中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

Anthony Nelligan; Huzefa Dungrawala

doi:10.3791/67110

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方法論記事

中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

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DOI:

10.3791/67110

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2024年8月23日

Anthony Nelligan¹ , Huzefa Dungrawala¹

¹Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

この記事について

サマリー

このプロトコルは、DNA複製中に発生するDNA損傷の程度を調査するように設計されています。中立条件下では、DNA切断の誘導を短時間で容易に評価できます。さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプやさまざまな複製ストレス試薬にも適応可能です。

要約

DNA複製は、DNAを損傷する可能性のあるさまざまな内因性および外因性のストレッサーによって常に挑戦されています。ゲノム重複中に遭遇するこのような病変は、レプリソームを失速させ、複製フォークを二本鎖切断に変換する可能性があります。修復せずに放置すると、これらの有毒なDNA切断が染色体再配列を引き起こし、ゲノムの不安定性を高め、細胞形質転換の可能性を高める可能性があります。さらに、がん細胞は持続的な複製ストレスを示すため、腫瘍細胞の複製フォークの脆弱性を標的とすることは、化学療法の魅力的な戦略となっています。複製中のDNA切断を研究するための非常に汎用性が高く強力な手法は、コメットアッセイです。このゲル電気泳動技術は、シングルセルレベルでのDNA切断の誘導と修復を確実に検出します。ここでは、研究者が複数の細胞タイプにわたるフォークストール剤を使用してヒト細胞を有糸分裂する際のDNA損傷の程度を測定できるようにするプロトコルが概説されています。これを自動コメットスコアリングと組み合わせることで、迅速な分析が容易になり、DNA切断の誘導研究の信頼性が向上します。

概要

コメットアッセイは、シングルセルレベルでDNA切断を検出するために使用されるゲル電気泳動法です。これは、オープンエンドのDNA切断が電気泳動条件下で移動する一方で、無傷のDNAはほとんど静止したままであるという原理に依存しています。壊れたDNAが移動するのは、切断がスーパーコイル状のDNAの弛緩をもたらし、電気泳動チャンバー内のアノードに向かって徐々に空間的に再配置するためであり、その結果、免疫蛍光法によって観察される彗星のような外観になります^1,2。次に、DNA損傷の程度は、コンパクトなDNAに対して移動した壊れたDNAの量を定量化することによって測定されます。

最も一般的に使用される2つのコメットアッセイ法は、アルカリコメット(AC)アッセイとニュートラルコメット(NC)アッセイです。ACアッセイは高アルカリ性pH溶液を使用して変性条件下で実施され、NCアッセイは中性pHの溶液で実施されます。NCアッセイとACアッセイはどちらも、核内で発生するDNA切断を確実に検出できます。しかし、アルカリ性バージョンは、アルカリに不安定なサイト³の検出にも有利である。どちらのアッセイ形式でも、電気泳動の前にDNAにタンパク質が含まれていないことを確認するために溶解条件を使用する必要があります。