心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

Summary

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV プロテオームのラベルフリー分析のワークフローを示します。

Abstract

細胞外小胞(EV)は、細胞由来の脂質二重層内包型非複製性ナノ粒子です。EVは、細胞間コミュニケーションの調節に役割を果たし、心血管疾患の貴重なバイオマーカーとして機能する可能性があるため、現在、心血管研究で注目を集めています。しかし、EVプロテオームとその心血管診断におけるバイオマーカーとしての可能性は、まだ十分に理解されていません。このプロトコルは、血漿由来 EV の単離と定量、および大規模な大学病院の胸痛病棟に来院した患者の血漿サンプルを使用したそれらのタンパク質カーゴの分析のための標準化された方法を提供します。ルーチンの瀉血後、EVは示差超遠心分離によって血漿から分離されます。EV分離株中の特定のEVマーカータンパク質の濃縮はイムノブロッティングによって視覚化され、平均サイズ分布と血漿EV濃度はナノ粒子追跡分析によって定量されます。最後に、超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法を使用して、EVプロテオームのラベルフリー分析を行います。したがって、このプロトコルは、血漿由来のEVを重要な生物学的情報の潜在的なキャリアとして研究および使用するための包括的なアプローチを提供するだけでなく、新しいバイオマーカーとしての可能性を探求します。

Introduction

細胞外小胞(EV)は、命名法では一様に定義されていませんが、脂質二重層に囲まれ、さまざまな細胞タイプによって放出されるナノ粒子であり、複製能力を欠いています¹。この多様なグループには、エンドソーム起源のEVの亜集団であるエキソソームが含まれ、典型的には直径が約40nmから160nmの範囲^である2。EV^{は、多数の}体液3から検出可能で、タンパク質、mRNA、マイクロRNA、脂質などのさまざまな活性生体分子を移動させることで、細胞間コミュニケーションを促進します。したがって、EVは、細胞特異的な表面マーカーや生体分子を通じて、その起源の細胞に関する情報を提供し、その特性は親細胞の状態やその環境に強く影響される⁴。これらの特性により、特に心血管疾患の文脈において、EVがバイオマーカーとして果たす可能性のある役割への関心が高まっています。

数多くのin vitroおよびin vivo研究により、心筋の低酸素ストレスがEVの放出を増加させることが実証^{されています5,6,7}。EV貨物に関する現代の研究は、主にEV結合型マイクロRNAに焦点を当てており、これは様々な心血管疾患の診断におけるバイオマーカーとして役立つ可能性を秘めている^8,9,10。対照的に、循環EVプロテオームに関する証拠は比較的乏しく、心血管患者における血漿EVを調査した研究はさらに少ない。心筋梗塞を患っている患者の血漿由来EVに関する2つの包括的な研究で、著者らは、診断上の関連性を持つ可能性のある特定の虚血誘発性EVプロテオームプロファイルを特定しました^6,11。

EVの方法論的処理は歴史的に困難であることが証明されており、現在、EVの分離、特性評価、および定量化に対する最適なアプローチについて明確な推奨事項はありません。EV単離に一般的に使用される方法には、示差超遠心分離、密度勾配遠心分離、およびサイズ排除^{クロマトグラフィー1}などのろ過方法が含まれます。現在のコンセンサスガイドラインによれば、EV分離株の特性評価には、テトラスパニンやアネキシンなどの少なくとも3つの典型的なEV表面タンパク質マーカーの証拠とイメージングモダリティ¹の組み合わせを含める必要があります。EVカーゴをタンパク質レベルで調べるには、ウェスタンブロットやELISAなどの抗体ベースの方法が最も頻繁に利用されます。

循環中の EV の単離と処理に関連する方法論上の課題を考慮すると、このプロトコルは、患者の募集とサンプル収集から、その後の血漿 EV 分離株の EV 単離、特性評価、および定量化までの包括的な経路を示します。さらに、この研究では、ドイツ南西部の三次医療センターの救急科(胸痛ユニット)に来院した患者から血漿由来 EV を即時に分離し、その後、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用して疾患特異的血漿 EV プロテオームをラベルフリーで分析するワークフローを示しています。その目的は、さまざまな虚血性、先天性、または(自己)免疫性心血管疾患の患者の大規模なコホート全体で、初期診断時および疾患の進行および/または解消を通じて、差別化された濃縮EV結合タンパク質を同定するためのハイスループット分析を促進することです。このプロテオミクススクリーニングアプローチは、心血管疾患の現在の診断と治療モニタリングを強化するための新しいEV結合タンパク質バイオマーカーを明らかにすることを最終的な目標として、異なる疾患経路に関連するEV特異的タンパク質濃縮のパターンを特定することを目指しています。

Protocol

このプロトコルでは、明らかなまたは基礎のある心血管疾患の徴候がない3人の健康な対照患者と、非ST上昇型心筋梗塞(NSTEMI)の2人の患者を含む模範的な患者コホートが募集されました。ハイデルベルク大学医学部の治験審査委員会によって事前承認が与えられました (IRB 承認 #S-351/2015)、募集前にすべての患者から書面による同意が得られました。患者は、最初の臨床症状、病歴、および診断テストの結果に基づいて、ハイデルベルク大学病院の心臓病科の胸痛ユニットから募集されました。

健常対照患者の選択基準には、非定型または非特異的な臨床症状、心臓バイオマーカーレベルが正常範囲内であること、心血管疾患の既往歴がないこと、およびさらなる診断検査で正常所見が認められることが含まれていました。除外基準には、過去5年以内の悪性腫瘍または細胞増殖抑制療法の病歴、血液透析、家族性高脂血症症候群、および心血管疾患の病歴が含まれていました。NSTEMIは現在のガイドライン¹²に従って診断され、冠動脈造影によって血行力学に関連する冠動脈狭窄が確認されました。各患者について、肘前静脈から標準的な瀉血¹³を介してクエン酸補充収集チューブに最大36 mLの血液を採取し、血液サンプルを直ちに4°Cで輸送してさらなる処理を行いました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、資料表に記載されています。

1. 示差遠心分離法によるEVの分離

注:ヒト血漿サンプルからEVを単離するために、示差遠心分離プロトコルが採用されました。遠心力を増加させながら2回の超遠心分離(UC)サイクルを行い、得られたEVペレットの純度を最大化しました。

1. プラズマ分離
   1. 血漿EVの完全性を確保するために、採取から120分以内に4°Cで冷却した全血サンプルの処理を開始します。凝固を防ぐために、クエン酸を補給した採血管(0.106 mol / Lクエン酸塩)を使用してください。.
   2. 9 mLのクエン酸全血を氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1に希釈して粘度を下げます。5 mLの密度勾配培地(1.077 g/mL)を添加して、遠心分離中に分離します。
   3. 600 g×gで4°Cで 25〜30分間遠心分離します。 各カラムの上部から血漿画分を慎重にピペットで取り出し、専用の遠心分離チューブに入れます。次の手順に進むか、-80°Cで凍結します。
2. 細胞残骸とアポトーシス体の除去
   1. 固定角ローター付きの超遠心分離機を使用して、ブレーキをかけずに、20,000 × g で4°Cで15分間プラズマを遠心分離します。細胞の破片とアポトーシス体の目に見えるペレットがチューブの底に形成されるはずです。
3. EVアイソレーション
   1. 上清を新しいチューブに移します。ブレーキをかけずに、100,000 g× gで4°Cで2時間超遠心分離し、EVを分離すると、チューブ壁に見えるペレットが形成されます。
   2. 電動ピペットを使用して上清を慎重にピペットで取り除き、約1 mLのEV枯渇血漿を残します。残りの血漿を1000 μLピペットに切り替え、EVペレットの邪魔にならないようにゆっくりとピペッティングします。ピペッティング中にチューブを徐々に傾けて、チューブ内に血漿が残らないようにします。
4. 下流分析の準備
   1. 下流の分析要件に従って、単離されたEVペレットを再懸濁します:ナノ粒子追跡のために、全血9mLのEVペレットを200μLのPBSに再懸濁します。LC-MS/MS の場合、全血 36 mL から単離した EV を 1% プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を含む 1x RIPA バッファー 50 μL に再懸濁します。
   2. 再懸濁したEVペレットを1.5〜2mLのチューブに移します。さらなる分析まで-80°Cで保存するか、必要に応じて続行してください。

2. ナノ粒子トラッキング解析

注:ヒト血漿サンプルの平均EVサイズ分布の定量化は、ナノ粒子のブラウン運動を分析するレーザーベースの検出法であるナノ粒子追跡分析(NTA)を使用して行われました。

1. NTAの作業希釈
   1. EVストック溶液(EVペレットを200μLのPBSに再懸濁)を氷冷PBSで1:10、1:50、1:100、1:200の比率で希釈します。ナノ粒子追跡中にフレームあたり10〜100ナノ粒子の最終数を達成するための最適な希釈を決定するために、さまざまな作業希釈を作成します。
2. NTA の実行
   1. NTA機器の電源を入れ、接続されたコンピューターで該当するソフトウェアを起動します。チャンバーをレーザーケース内に置き、 スタートカメラ をクリックしてアクティブにします。
   2. PBS1mLをシリンジに引き込みます。シリンジをフロントチューブに差し込み、チューブシステムを完全に洗い流して、チャンバー内に空気が残らないようにします。カメラを監視して、気泡や汚染粒子を検出します。
   3. 調製したEV作業希釈液を1mLシリンジで引き上げ、チャンバーに注入します。
   4. [キャプチャ]タブと[処理]タブでモニターの明るさに一致するように[スクリーンゲイン]を調整します。カメラレベルを変更して、画面上のナノ粒子を明確に区別します。
   5. [プロセス]タブで適切な[検出しきい値]を設定して、パーティクルをバックグラウンドノイズから区別するための感度を調整します。この値は、同じ実験内のすべての測定値で一定に保ちます。
   6. 装置の両側にあるホイールを使用して、ナノ粒子が画面上に鮮明に表示されるまでカメラの焦点を合わせます。
   7. ハードウェア設定のすべての測定で一定の温度(理想的には22°C)を設定します。これは、ブラウン運動が温度に依存するためです。
   8. 「Run」ボタンをクリックして測定を開始します。ポップアップウィンドウにサンプルIDと溶媒を入力します。
   9. サンプルランごとに最低3つの30秒ビデオを録画します。測定の合間にサンプルを進めて、ナノ粒子溶液の代表的なサンプルを捕捉します。シリンジポンプがある場合は、一定の速度でセットし、連続して録音してください。
   10. 記録後、ソフトウェアはナノ粒子の濃度とサイズ分布を自動的に計算します。 「Change 」をクリックしてサンプルに使用した希釈係数を入力し、「 Export」をクリックして結果を保存します。
3. データ分析
   1. 統計ソフトウェアプログラムの出力ファイルを使用して結果を分析します。

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を用いたEVプロテオームのラベルフリー分析(英語)

手記： ラベルフリーのEVプロテオーム解析は、膜溶解後のEVタンパク質のゲル電気泳動による初期タンパク質分離を用いて実施しました。トリプシンによるゲル内タンパク質消化後、ペプチドをLC-MS/MSを用いて分析し、個々のスペクトルをヒトプロテオームデータベースと照合しました。特に、EVライセートのノンターゲット解析が必要な場合は、特定の分子量範囲を事前に選択せずにショットガンプロテオミクスを使用することが推奨され、このプロトコルのステップ3.1.1-3.1.7は不要になります。

1. ゲル内トリプシン消化
   1. 1x RIPAバッファーに再懸濁したEVの溶液を調製するには、製造元の指示に従ってLaemmli loadingバッファーを添加します( 材料の表を参照)。サンプルを95°Cで5分間煮沸します。
   2. ローディングバッファーを添加したEVサンプルを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用の4%-12% Bis-Trisゲルにタンパク質ラダーとともにロードします¹⁴。ゲルをCoomassie Blueで1〜4時間染色し、タンパク質バンドを視覚化します。一晩インキュベートして、ゲルを水で汚れ取ります。
   3. 目的のタンパク質を含むゲル領域から、メスの刃を使用して、クマシー染色されたバンドを取り出します。
   4. ゲル片を60 μLの1:1 (v/v) 50 mM 重曹トリエチルアンモニウム緩衝液 (TEAB) とアセトニトリル (ACN) (pH 8.5) で10分間洗浄します。ゲル片をACN60 μL中で各10分間3回収縮させます。60 μL 50 mM TEAB(pH 8.5)で再度洗浄してください。
   5. 100 mM の TEAB 中 100 mM の TEAB で 57 °C で 30 分間タンパク質を還元し、ゲル片を脱水します。
   6. 100 mMのTEAB中の10 mMヨードアセトアミド(IAA)でタンパク質をアルキル化し、25°Cで20分間暗所で行ってください。
   7. ゲル片を60 μLの100 mM TEABで洗浄し、60 μLのACNでそれぞれ10分間2回収縮させます。
   8. 50 mMのTEABトリプシン溶液を、それに応じて濃縮して乾燥ゲル片に加えます。37°Cで4時間インキュベートします。 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を20μL加えて反応をクエンチします。
   9. 得られたペプチドを、1:1 (v/v) 0.1% TFAおよびACNの30 μLと30分間インキュベートして抽出します。ゲルを20 μLのACNで20分間脱水し、再度30 μLの100 mM TEABで20分間洗浄します。
   10. ゲルを20 μLのACNで2回、それぞれ20分間収縮させます。
   11. 各抽出ステップで採取した上清を真空遠心分離機に濃縮し、サンプルを0.1% TFAの15 μLに溶解します。
2. LC-MS/MS分析
   1. 静電イオントラップ分析装置と組み合わせた高分解能液体クロマトグラフィー質量分析計を使用して、ナノフローLC-MS/MS分析を行います。
   2. 溶媒Aとして0.1%ギ酸(FA)/1%ACN、溶媒Bとして0.1%FA/89.9%ACNを使用してください。
   3. 25分間の線形グラジエントでペプチドを分離します:3%溶媒Bから開始し、Bを21分で23%に増やし、次に4分で38%に増やし、95%Bでウォッシュアウトを進めます。
   4. 質量分析計をデータ依存取得モードで操作し、MSとMS2を自動的に交互に切り替えます。m/z 400 で 60,000 の分解能で MS スペクトル (m/z 400-1600) を取得し、正規化された衝突エネルギー 27 と 1.4 m/z の分離幅を使用して、最大 15 の前駆体の MS2 スペクトルを生成します。
3. タンパク質データベース検索
   1. Proteome Discoverer 2.5 と Sequest HT を使用して、Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, June 2020) タンパク質データベースおよびカスタマイズされた汚染物質データベース (MaxQuant, MPI Martinsried^15,16 の一部) に対して MS/MS スペクトルを検索します。
   2. フラグメントイオンの質量許容誤差を0.02Daに、親イオンの質量許容誤差を5ppmに設定します。消化に使用される酵素としてトリプシンを指定し、システインの固定修飾としてカルバミドメチルを設定し、酸化(メチオニン)と脱アミド化(アスパラギン、グルタミン)を可変修飾として設定します。アセチル化、メチオニン損失、およびそれらの組み合わせをタンパク質末端の可変修飾として含めます。
   3. タンパク質存在量計算¹⁷にTop N Average(n = 3)法を採用し、プリカーサーイオン定量モードを使用してペプチドを定量します。

Results

EVは、確立された鑑別超遠心分離プロトコルを使用して、明白な心血管疾患のない患者の血漿サンプル(n = 3)および非ST上昇型心筋梗塞(NSTEMI;n = 2)の患者から単離されました。血漿EVの適切な分離は、同じ患者のEV枯渇血漿と比較して、EV分離株中のEVが豊富なタンパク質TSG-101、アネキシン5(Anx5)、およびCD9の免疫ブロッティングによって確認されました(図1A)。ネガティブコントロールとして機能するトランスフェリンは、EV枯渇血清サンプルで検出されましたが、EV分離株では検出されず、コンパートメントの適切な分離が確認されました。分離された血漿サンプル中の一般的な血小板マーカーであるインテグリンβ3とリポタンパク質汚染のマーカーであるアポリポタンパク質A1(ApoA1)のイムノブロッティングでは、血液処理後に有意な汚染は示されませんでした(補足図1)。

ナノ粒子追跡分析を使用して、EVを同定し、ブラウン運動に基づいて視覚化しました(

Discussion

このプロトコールは、血漿EVの分離と特性評価のための実世界での段階的なすぐに使用できる方法論を提供するとともに、日常的な臨床診療への統合に適した非標識プロテオーム分析の紹介を提供します。得られた結果の再現性を確保するためには、プラズマサンプルからのEV単離の詳細な説明と統一された方法論への厳格な遵守が重要です。現在の文献では、分析前の条件がEV分離株のその後の測定および下流の分析に大きな影響を与える可能性があることが示されています。したがって、血漿由来のEV単離プロセスを適時に開始することが重要であり、理想的には採血後120分以内に開始し、最小限の攪拌でサンプルを処理することが重要である¹⁸。採取した血液の短期保存は4°Cで達成できます。しかし、時間と攪拌に加えて、低温も血小板の活性化を促進し、血小板由来のEVの放出につながる可能性があります^19,20。これらのEVは、全体的なEV収量の豊富な構成要素を構成...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli サンプルバフファー	Bio-rad	1610747
10x RIPA-Buffer		Abcam ab156034
26.3 mL ポリカーボネートボトル キャップアセンブリ付き 超遠心分離用	ベックマン・コールター	355654
5810R 卓上遠心分離機	エッペンドルフ	5811000015
アセトニトリル (ACN)	Biosolve	0001204101BS
ジチオスレイトール (DTT)	Sigma-Aldrich	43816-10ML
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
ギ酸 99% ULC/MS 100	Biosolve	0006914143BS
Histopaque - 1077	Sigma-Aldrich	10771
ヨードアセトアミド (IAA)	Sigma-Aldrich	I6125-5G
質量分析計 Orbitrap Q Exactive HF	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS ランニングバッファー	Thermo Fisher	B0001
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Nanosight NTA 3.2ソフトウェア	Malvern Panalytical
NuPAGE 4 bis 12 %, Bis-Tris protein gels	Invitrogen	NP0323
Optima XPN-80 床置き型超遠心分離機	Beckman Coulter	521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26619
Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Cell Signaling Technology	5872S
Protein marker	サーモフィッシャー	26616
Proteome Discoverer 2.5	サーモフィッシャーQ
Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	IQLAAEGAAPFALGMBDK
クイックステイン クーマッシー	セルバ	35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & マイクロ;m 1 g	Dr. Maisch	r119.aq.0001
SDS-PAGE 市販ゲル	サーモフィッシャー	NW00100BOX
S-モノベット Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%	Sarstedt	02.1067.001
Speed vac concentrator	Savant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, June 2020) タンパク質データベース	UniProt	https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液 (TEAB)	Sigma-Aldrich	T7408
トリフルオロ酢酸 (TFA)HPLC用 >99%、100 mL	Sigma-Aldrich	302031-100ML
トリプシン MSグレード	サーモフィッシャー	90058
タイプ 50.2 Ti 固定角ローター	ベックマン・コールター	337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ULTIM3000RSLCNANO
ウォーター	バイオソルブ	0023214102BS