方法論記事

抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

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DOI:

10.3791/67077

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2024年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR 61 Biopolis Drive, 2Department of Radiation Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, 3Key Laboratory of Head and Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 4Department of Thyroid Surgery of Zhejiang Cancer Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ADCCバイオアッセイキットを使用した抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)アッセイのプロトコールを紹介します。この方法は、がん免疫療法におけるADCCメカニズムの解明と抗体の治療可能性を評価するための貴重なツールを提供します。

要約

抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)の方法は、がん免疫療法における治療用抗体の有効性を評価するための重要なツールです。がん細胞におけるADCC活性の評価は、抗体ベースの治療法の開発と最適化に不可欠です。本研究では、甲状腺がん細胞をエフェクター細胞としてADCC反応を定量的に評価するために、ADCCバイオアッセイキットを活用する方法論的アプローチを提案する。このプロトコルでは、治療用抗体の存在下で、エフェクター細胞と標的がん細胞を異なる比率で共培養します。この実験で使用したADCCバイオアッセイキットには、活性化T細胞の核因子(NFAT)応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変エフェクター細胞が含まれています。標的細胞上の表面抗原が抗体やエフェクター細胞と結合すると、エフェクター細胞はルシフェラーゼを放出し、発光シグナルの測定による細胞毒性の定量化が可能になります。従来のADCCアッセイとは対照的に、この方法は標的抗原と抗体およびエフェクター細胞との結合を証明し、短期間で信頼性の高い結果を得ることができます。

概要

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)は、抗体が免疫介在性細胞死害効果を発揮する重要なメカニズムです1,2,3。免疫細胞は、治療用抗体に結合することによって活性化され、抗体は標的細胞の表面抗原と相互作用してグランザイム、パーフォリンを放出し、標的細胞死につながります。これらの免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞と好中球2,3,4,5,6,7が含まれます。ADCCアッセイは、治療用抗体8,9の有効性を評価するための重要なツールとなっています。

従来のADCCアッセイでは、末梢血単核細胞(PBMC)またはナチュラルキラー細胞をエフェクター細胞として使用し、標的の細胞死率を定量することで治療用抗体の有効性をモニタリングしていました。本法では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する遺伝子改変エフェクター細胞を、Nuclear Factor of Activated T-cell(NFAT)応答エレメントの制御下で配合したADCCバイオアッセイキットを用いています。次に、標的細胞上の表面抗原と抗体およびエフェクター細胞との結合を定量化します。この方法は、ヒトPBMC細胞を必要とせずに短時間で起こるADCC反応に基づいています。実験ステップには、治療用抗体の存在下でのエフェクター細胞と標的細胞の共培養が含まれます。

インキュベーション中、治療用抗体は標的細胞の表面上の標的抗原に結合し、エフェクター細胞と抗体のFcフラグメントが結合します。これにより、NFAT応答素子が活性化され、ADCC反応の定量的評価のための発光シグナルが放出されます。

実験を行う前に、標的細胞における標的抗原の発現をフローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングのいずれかで確認する必要があります。標的細胞を培養し、実験前に24時間96ウェルプレートに継代します。異なる濃度の治療用抗体を、エフェクター細胞の異なる細胞数とともに添加し、計算されたエフェクター対標的細胞比を達成します。

この方法の主なステップには、(1)標的細胞とエフェクター細胞の調製、(2)エフェクターと標的細胞の比率、(3)異なる濃度の抗体の調製、(4)インキュベーション期間の変動などがあります。インキュベーション後、発光シグナルはルミノメーターを使用して測定され、ADCC活性の定量的な読み出しが得られます。ADCCを測定する他の方法と比較して、この方法は操作が比較的簡単で、結果は正確です。

ADCCレポーターバイオアッセイは、標的抗原、治療用抗体、および免疫細胞がADCC経路の活性化に結合することを示しています。この結合は、安定して発現するFcγRIIIa受容体であるV158(高親和性)バリアントを持つエフェクター細胞操作Jurkat細胞のNFAT経路を介して遺伝子転写を活性化します。NFAT応答要素は、エフェクター細胞10,11におけるルシフェラーゼの発現を媒介する。ADCCの作用機序(MOA)における抗体の生物学的活性は、NFAT経路から生成されるルシフェラーゼシグナルを通じて定量されます。エフェクター細胞(FcγRIIIa受容体発現ジャーケット細胞)のルシフェラーゼシグナルを発光リーダーを用いて定量します(図1)。アッセイのS/N比は高いです。

プロトコル

1. 標的細胞におけるEGFRおよびVEGFR発現の検出

注:ウェスタンブロッティングを使用して、標的細胞における標的抗原の発現を検出します。

  1. サンプル調製
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地を使用して、T75フラスコで細胞(BHT-101およびSW-1736ヒト甲状腺癌細胞株)を培養します。
    2. 細胞が80%コンフルエントになったら、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄して回収します。PBSを5mL加え、細胞スクレーパーを使用して細胞をスクラップし、培養フラスコから細胞を取り出します。細胞を15mLのコニカルチューブに移します。
    3. セルカウンターでセルをカウントします。
    4. BHT-101およびSW-1736細胞の5×10、6 を15mLの円錐管に分注します。
    5. 細胞を室温で5分間、135 × g でスピンダウンします。上清PBSを取り除きます。
    6. プロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤を含むRIPA溶解バッファー100 μLを氷上で5分間加えて、細胞ペレットを溶解します。ライセートを2 mLチューブに移し、15,000 × g で15分間遠心分離し、上清を新しい2 mLチューブに移します。
    7. ビシンコニン酸(BCA)アッセイキットを使用して、細胞ライセートのタンパク質濃度を測定します。
    8. 各サンプルの細胞ライセートから70 μgのタンパク質を分量し、10% 2-メルカプトエタノールを添加した2x Laemliサンプルバッファーを加え、サンプルを100°Cで5分間煮沸してサンプルを変性させます。
  2. ゲル電気泳動とメンブレントランスファー
    1. 蒸留水(4.7 mL)、30%アクリルアミド(2.7 mL)、1.5 M Tris Buffer、pH 8.8(2.5 mL)、10%ドデシル硫酸ナトリウム(0.1 mL)、10%過硫酸アンモニウム(100 μL)、およびTEMED(10 μL)を使用して、8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルを調製します。
    2. 変性させたサンプル70 μgを8% SDS-ポリアクリルアミドゲル中で80 Vで20分間、120 Vで100分間分析します。
    3. ゲル上のタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに100Vで90分間移します。
    4. 移した後、TBS-Tバッファー(20 mM Tris pH 7.6、140 mM NaCl、0.2% Tween-20)で希釈した7%スキムミルクでメンブレンを1時間ブロッキングします。
  3. 抗体インキュベーション
    1. ブロックしたメンブレンをマウスの抗上皮成長因子受容体(EGFR)およびウサギの抗血管内皮成長因子受容体(VEGFR)モノクローナル抗体(7%スキムミルクで1:1,000に希釈)と4°Cで一晩インキュベートします。
    2. インキュベーション後、メンブレンをTris-buffered saline-Tween(TBS-T)バッファー(20 mM Tris pH 7.6、140 mM NaCl、0.2% Tween-20)で7分間十分に洗浄し、4回繰り返します。
    3. メンブレンをHRP標識二次抗体(7%スキムミルク(TBS-T)で1:4,000に希釈)と1時間インキュベートします。
    4. インキュベーション後、TBS-Tバッファーでメンブレンを7分間十分に洗浄し、4回繰り返します。
  4. タンパク質検出
    1. 1 mLのHRP基質過酸化物溶液と1 mLのHRP基質Luminol Reagent(両方の試薬は化学発光基質キットに由来)を混合して調製した化学発光HRP基質でメンブレンをインキュベートします。
    2. イメージングシステムを使用してメンブレンを視覚化します。

2. 標的細胞の調製

  1. T-75フラスコに10%FBS、1%L-グルタミン、および1%抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加したRPMI培地で80%コンフルエントになるまで、標的T細胞、BHT-101およびSW-1736細胞を指数関数的に培養します。
  2. 培地を取り除いた後、細胞をPBSで一度洗浄します。細胞を1 mLの非酵素的細胞解離バッファーと5分間インキュベートして、接着細胞を取り除きます。PBSを添加して、非酵素細胞解離バッファーの反応を停止します。細胞を135 × g で5分間スピンダウンし、PBSを5 mL加えます。
    注:ここでは、膜表面タンパク質の完全性を維持するために、非酵素的細胞解離バッファーを使用します。
  3. 細胞をカウントし、15,000個の細胞/ウェルで、底が透明で平坦な96ウェルの白色ポリスチレンマイクロプレートに播種します。

3. 抗体の濃度を変化させるための調製

  1. このプロトコルに従うには、セツキシマブ (キメラ抗 EGFR 抗体) を使用して EGFR に結合し、ベバシズマブ (ヒト化抗 VEGF-A 抗体) をネガティブ コントロールとして使用します。
  2. 1.4 mLの低IgG血清を33.6 mLのRPMI-1640(キットに付属)に加えて、ADCC Bioassay Bufferを調製します。
  3. 抗体の希釈にはADCC Bioassay bufferを使用してください。各抗体を3つの異なる濃度(30 μg/mL、3 μg/mL、0.3 μg/mL(3倍濃度))で調製し、最終濃度10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mLを得ると、最適な用量を検出するためのワイドスペクトラムカバレッジが得られます。
    注:最終抗体濃度は、96ウェルプレートの各ウェル中の25 μLの培養標的細胞、25 μLのエフェクター細胞、および25 μLの抗体に基づいています。

4. エフェクター細胞の調製

  1. エフェクターセルは-80°Cで保存してからご使用ください。
  2. ADCC Bioassay Buffer を 37 °C のウォーターバスで少なくとも 30 分間予熱してから使用してください。
  3. ADCC Bioassay Effector細胞を-80°Cの低温保存から37°Cのウォーターバス(約2〜3分)に入れて解凍します。バイアルを静かに揺らし、目視検査しますが、解凍プロセス中にバイアルを反転させないでください。
  4. 630 mLのエフェクター細胞を、3.6 mLのADCC Assay Bufferが入った15 mLチューブに移します。チューブを2倍に静かに反転させてよく混ぜます。

5. エフェクター細胞と抗体細胞および標的細胞とのインキュベーション

  1. 一晩インキュベートした後、標的細胞(ウェルあたり15,000個のがん細胞)から培地を取り出し、25 μLのADCC Bioassayバッファーと25 μLのセツキシマブ(EGFR拮抗薬)およびベバシズマブ(VEGF拮抗薬)を加えて、 図2に従って各ウェルの標的細胞の最終濃度を0.1 μg/mL、1 μg/mL、または10 μg/mLにします。
  2. ウェルあたり25 μLのADCCバイオアッセイバッファーに75,000個のエフェクター細胞を、標的細胞を含む96ウェルマイクロプレートに加えます。No mAbとラベル付けされたウェルは、No Antibody Controlとして機能します(図2)。
  3. AB(ADCC Bioassay buffer)とラベル付けされたウェルにADCC Bioassay bufferを添加し、ブランクコントロールを行います。
  4. プレートを6時間インキュベートします。

6. ADCC活動の定量的な読み出し

  1. 測定の4時間前に、ルシフェラーゼアッセイバッファーをルシフェラーゼアッセイ基質(凍結乾燥)に添加して、ルシフェラーゼアッセイ試薬を調製します。
  2. 標的細胞、抗体、およびエフェクター細胞を6時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイ試薬75μLを各ウェルに加え、30分間インキュベートします。
  3. インキュベーション期間の後、ルミノメーターを使用して各ウェルの発光シグナルを測定し、ADCC活性を定量的に読み出します。
  4. データ分析では、フォールドインダクションを次のように計算します。
    フォールド誘導 = RLU (抗体誘導 - バックグラウンド) / RLU (抗体制御なし - バックグラウンド)。
    ここで、RLUは相対発光単位です。誘導される抗体は、ウェルB3〜B8およびC3〜C8です。抗体制御なし = B2 および C2;バックグラウンド = A2 から A5 までの平均 RLU (図 2)。

結果

標的BHT-101およびSW-1736細胞におけるEGFRおよびVEGFRの発現をウェスタンブロッティングを用いて検出しました。BHT-101細胞とSW-1736細胞の両方でEGFRの発現が検出されましたが、VEGFRの発現は検出されませんでした(図3)。

ADCCバイオアッセイキットを用いて、EGFR陽性細胞株BHT-101およびSW-1736を標的細胞として、抗EGFR抗体セツキシマブのADCC反応を検出しました。VEGF不活化剤であるベバシズマブは、ネガティブコントロール抗体として使用されました。異なる濃度の抗体およびエフェクター細胞を標的細胞とインキュベートした。発光信号は、プレートリーダーを使用して検出しました(図2)。セツキシマブ(抗EGFR抗体)群ではADCC活性誘導の倍率が高いことが認められましたが、ベバシズマブ(VEGF拮抗薬)では両細胞株のADCC活性は見られませんでした。これにより、両細胞株のEGFR細胞外膜抗原を標的としたADCC効果が実証されました。この方法を用いて、2つの未分化甲状腺がん細胞株(BHT101およびSW1736)において、セツキシマブの存在下でADCC反応が検証されました(図4)。

figure-results-1
図1:ADCCバイオアッセイキットを使用したADCC反応を示す概略図。 治療用抗体の抗原結合部位は、標的細胞の表面抗原に結合します。この結合により、抗体のFc部分がエフェクター細胞のFcƳRIIIa受容体に結合し、エフェクター細胞に発光シグナルが生成されます。この図は、ADCC Reporter Bioassay Core kit のマニュアルから許可を得て12 で修正したものです。略語:ADCC =抗体依存性細胞媒介性細胞毒性;Fc =フラグメント結晶化可能領域;NFAT = 活性化T細胞の核因子;RE = 応答要素;luc = ルシフェラーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:ADCC共培養システムの96ウェルプレート設計の発光読み取りと実験図。 発光信号は発光リーダーによって読み取られます。行A:1st-9thウェルにはADCC Bioassay Bufferが含まれています。B列:3rd-8thウェルには、BHT101のADCC反応系(標的細胞+抗体+エフェクター細胞)が含まれています。2番目のウェルは抗体なしです。9番目のウェルには、ADCC Bioassayバッファーのみが含まれています。C列:3rd-8thウェルには、SW-1736のADCC反応系(標的細胞+抗体+エフェクター細胞)が含まれています。2番目のウェルは抗体なしです。9番目のウェルには、ADCC Bioassayバッファーのみが含まれています。行D:1st-9thウェルにはアッセイバッファーが含まれています。略語:ADCC =抗体依存性細胞媒介性細胞毒性;AB = ADCC バイオアッセイバッファー;VEGFR = 血管上皮成長因子受容体;EGFR = 上皮成長因子受容体;mAb=モノクローナル抗体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:ウェスタンブロッティングを用いたBHT-101およびSW-1736甲状腺がんにおけるEGFRおよびVEGFR発現の検出。 EGFRの発現は検出されましたが、VEGFRの発現は検出されませんでした。ローディング制御としてB-アクチンを使用しました。略語:EGFR =上皮成長因子受容体;VEGFR = 血管上皮成長因子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
(A)甲状腺がん細胞株BHT-101は、抗EGFR抗体セツキシマブの存在下でADCC効果を示す。(B)甲状腺がん細胞株SW−1736は、抗EGFR抗体セツキシマブの存在下でADCC効果を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、治療用抗体のADCC反応を評価するためのADCC Bioassay法について紹介しました。この方法は簡単で、測定に単純な「追加-ミックス-読み取り」形式を採用しています。

実験を行う前に、標的細胞における標的抗原の発現をフローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングのいずれかで確認する必要があります。フローサイトメトリーは、表面抗原を検出するためのより優れたツールとなるでしょう。しかし、フローサイトメトリーを使用すると、細胞にストレスがかかり、アポトーシスを引き起こし、細胞の生存率、ひいては全体的な解析に影響を与える可能性があります。さらに、ウェスタンブロッティングよりも高価です。この実験では、標的抗原が既知の細胞表面抗原であるため、より迅速で費用対効果の高い方法としてウェスタンブロッティングを使用しました。

エフェクター細胞として、FcγRIIIa受容体、V158(高親和性)変異体、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答因子を安定的に発現する改変Jurkat細胞を用いた。NFAT経路の活性化によりルシフェラーゼが産生され、その活性は発光読み出しの形で定量化されます。この信号は、ADCCのアクティビティも表します。

まず、標的細胞(T)をエフェクター細胞(E)と混合量の抗体の存在下で、加湿したCO2 インキュベーター内で96ウェルプレート中、37°C、6時間インキュベートします。エフェクターとターゲットの比率は5:1で、信号の最適化に用いられます。例えば、75,000個のエフェクター細胞を15,000個の標的細胞に添加した。インキュベーション終了時に、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、30分間インキュベートし、発光プレートリーダーを用いて発光(RLU、相対ルシフェラーゼ単位)を測定します。

このプロトコルの主要な重要なステップは、(1)エフェクター細胞の取り扱いです。セルバイアルは、解凍プロセス中に反転させてはならず、穏やかに揺さぶってはならず、望ましくない細胞死や生物学的検出のパフォーマンスに影響を与えるのを防ぐために、解凍直後に使用する必要があります。(2).発光測定には、リーダーの底面から発光を捕捉するため、透明で平底な白色ポリスチレン96ウェルマイクロプレートを使用することが重要です。

本研究では、抗EGFR抗体であるセツキシマブのADCC反応の強弱を、標的細胞の量と抗体濃度によって観察しました。弱いADCC反応のキャリブレーションを処理するいくつかの理由:(1)ADCCレポーターバイオアッセイの読み取り値は、エフェクター細胞(E)から来ており、この研究のADCC反応システム内のウェルあたり75,000個の細胞が一定しています。したがって、標的細胞(T)の品質を最適化することは、改善できる1つの側面です。この研究のE:T比は5:1であり、最大20:1まで調整できました。(2)抗体濃度もADCC反応に影響を与える重要な要因の1つです。抗体を段階希釈することで調整を行い、最適な濃度範囲を探索することで、ADCCレポートで最大の応答を得ることができます。(3)抗体、標的細胞、エフェクター細胞のインキュベーション時間も実験結果にとって重要です。本研究では、6時間インキュベートしましたが、これは最大24時間まで延長することで、最適なADCC反応を得ることができます。(4)さらに、ADCCアッセイ用の緩衝液(低IgG)の濃度も検討する必要があります。ADCC応答の最適な血清濃度は、1%から10%の範囲で達成できます。

この実験方法は迅速かつ簡単で、簡単な「add-mix-read」プロトコルで1日以内に完了することができます。結果は安定しており、バッチテストに適しています。しかし、このバイオアッセイキットは、PBMC細胞またはNK細胞をエフェクター細胞として使用する従来のADCC法のように細胞死を検出しない12,13。その代わり、FcγRIIIa受容体で発現したジャーカット細胞をエフェクター細胞として用いていますが、この細胞は遺伝子改変されているため、コストが高くなります。従来のADCC実験13,14と比較して、健康な個人からの献血の必要性を排除し、免疫細胞を抽出する複雑なプロセスを回避し、結果に影響を与える可能性のある個々の変動を軽減します。検出された発光シグナルは、エフェクター細胞の標的細胞への結合によるものであり、標的細胞の実際の死によるものではありません。そのため、標準的なADCC検出方法とは異なっている場合があります。さらに、トリプシンよりも高価な細胞解離バッファーを使用して、接着細胞を剥離し、膜の完全性を維持します。

ADCCレポーター遺伝子解析は、優れた精度と安定性を示し、抗体医薬の質量検出における有効性解析法として有用です。また、治療用分子の特性評価やプロセス開発のための重要な分析法としても機能します15。

要約すると、ADCCは重要な免疫メカニズムであり、ADCCの定量的検出は免疫療法の分野で非常に重要です。この実験方法は、ADCC15の定量測定に有効な手段を提供します。

開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この度は、本研究をご支援いただいたZeng教授(IMCB, A*STAR)に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC)(82202231)の青年基金会、および中国浙江省医学健康科学技術プロジェクト(2021KY110,2024KY824)の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% トリプシン-EDTAGibco15400-054PBSで10倍希釈して0.05%トリプシン
を作る 1x トリスバッファー生理食塩水(TBS)1st BASEBUF-3030-1X1Lウェスタンブロッティングでのメンブレン洗浄用
1.5 Mトリスバッファー、pH 8.81st BASEBUF-1419-1L-pH8.8SDSゲル調製用
2-メルカプトエタノールSigma AldrichM7522-100MLのサンプル調製用ウェスタンブロッティング
30% アクリルアミド/ビス溶液Bio-Rad#1610158SDSゲル調製用
4x Laemmli BufferBio-Rad#1610747ウェスタンブロッティング
96ウェル白色ポリスチレンマイクロプレート、透明平底コーニングインコーポレイテッド3610ADCC アッセイ用
ADCC バイオアッセイ エフェクター細胞 (0.65 mL)PromegaG7011ADCCレポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 1バイアル
ADCCレポーターバイオアッセイコアキットPromegaG7010この実験でADCCアッセイ用のADCCバイオアッセイキットとして言及
過硫酸アンモニウムSigmaAldrich A3678-25GSDSゲル調製用
ベバシズマブ(ヒト化抗VEGF抗体)MVASI-ADCCアッセイ
のネガティブコントロール抗体として使用BHT-101ライプニッツ研究所 DSMZACC279ヒト未分化甲状腺乳頭がん細胞株 
Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイバッファーPromegaG7941ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010) に含まれ、1 x 10 mL
Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイ基質 (凍結乾燥済み)PromegaG7941ADCC レポーターバイオアッセイコアキット (Promega G7010)、1 x 1 バイアル
セルスクレーパーGenFollowerGD00235培養フラスコから細胞を除去するには
セツキシマブ (キメラ抗EGFR抗体)ERBITUX-ADCCアッセイの治療用抗体として使用
化学発光HRP基質メルクミリポアWBKLS0500ウェスタンブロッティングにおけるタンパク質検出用
蒸留水Gibco15230-162SDSゲル調製用
ウシ胎児血清(FBS)Gibco10270-106培地サプリメント
iBright CL1500イメージングシステムThermo Scientific2462621100038ウェスタンブロッティング
L-グルタミン、200 mMGibco25030-081培地サプリメント
低IgG血清PromegaG7110ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(Promega G7010)、1 x 4 mL
Megafuge 8RThermo Scientific42876589Centrifuge
Mouse 抗 EGFR モノクローナル抗体BD Biosciences610016ウェスタンブロッティング中の一次抗体
マウス抗VEGFRモノクローナル抗体BD Biosciences571194ウェスタンブロッティング中の一次抗体
非酵素的細胞解離バッファーSigma AldrichC5789-100MLT75フラスコからの細胞回収用
ペニシリン-ストレプトマイシンPAN BiotechP06-07100抗菌剤培地
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、滅菌ろ過1st BASECUS-2048-1x1L細胞の洗浄液として使用
Pierce BCAアッセイキットThermo Scientific23225タンパク質濃度の測定
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤Thermo ScientificA32959ウェスタンブロッティングPVDFのサンプル調製におけるタンパク質消化用
メンブレン(Immobilin-P)Merck MilliporeIPVH00010ウェスタンブロッティング
抗マウスIgG、Fc&γにおけるタンパク質転写用;HRP標識二次抗体Jackson ImmunoResearch315-035-046ウェスタンブロッティング中の二次抗体
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI) 培地Capricorn ScientificRPMI-XA細胞培養培地
RPMI-1640プロメガG7080ADCC レポーターバイオアッセイコアキット(プロメガ G7010)、36mL
スキム粉乳1個 メルクミリポア70166-500Gウェスタンブロッティングにおける膜ブロッキング用
ドデシル硫酸ナトリウム1st BASEBIO-2050-500gSDSゲル調製用
SW-1736Cytion300453ヒト甲状腺扁平上皮がん細胞株
T75培養フラスコSPL ライフサイエンス70075細胞培養フラスコ
Tecan マルチモードリーダーモデル Spark 10MTecan1607000294ルミニセンス定量
TEMEDBio-Rad#1610801SDSゲル調製用
Tween-20PromegaH5151ウェスタンブロッティングにおけるメンブレン洗浄用
Vi-cell XR細胞生存率分析装置ベックマン・コールターAL15072セルカウンター
のサンプル調製用 に含まれるもの ウサギ

参考文献

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