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心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

DOI:

10.3791/67083

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January 31st, 2025

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1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

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この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV プロテオームのラベルフリー分析のワークフローを示します。

Abstract

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細胞外小胞(EV)は、細胞由来の脂質二重層内包型非複製性ナノ粒子です。EVは、細胞間コミュニケーションの調節に役割を果たし、心血管疾患の貴重なバイオマーカーとして機能する可能性があるため、現在、心血管研究で注目を集めています。しかし、EVプロテオームとその心血管診断におけるバイオマーカーとしての可能性は、まだ十分に理解されていません。このプロトコルは、血漿由来 EV の単離と定量、および大規模な大学病院の胸痛病棟に来院した患者の血漿サンプルを使用したそれらのタンパク質カーゴの分析のための標準化された方法を提供します。ルーチンの瀉血後、EVは示差超遠心分離によって血漿から分離されます。EV分離株中の特定のEVマーカータンパク質の濃縮はイムノブロッティングによって視覚化され、平均サイズ分布と血漿EV濃度はナノ粒子追跡分析によって定量されます。最後に、超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法を使用して、EVプロテオームのラベルフリー分析を行います。したがって、このプロトコルは、血漿由来のEVを重要な生物学的情報の潜在的なキャリアとして研究および使用するための包括的なアプローチを提供するだけでなく、新しいバイオマーカーとしての可能性を探求します。

Introduction

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細胞外小胞(EV)は、命名法では一様に定義されていませんが、脂質二重層に囲まれ、さまざまな細胞タイプによって放出されるナノ粒子であり、複製能力を欠いています1。この多様なグループには、エンドソーム起源のEVの亜集団であるエキソソームが含まれ、典型的には直径が約40nmから160nmの範囲である2。EVは、多数の体液3から検出可能で、タンパク質、mRNA、マイクロRNA、脂質などのさまざまな活性生体分子を移動させることで、細胞間コミュニケーションを促進します。したがって、EVは、細胞特異的な表面マーカーや生体分子を通じて、その起源の細胞に関する情報を提供し、その特性は親細胞の状態やその環境に強く影響される4。これらの特性により、特に心血管疾患の文脈において、EVがバイオマーカーとして果たす可能性のある役割への関心が高まっています。

数多くのin vitroおよびin vivo研究により、心筋の低酸素ストレスがEVの放出を増加させることが実証されています5,6,7....

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Protocol

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このプロトコルでは、明らかなまたは基礎のある心血管疾患の徴候がない3人の健康な対照患者と、非ST上昇型心筋梗塞(NSTEMI)の2人の患者を含む模範的な患者コホートが募集されました。ハイデルベルク大学医学部の治験審査委員会によって事前承認が与えられました (IRB 承認 #S-351/2015)、募集前にすべての患者から書面による同意が得られました。患者は、最初の臨床症状、病歴、および診断テストの結果に基づいて、ハイデルベルク大学病院の心臓病科の胸痛ユニットから募集されました。

健常対照患者の選択基準には、非定型または非特異的な臨床症状、心臓バイオマーカーレベルが正常範囲内であること、心血管疾患の既往歴がないこと、およびさらなる診断検査で正常所見が認められることが含まれていました。除外基準には、過去5年以内の悪性腫瘍または細胞増殖抑制療法の病歴、血液透析、家族性高脂血症症候群、および心血管疾患の病歴が含まれていました。NSTEMIは現在のガイドライン12に従って診断され、冠動脈造影によって血行力学に関連する冠動脈狭窄が確認されました。各患者について、肘前静脈から標準的な瀉血13を介してクエン酸補充収集チューブに最大36 mLの血液を採取し、血液サンプルを直ちに4°Cで輸送してさらなる処理を行いまし....

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Results

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EVは、確立された鑑別超遠心分離プロトコルを使用して、明白な心血管疾患のない患者の血漿サンプル(n = 3)および非ST上昇型心筋梗塞(NSTEMI;n = 2)の患者から単離されました。血漿EVの適切な分離は、同じ患者のEV枯渇血漿と比較して、EV分離株中のEVが豊富なタンパク質TSG-101、アネキシン5(Anx5)、およびCD9の免疫ブロッティングによって確認されました(図1A)。ネガティブコントロールとして機能するトランスフェリンは、EV枯渇血清サンプルで検出されましたが、EV分離株では検出されず、コンパートメントの適切な分離が確認されました。分離された血漿サンプル中の一般的な血小板マーカーであるインテグリンβ3とリポタンパク質汚染のマーカーであるアポリポタンパク質A1(ApoA1)のイムノブロッティングでは、血液処理後に有意な汚染は示されませんでした(補足図1)。

ナノ粒子追跡分析を使用して、EVを同定し、ブラウン運動に基づいて視覚化しました(

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Discussion

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このプロトコールは、血漿EVの分離と特性評価のための実世界での段階的なすぐに使用できる方法論を提供するとともに、日常的な臨床診療への統合に適した非標識プロテオーム分析の紹介を提供します。得られた結果の再現性を確保するためには、プラズマサンプルからのEV単離の詳細な説明と統一された方法論への厳格な遵守が重要です。現在の文献では、分析前の条件がEV分離株のその後の測定および下流の分析に大きな影響を与える可能性があることが示されています。したがって、血漿由来のEV単離プロセスを適時に開始することが重要であり、理想的には採血後120分以内に開始し、最小限の攪拌でサンプルを処理することが重要である18。採取した血液の短期保存は4°Cで達成できます。しかし、時間と攪拌に加えて、低温も血小板の活性化を促進し、血小板由来のEVの放出につながる可能性があります19,20。これらのEVは、全体的なEV収量の豊富な構成要素を構成.......

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Disclosures

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EGは、Roche Diagnostics、BRAHMS Thermo Scientific、Bayer Vital GmbH、AstraZeneca、Lilly Deutschland、Boehringer Ingelheimの講師に対して謝礼を受け取りました。彼は、ロシュ・ダイアグノスティックスと第一三共から機関研究助成金を受け取り、提出された研究以外では、ロシュ・ダイアグノスティックス、BRAHMS Thermo Scientific、アストラゼネカ、ノバルティス、ベーリンガーインゲルハイムのコンサルタントを務めています。JBKは、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK)とロシュ・ダイアグノスティックス社からプロジェクト関連の資金提供を受けました。残りの著者は、提出された作品に関連する利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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著者は、このプロジェクト中の組織的なサポートについて、Heidi Deigentasch、Amelie Werner、Elisabeth Mertzに感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli サンプルバフファーBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcam ab156034
26.3 mL ポリカーボネートボトル キャップアセンブリ付き 超遠心分離用ベックマン・コールター355654
5810R 卓上遠心分離機エッペンドルフ5811000015
アセトニトリル (ACN)Biosolve0001204101BS
ジチオスレイトール (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichD8537
ギ酸 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
ヨードアセトアミド (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
質量分析計 Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS ランニングバッファーThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2ソフトウェアMalvern Panalytical 
NuPAGE 4 bis 12 %, Bis-Tris protein gelsInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 床置き型超遠心分離機Beckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Protein markerサーモフィッシャー26616
Proteome Discoverer 2.5サーモフィッシャーQ
Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計サーモフィッシャーサイエンティフィックIQLAAEGAAPFALGMBDK
クイックステイン クーマッシーセルバ35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & マイクロ;m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE 市販ゲルサーモフィッシャーNW00100BOX
S-モノベット Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Speed vac concentratorSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, June 2020) タンパク質データベースUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液 (TEAB)Sigma-AldrichT7408
トリフルオロ酢酸 (TFA)HPLC用 >99%、100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
トリプシン MSグレードサーモフィッシャー90058
タイプ 50.2 Ti 固定角ローターベックマン・コールター337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000サーモフィッシャーサイエンティフィックULTIM3000RSLCNANO
ウォーターバイオソルブ0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

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Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

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