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方法論記事

単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

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DOI:

10.3791/67146

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2025年3月7日

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1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

この記事について

サマリー

この研究では、呼吸測定および酵素アッセイを介してミトコンドリア機能に対する生体異物の影響を研究するための方法論を紹介します。さまざまな種における電子伝達鎖の調節を調べ、昆虫ベクター媒介性疾患に対する標的生物農薬開発に関する洞察を提供します。

要約

ミトコンドリアは、電子伝達系(ETC)を介したエネルギー生産に重要な役割を果たすため、細胞の原動力と呼ばれることがよくあります。しかし、その重要性はエネルギー生産をはるかに超えています。ミトコンドリアの生体エネルギー学の調節不全は、健康と細胞機能に影響を与える細胞内カスケードを引き起こす可能性があります。その生理学的重要性を考えると、新しい治療法やバイオ製品を開発するために、ミトコンドリア機能の薬理学的可能性を探求することへの関心が高まっています。ミトコンドリアの生体エネルギー学を調節することで、神経変性疾患、代謝性疾患、がんなどの課題に対処するための革新的なアプローチを提供するだけでなく、害虫やベクター媒介性疾患を制御するためのバイオ製品を開発することもできます。

この研究は、複合体Iのグルタミン酸とNADH、複合体IIのコハク酸、複合体IIIとIVのシトクロムc(酸化および還元の両方)を含むさまざまな基質を使用して、電子伝達鎖(ETC)に対する生体異物の影響を評価する方法を提示します。この方法論により、ミトコンドリア複合体を介した電子輸送の活性化または阻害を、呼吸計と分光光度計を使用して評価することができます。ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリア、断片化された細胞、またはさまざまな種からの均質化された組織から供給できます。

研究室では、 ネッタイシマカ ラットとウィスターラットでミトコンドリア機能が解析されていますが、この方法は 、Rhipicephalus microplus や Rhodnius prolixusなどの他の種にも適用できます。このアプローチは、アンカプラータンパク質の存在と、その固有のエネルギー要求によって影響を受ける種特異的な酸化性基質の選好について理論化するための基礎を提供します。最近の知見は、ミトコンドリアの機能を標的とする革新的な生物殺虫剤設計戦略に関する貴重な洞察を提供し、ベクター媒介性疾患や害虫の蔓延を効果的に制御するための大きな可能性を秘めています。

概要

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化プロセス中の化学エネルギー生成により、常に細胞の発電所と呼ばれてきました1,2。ミトコンドリアは、その主要な中核代謝機能以外にも、細胞内のCa2+調節レベル、炎症過程、活性酸素種の産生から細胞死誘導過程に至るまで、他の多くの細胞過程にも関与しています3。ミトコンドリアの生体エネルギー学とその調節不全は、細胞機能と全体的な健康に影響を与える細胞内プロセスに関連しています。これにより、革新的な治療法と安全なバイオ製品を開発するために、ミトコンドリア機能を標的とする医薬品の可能性を研究することへの関心が高まっています4,5,6。さらに、ミトコンドリアプロセスの複雑な相互作用とそれらが細胞機能に与える影響を理解することは、標的療法を開発し、ベクター媒介性疾患や害虫の蔓延を制御するためのバイオ製品を設計する機会を提供するために重要です7,8。

電子伝達鎖の特定の構成要素を生体異物で標的とすることは、生物農薬生成のためのミトコンドリア機能を調節する戦略として浮上しています。ナノ粒子ベースのミトコンドリア標的農薬など、農薬製剤に含まれる天然化合物および合成化合物は、 S. frugiperda9のミトコンドリア電位とATP合成を減少させることにより、ミトコンドリア機能に影響を与えることが示されています。

さらに、ほとんどのカルバメートおよびピレスロイドベースの製品は、蚊の複合体I阻害剤として報告されています。しかし、それらの長期にわたる曝露により、ハマダラカにピレスロイド耐性の個体群がいくつか発生し、多くの場合、これらの基質を代謝する可能性のあるP450のレベルの上昇に関連しています10,11。同様に、植物とそのエッセンシャルオイル、抽出物、および二次代謝産物は、さまざまな昆虫の段階で広範囲の死亡率を持つ潜在的な殺虫剤として文書化されています12,13。これらの天然化合物の殺虫活性は、細胞死プロセスを引き起こす可能性のある活性酸素種の産生、ミトコンドリア電位ΔΨm、およびATP合成を調節することにより、ミトコンドリア呼吸鎖の特定の点における電子輸送阻害に関連している可能性があります6,8。

農薬製剤の供給源としての天然化合物と、そのミトコンドリアへの影響は、新しく安全な生物農薬の設計において重要な役割を果たしています。これに関連して、この論文では、ミトコンドリア複合体を介した電子輸送を活性化または阻害する生体異物の能力を特定する方法論について説明します。この包括的なアプローチにより、呼吸測定法と分光光度法の両方を使用して、さまざまな基質を使用して、ミトコンドリア機能に対する生体異物の影響を正確に測定できます。この方法論は、 ネッタイシマカを含む主要なベクター種のミトコンドリア機能の解析に適用され、アンカップリングタンパク質の存在と、各種に特異的な酸化可能な基質の選好性を理論化することにつながっています。

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プロトコル

この議定書に記載されているすべての方法は、サンタンデール工業大学の科学研究倫理委員会である倫理委員会「Comité de ética en investigación científica CEINCI」によって承認されています。さらに、これらのアッセイは、コロンビアの動物研究を規制する1989年のコロンビア法律84(第IV章第23-26条)および決議8430(1993年、タイトルIV、第83-93条)に準拠し、Arriveガイドラインに準拠していました。

注:このプロトコールを開始する前に、生化学の本の酸化的リン酸化の章を読むことを強くお勧めします。

1. 試薬と溶液

  1. ラット肝臓のミトコンドリアを単離するには、250 mLのミトコンドリア単離バッファー(250 mM D-マンニトール、10 mM HEPES pH 7.2、および1 mM EGTA)を調製します。50 mLのアイソレーションバッファー(これをBSAなしのアイソレーションバッファーと呼びます)を取り出し、残りの200 mLに0.2 gのBSAを加えます(これはBSA付きのアイソレーションバッファーと呼ばれます)。
  2. ネッタイシマカの幼虫を均質化するには、100 mLの緩衝液を調製します:250 mMスクロース、10 mM HEPES、1 mM EGTA pH 7.2。
  3. 反応緩衝液を調製します:80 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、50 μM EDTA。
  4. 以下に説明するように、pH 7.2で酵素活性に使用する試薬のストックを調製します:25 mM NADH(各アッセイ用に新たに調製)、2 Mコハク酸ナトリウム、4 mMシトクロムc(各アッセイ用に新たに調製)、200 μMロテノン、0.5 mM KCN、6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)、100 mMフェナジンメトスルフェート(PMS)、および60 mMフェリシアン化カリウム。
    注:すべての実験と試薬の調製には、25°Cで18.2MΩ・cmの抵抗率を持つ超純水を使用しました。この水はMilli-Q精製システムを使用して生成され、有機物、無機物、微生物の汚染物質を検出可能な限界を下回るレベルまで確実に除去するため、高感度の生化学的および分子生物学のアプリケーションに適しています。

2. ラット肝臓からの肝臓解剖、均質化、ミトコンドリアの単離

  1. 開始する前に、すべての材料とバッファーを氷上に置いて、ミトコンドリアの損傷を避けるために、アッセイ全体を通してすべての材料が氷のように冷えていることを確認してください。
  2. 10 mLのミトコンドリア分離バッファーを氷冷した円錐チューブに入れます。
  3. 頚部斬首によって雄のWistarラットを安楽死させ、呼吸アッセイを妨げる可能性のあるCO2 の使用を避けます。このため、サンタンデール工業大学(CEINCI)の科学研究における倫理委員会は、2022年の決議13で方法を承認しました。
    注:ラットの体重は170g以下でなければなりません。脂肪は呼吸分析にも影響を与える可能性があります。
  4. 腹部のラット部分に滅菌メスで切開(約4〜5 cm)します。
  5. 腹部が見えたら、肝臓を完全に解剖します。ラットの肝臓は多葉性の器官で、暗赤色は約10 cm x 5 cmです。
  6. 肝臓を氷冷分離バッファー内に慎重に入れ、この培地で2回すすぎます。
  7. 肝臓(1cm未満)を鋭利なハサミで細かく刻み、10mLの分離培地を入れたシャーレに入れます。
  8. 溶液をPotter Elvehjem組織ホモジナイザーチューブに入れ、少なくとも10倍、低速(~390rpm)で慎重に均質化します。
  9. 溶液をコニカルチューブに移し、600 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  10. 遠心分離後、上清を新しい円錐形のチューブに慎重に注ぎます。組織の一部、血液、および無傷の細胞成分を含むペレットを廃棄します。
  11. チューブにさらにアイソレーションバッファー(~35 mL)を充填し、6000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
  12. 遠心分離後、上清を捨て、ペレット(ミトコンドリア)をBSAを含まない新しい分離バッファーに慎重に再懸濁します。
    注:ミトコンドリアの再懸濁には、柔らかいブラシを使用することをお勧めします。
  13. 次に、7000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、単離したミトコンドリアをBSAを含まない2 mLの単離バッファーに再懸濁します。
  14. ブラッドフォード法または同様の方法を使用してタンパク質濃度を決定します14。

3. ネッタイシマカ のコロニーと幼虫の均質化。

注:この手順では、 Ae. aegypti のコロニーを、湿度(70%±×5%)、日長(12:12)、温度(27±5°C)などの昆虫条件下で、繁殖ケージ(40cm40cm×40cm)内に保管しました。卵は濾紙に集められました。

  1. 実験の1週間前に、卵がろ過水と脱塩素水を入れたトレイで孵化していることを確認してください。幼虫周期の脱皮プロセスによってインスターを特定します。各脱皮過程を観察し、L1、L2、L3の状態を確認します。幼虫がL3に入ったら、材料を収集するために最大12時間待ちます。
  2. Instar L3-L4 で少なくとも 100 匹の Ae. aegypti 幼虫を塩素を含まない水 (~30 mL の水) に集めます。パスツールピペットで幼虫を取ります。
  3. 濾紙を使用して幼虫をろ過し、収集した幼虫をすすぎ、 ネッタイシマカ ホモジナイゼーションバッファー(~2mL)に再懸濁します。
  4. 幼虫の入った溶液をPotter Elvehjem組織ホモジナイザーチューブに移し、~390 rpmで少なくとも10回慎重に均質化します。
  5. 均質化された組織を移し、グラスウールシリンジでろ過して、大きな外骨格残留物を除去します。
  6. ブラッドフォード法または同様の15を使用してタンパク質濃度を決定します。
    注:蚊の幼虫からミトコンドリアを分離する必要はありません。このステップで得られたタンパク質抽出物を用いて、生体異物の効果を評価することが可能です。

4. ミトコンドリア電子伝達系に対する生体異物の影響の解明

注:このプロトコルは、ホモジナイズされたラットの肝臓および昆虫組織から単離されたミトコンドリアに対するミトコンドリア生体エネルギーに対する生体異物の影響を評価するために設計されました。

アッセイは、ポーラログラフ法(NADHおよびコハク酸オキシダーゼ)と分光光度法(NADHデヒドロゲナーゼ - 複合体I、コハク酸デヒドロゲナーゼ - 複合体II、シトクロムcレダクターゼ - 複合体IIIおよびシトクロムcオキシダーゼ - 複合体IV)の2つに分けられます。

  1. ポーラログラフアッセイ:このためには、高分解能呼吸器測定を使用して、O2 消費によるNADHとコハク酸の完全な酸化を測定し、結果をNADHとコハク酸オキシダーゼとして報告します。
    1. アッセイを開始する前に、毎日装置を校正してください。この手順は、使用するオキシグラフによって異なる場合があります。製造元の指示に従ってください。
      1. Oroborosのキャリブレーションでは、実験チャンバー容積(2 mL)より0.2 mL以上高い反応媒体をチャンバーに添加し、チャンバーと注入キャピラリーを培地で満たします。
    2. 中程度添加後、スターラーのスイッチを入れてください。
    3. 酸素濃度信号が安定するまで待ってから記録してください。
    4. ゼロ酸素キャリブレーションのためには、酸素の枯渇を可能にするミトコンドリア、細胞懸濁液、パン酵母、またはジチオナイト(パン酵母を推奨)を追加し、記録します。シグナルがバックグラウンドレベル(O2kシステムでは通常± 2 pmol/mL/s)に達するまで待ちます。
    5. 反応バッファー、0.1 mg のタンパク質(ミトコンドリアまたは幼虫の均質化)、および基質(0.17 mM NADH または 10 mM コハク酸ナトリウム)をチャンバーに添加する際の酸素消費量をモニタリングすることにより、NADH およびコハク酸オキシダーゼ活性を実行します。
    6. 電子輸送タンパク質阻害剤を使用して、観察された酸素消費がミトコンドリア呼吸鎖によるものであることを確認します。一般的なものは、ロテノン1μMおよびKCN1mM16です。オキシグラフセルで、表1に従って試薬を添加します(配列は重要です)。
  2. 分光光度アッセイ
    注:ミトコンドリア複合体を通る電子輸送を評価するために、分光光度計とPMS、DCPIP、シトクロムcなどの人工電子受容体を用いて酵素アッセイを実施し、測定しました。1日1つの酵素を測定することをお勧めします。アッセイの少なくとも1日前にバッファーと試薬を調製してください。一部の化合物は感光性です。見る テーブル 2 その他の推奨事項については、こちらをご覧ください。
    1. NADHデヒドロゲナーゼ活性については、反応系には50 mMリン酸緩衝液pH 7.4、2 mM EDTA、0.1 mg/mLミトコンドリアタンパク質、1 μMロテノン、および1 mM KCNが含まれています。分光光度計セルで、 表2に従って試薬を追加します(順序は重要です)17。推奨される手順は次のとおりです。
      1. EDTAと混合したリン酸緩衝液100 mLを調製し、pHが変化しないことを再確認してください。バッファーは冷蔵庫に保管してくださいが、アッセイ中は室温(RT;約25°C)に保つことが必須です。
      2. ロテノン、KCN、NADH、およびフェリシアン化カリウムの新鮮なストック溶液を準備します(4時間まで安定)。推奨容量は 1 mL の濃縮溶液です(表の最初の列を参照)。
      3. 試験した化合物の水への溶解度が低い場合は、化合物の溶媒のみを使用して、実験計画に酵素活性の追加コントロールを含めます。
      4. まず、420 nmでフェリシアン化カリウムを減少させることにより、NADHデヒドロゲナーゼ活性をモニターします。モル吸光係数1.04 mM-1・cm-1でその濃度を計算します。分光光度計には、反応の最大活性を計算するオプションがあります。ユーザーマニュアルを確認してください。続いて、報告された活性を、酵素の比活性を得るために使用されたタンパク質の濃度で割ります。
    2. 20 mMコハク酸ナトリウムと1 mMのフェナジンメトスルフェート(PMS)と60 μM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)を人工電子受容体として添加することにより、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性を評価します。分光光度計セルで、 表3に従って試薬を追加します(順序は重要です)17。推奨事項は次のとおりです。
      1. NADHデヒドロゲナーゼに使用したものと同じバッファーを調製します。同じ条件で維持します。
      2. コハク酸、PMS、およびDCPIPの新鮮なストック溶液を準備します。推奨容量は1mLの濃縮溶液です。PMS溶液とDCPIP溶液は、アッセイの同日に調製します。
      3. 試験した化合物の水への溶解度が低い場合は、実験デザインに酵素活性の追加コントロールを含めてください。
      4. 600nmでのDCPIPの減少により、コハク酸の酸化を監視します。ビールの法則を適用して、モル吸光係数21.0 mM-1・cm-1でその濃度を計算します。続いて、報告された活性を、酵素の比活性を得るために使用されたタンパク質の濃度で割ります。
    3. 酸化性基質としてNADHまたはコハク酸を使用して、シトクロムcレダクターゼ(複合体III)活性を測定します。この酵素では、複合体I(NADHを使用)または複合体II(コハク酸を使用)からの電子輸送がユビキノンに渡され、次に複合体IIIに移り、電子がシトクロムcに渡されます。この反応に続いて、シトクロムcが還元されます。50 mM リン酸緩衝液 pH 7.4、2 mM EDTA、0.1 mg のミトコンドリアタンパク質、50 μM NADH、および 0.1 mM KCN を含む反応系を調製します。分光光度計セルで、 表4に従って試薬を追加します(順序は重要です)18。推奨事項は次のとおりです。
      1. NADHデヒドロゲナーゼに使用したものと同じバッファーを調製します。同じ条件で維持します。
      2. NADHデヒドロゲナーゼから同じNADHとKCNを使用してください。
      3. 試験した化合物の水への溶解度が低い場合は、実験デザインに酵素活性の追加コントロールを含めてください。
      4. 550 nmでのシトクロムcの還元を監視し、ビールの法則を適用して、モル吸光係数19.8 mM-1・cm-1 でその濃度を計算します。続いて、報告された活性を、酵素の比活性を得るために使用されたタンパク質の濃度で割ります。
    4. シトクロムcオキシダーゼ活性として表されるシトクロムcオキシダーゼ(複合体IV)を測定します。このためには、50 mMリン酸緩衝液、pH 7.4、2 mM EDTA、および0.1 mgのミトコンドリアタンパク質を含むシステム反応を準備します(表5)。これらの酵素アッセイでは、等モル量のシトクロムcとジチオン酸ナトリウムを混合してシトクロムcを還元し、シトクロムcを完全に低減します。
    5. 次に、得られた混合物を、移動相と同じリン酸緩衝溶液を使用して架橋デキストランゲルカラムに通します。続いて、550 nm19の分光光度計を使用して収集した画分を定量化します。推奨事項は次のとおりです。
      1. NADHデヒドロゲナーゼに使用したのと同じバッファーを使用してください。同じ条件で維持します。
      2. 試験した化合物の水への溶解度が低い場合は、酵素活性の追加制御を実験デザインに含める必要があります。
      3. 550 nmでのシトクロムc酸化をモニターし、ビールの法則を適用して、モル吸光係数19.8 mM-1・cm-1でその濃度を計算します。続いて、報告された活性を、酵素の比活性を得るために使用されたタンパク質の濃度で割ります。
        注:酸素消費量と分光光度法によって測定された酵素の比活性を計算するプロセスを示すスプレッドシートファイルは、 補足ファイル1として含まれています。

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結果

このプロトコルで得られた結果を分析する前に、ミトコンドリアの電子伝達鎖の生化学について少し覚えておくことが不可欠です。まず、NADHは、複合体Iに位置する酸化還元中心に一対の電子を供給します。そこで、複合体Iからユビキノンへ、続いて複合体IIIへ、そしてそれらをシトクロムcに供与する複合体IVへ、そして最後に酸素が最終的な電子受容体である複合体IVへ、電子の輸送が始まり、それを水に還元します。一方、コハク酸は複合体IIに電子を供給します(コハク酸デヒドロゲナーゼとも呼ばれます)。電子は複合体IIからユビキノンに移動し、そこから上記と同じ経路をたどります。ユビキノンは電子を複合体IIIに輸送し、続いて複合体IVに通過し、酸素を還元します20。

この研究で概説されているプロトコルは、ラットの肝臓および均質化された ネッタイシマカ の幼虫のミトコンドリア生体エネルギーに対する生体異物の影響の評価を容易にし、この方法論を他のさまざまな種に外挿することを可能にします。最初に、このプロトコルでは、エッセンシャルオイル(EO)や二...

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ディスカッション

高分解能O2を用いた分光光度法およびポーラログラフィー法を用いて、ミトコンドリア機能に対する生体異物の影響を調査しました。この研究では、ラット肝臓から単離されたミトコンドリアと均質化されたネッタイシマカの幼虫という2つの異なる生物学的モデルを使用して、Cymbopogon flexuosusエッセンシャルオイルとカルバクロールがNADHとコハク酸酸化、およびミトコンドリア電子伝達鎖を介した電子輸送に与える影響を具体的に評価しました。さらに、電子伝達鎖の特定の点における潜在的な電子ブロックを、DCPIPやフェリシアン化カリウムなどの人工電子受容体を用いて調べ、シトクロムcの酸化および還元を分光光度法16,19,21でモニターした。

ラットの肝臓からのミトコンドリア単離は広く使...

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開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、プロジェクト「実験室で設計され、牛のダニの侵入を防ぐために野外で検証された異種殺し剤と異動剤の製剤化」に対応する助成金番号3739に資金を提供してくれたサンタンデール産業大学の「Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE」に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,6-ジクロロフェノールインドフェノールメルク119814使用日当日に調製してください。
Bradford試薬MerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrome cMerckC2506感光性コンバーは、アルミホイルで覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。
D-マンニトールメルクM4125
EGTAメルク>E3889
エチレンジアミン四酢酸 四ナトリウム塩二水和物メルクE6511
HEPESメルクH3375
KCNメルク60178溶液中で 2 週間ウィールします。
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC マイクロプレート フォトメーターThermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k オロボロスインスツルメンツ10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
フェナジンメトスルフェート メルクP9625は使用当日に調製してください。
フェリシアン化カリウム メルク244023使用当日にご用意ください。
Potter Elvehjem組織ホモジナイザーチューブ
RotenoneMerck557368エタノールに可溶です。感光性コンバーはアルミホイルで覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。
コハク酸ナトリウムクS9637溶液では、冷凍庫に保管する必要があります。
スクロースメルクS0389
β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元二ナトリウム塩水和物メルクN8129感光性コンバーは、アルミホイルでそれを覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。
51119100メル

参考文献

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

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