗体
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI) 培地Capricorn ScientificRPMI-XA細胞培養培地
RPMI-1640プロメガG7080ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(プロメガ G7010)、36mL
スキム粉乳1個 メルクミリポア70166-500Gウェスタンブロッティングにおける膜ブロッキング用
ドデシル硫酸ナトリウム1st BASEBIO-2050-500gSDSゲル調製用
SW-1736Cytion300453ヒト甲状腺扁平上皮がん細胞株
T75培養フラスコSPL ライフサイエンス70075細胞培養フラスコ
Tecan マルチモードリーダーモデル Spark 10MTecan1607000294ルミニセンス定量
TEMEDBio-Rad#1610801SDSゲル調製用
Tween-20PromegaH5151ウェスタンブロッティングにおけるメンブレン洗浄用
Vi-cell XR細胞生存率分析装置ベックマン・コールターAL15072セルカウンター
のサンプル調製用 に含まれるもの ウサギ

参考文献

  1. Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
  2. Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
  3. Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
  4. Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
  5. Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
  6. Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
  7. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  8. Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
  9. Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
  10. Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
  11. Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
  12. Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
  13. Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
  14. Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
  15. Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

抗体依存性細胞傷害活性ADCCバイオアッセイがん免疫療法治療用抗体エフェクター細胞標的がん細胞ルシフェラーゼレポーターアッセイEGFR抗原ルミネッセンス測定細胞共培養
抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。