方法論記事

小脳器官型培養物を用いたプルキンエ細胞のDNA損傷応答の可視化

DOI：

10.3791/67167

⸱

2024年12月27日

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小脳プルキンエ細胞(PC)は、DNA損傷応答の欠損に対して特に敏感です。DNA損傷に対するPC応答のダイナミクスを視覚的に評価するためのプロトコルが提示され、これには小脳器官型培養内のタンパク質結合ポリ(ADP-リボース)鎖の染色が含まれます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小脳プルキンエ細胞(PC)は、高い代謝率、特異的なクロマチン構造、および広範な転写活性のユニークな相互作用を示し、DNA損傷に対して特に脆弱です。これには、PCの機能不全や喪失によって引き起こされることが多い小脳変性を防ぐために、効率的なDNA損傷応答(DDR)が必要です。顕著な例は、進行性のPC枯渇と小脳の悪化を特徴とするゲノム不安定性症候群である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)です。PCのDDRメカニズムを調べることは、このような疾患におけるPCの変性につながる経路を解明するために不可欠です。しかし、 in vitro でのPCの単離と培養の複雑さは、長い間研究努力の妨げとなってきました。マウス小脳器官型(スライス)培養は、 in vivo 組織環境を密接に模倣した実行可能な代替手段を提供します。しかし、このモデルは、顕微鏡イメージングに適したDDRインジケーターに制約されています。私たちは、タンパク質結合ポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖の蛍光イメージング、迅速かつ早期のDDR指標が、遺伝毒性ストレスに応答して、これらの培養内のPCのDDRダイナミクスを効果的に明らかにすることを示し、器官型培養プロトコルを洗練しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞DNAの完全性は、DNA損傷物質、主に活性酸素種などの代謝副産物によって常に脅威にさらされており、細胞あたり毎日数万のDNA損傷を引き起こします1。ゲノムの安定性の持続的な維持は、細胞の恒常性維持に不可欠です2,3。この維持の基礎は、DNA損傷応答(DDR)であり、これは、他の多くの細胞プロセスを慎重に調整しながら、特定のDNA修復経路を開始する複雑な層状シグナル伝達ネットワークである4,5。DDRの欠損は、染色体の不安定性、進行性の組織劣化、成長または発達の障害、癌の素因、および特定のDNA損傷物質に対する感受性の増加を特徴とする「ゲノム不安定症候群」として一般的に現れます6,7,8,9。特に、神経変性はしばしば小脳萎縮を含み、多くのゲノム不安定症候群の明確な特徴である7,10,11,12。

常染色体劣性遺伝性疾患である毛細血管拡張性運動失調症(A-T)は、ゲノム不安定性障害13,14,15の十分に文書化された例です。この状態は、DNA二本鎖切断(DSB)に応答するDDRモビライザーとして主に知られている重要なプロテインキナーゼであるATMをコードする役割を担うATM(A-T、変異)遺伝子のヌル変異から生じます16,17。A-Tは、主に進行性の小脳変性を特徴とするマルチシステム障害として現れ、急性運動障害、免疫不全、性腺萎縮、癌の素因、および電離放射線に対する極端な感受性を引き起こします。A-Tを有する個体の培養細胞は、染色体の不安定性を示し、遺伝毒性物質、特にDSBを引き起こす薬剤15,18,19に対する感受性の増加を示します。重要なことに、ATMは他のDNA損傷の修復にも役割を果たしており、ゲノムの安定性を維持する上でのその広範な重要性を強調しています20,21,22。

ATMの多くの役割についての徹底的な研究にもかかわらず、A-Tにおける小脳変性につながる特定のメカニズムは活発な議論のトピックであり、このプロセスを解明するためにさまざまなモデルが提案されています23、24、25、26、27、28、29、30。私たちのモデル28 は、A-T 患者の小脳変性がプルキンエ細胞 (PC) の機能不全と最終的な喪失から始まることを示唆しています。DNA損傷が進行する中でゲノムの安定性を維持する上でATMが重要な役割を果たすことを考えると、PCはATMがないと特に脆弱です。この脆弱性は、それらの高い代謝活性、独特のクロマチン構造、および広範な転写活性の組み合わせに起因すると考えています。最終的に、PC機能の喪失、したがってそれらの変性は、遺伝子の確率的、機能的不活性化、すなわち欠陥のある転写産物を産生した結果によるものであることが示唆されている28。

研究室でのPC生物学の研究は、単離されたPCの培養における課題によって妨げられており、これらの細胞は生存と機能のために自然環境と隣接する細胞に大きく依存しており、解離した培養成長と互換性がありません。それにもかかわらず、PCは組織スライス培養において長期間生存し続けることができます。小脳器官型培養は、典型的にはげっ歯類の小脳に由来する組織切片であり、組織の構造組織を維持し、培養細胞で可能なものと同様にさまざまな実験的操作をサポートします。したがって、これらの培養物は、制御された環境内での小脳研究を可能にする 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 .具体的には、A-Tの文脈では、マウスの小脳器官型培養物は、Atm欠損PC40,41,42,43におけるDDRの探索に役立つことが証明されている。Atm欠損マウスは、おそらくヒトとマウスの小脳生理機能の違いにより、微妙な小脳表現型44,45,46,47しか示しませんが、ATMの役割はこれらの種全体で大部分保存されていると仮定されています。この概念は、Atm-/-マウスPCにおけるDNA DSBに対する欠損応答が、他のマウスおよびヒトATM/Atm欠損細胞型40,41,42,43で観察されたものと一致するという我々の観察によって支持されている。

器官型培養内のさまざまな刺激やストレスに対するPC応答の解析には、読み出しのために顕微鏡イメージングに頼る必要があるという制限があります。DDRは通常、バルク生化学的読み出しを使用して研究されますが、一般的な免疫蛍光マーカーも利用されます。たとえば、DSBの指標と考えられているリン酸化ヒストンH2AX(γH2AX)および53BP1タンパク質の核病巣の形成と分解能のダイナミクスを追跡するなど、48,49。より広範な尺度は、タンパク質上のポリ(ADP-リボース)(PAR)鎖形成の蛍光イメージングであり、特に鎖切断7,50に対する迅速かつ堅牢な早期DNA損傷応答です。我々は、小脳器官型培養におけるPAR染色のためのKomulainenら51によるプロトコールを変更した。PCの大きな核で顕著なPAR応答が観察されました。ここでは、マウスの小脳器官型培養を確立し、遺伝毒性ストレス下でのPAR応答を視覚化するための洗練されたプロトコルを示します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

材料、装置、抗体の詳細については、 Table of Materials を参照してください。動物の手順は、承認後、テルアビブ大学の倫理委員会の倫理ガイドラインに基づいて採用されました。この手順は、性別に関係なく、生後10日のマウスの子犬に対して行われます。必要に応じて、前日に尾部生検と標準的な方法を用いてジェノタイピングを行います。溶液は滅菌されており、特に明記されていない限り4°Cで保存します。 表 1 を参照してください。

1. 培養物の準備

注:無菌環境内で手順を実施し、70%エタノールを使用して事前に作業面を消毒してください。

  1. 6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのBMEを添加します。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに単一細胞培養インサートを配置し、解剖手順の前にプレートを37°C/5%CO2 インキュベーターで最低2時間インキュベートします。
  2. 生物学的フード内に解剖エリアを設置し、組織チョッパー、30 mm培養プレート、双眼顕微鏡、および光源を含めます。
  3. プロセス全体を通して、手術器具を70%エタノールに浸します。70%エタノールを充填した尿カップを浸漬し、1x PBSを充填した別の尿カップを使用してエタノールを洗い流してから使用してください。
  4. 解剖ごとに(つまり、小脳ごとに)、冷たい解剖培地で満たされた2つの30mm培養プレートを準備し、氷の上に置きます。
  5. 動物に70%エタノールをスプレーします。
  6. 鋭利なハサミを使用して、動物をすばやく斬首します。脳を露出させるには、小脳から離れたところにハサミで小さな切開を行います。端が丸いピンセットを使用して、頭蓋骨をそっと剥がします。小脳組織の損傷を避けるために、頭蓋骨を細かく取り除きます。
  7. すぐに脳を冷郭清培地に移すか、頭蓋骨内から直接小脳を取り除きます。これを行うには、小脳を露出させ、細かく湾曲した虹彩ヘラを使用して、3対の脚を切断することにより、小脳皮質を脳幹から分離します。脚を識別するには、吻側から尾側まで見ます:ペアの上小脳脚は、中脳を小脳の両側に接続します。ペアになった中小脳脚は、橋を小脳の両側に接続します。そして、ペアの下小脳脚は、小脳の両側の髄質に接続します。小脳が見えたら、同じヘラを使用して小脳から小脳から分離します:へらを小脳、上丘、および脳幹の間にスライドさせます。
    注:髄膜をスライスした後、髄膜が容易に剥がれるため、髄膜を取り除くために特別な努力をしないでください。
  8. ティッシュチョッパーをスライスの厚さ350μmに設定します。
  9. 小脳をチョッパーの基部に配置する前に、組織から余分な解剖バッファーを取り除きます。.これにより、チョッパーの基部への組織の接着性が向上します。
  10. 小脳を切断プラットフォームに垂直に置き、スライスの厚さ350μmで傍矢状スライスを行います。細い虹彩スパチュラを使用してスライスをそっと分離し、冷たい解剖培地に入れます。
  11. スライスした組織を新鮮な冷解剖バッファーに戻します。1,000 μLのチップを使用して、組織スライスを冷解剖バッファーを含むディッシュに繊細に導きます。
  12. 双眼鏡の下で、2つの湾曲した虹彩ヘラを使用して、組織スライスを互いに慎重に分離します。培養には、臓器の内側皮質核ゾーンにある小脳虫部に由来するスライスを使用します。
  13. 幅広のスパチュラを使用して各組織スライスを培養インサートに移し、組織スライスを運ぶ各インサートを、予め加温した培地を含む6ウェルプレートのウェルに移動します。プレートをインキュベーターに置いておきます。
  14. 1日おきに培地を交換してください:滅菌ガラスピペットを使用して使用済みの培地を吸引し、5 mLの血清ピペットを使用して、ピペットの先端をウェルの壁に立てかけた状態で1 mLの新鮮なMBEを追加します。媒体の流れが組織に向けられないように注意してください。
    注:組織切片は、培養の最初の5〜7日間は炎症様の外観を示し、この現象が消えるとすぐに、培養確立後最大2週間で実験の準備が整います。

2. DNA損傷剤による治療、固定、染色、顕微鏡イメージング

  1. DNAを損傷する化学物質を、適切な最終濃度で、所定の時間、培養培地に直接添加します。曝露期間後、培地を新鮮な培地と交換して化学物質を取り除きます。
  2. DDRの読み出しにPAR染色が含まれる場合は、固定の30分前に、ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ(PARG)の阻害剤を最終濃度10 μMの培地に加えます。
    注:PAR修飾は短命で、PARGによって継続的に分解されるため、この処理は重要です。
  3. 固定する直前に、培地を吸引し、室温で1 mLの0.1 Mリン酸緩衝液と交換します。
    注:コールドバッファーは、インサートから組織スライスが剥がれる原因となる可能性があります。
  4. バッファーを予冷済み(-20°C)アセトン:メタノールミックス(1:1)に交換して、組織スライスをこのミックスに沈め、-20°Cで20分間放置して、スライスを直ちに固定します。
    注:この段階で停止し、後で免疫染色を進めることは可能です。これを行うには、4°Cに予冷した0.1 Mリン酸緩衝液で組織を3倍洗浄し、組織が緩衝液に浸されていることを確認します。組織は、0.1Mリン酸緩衝液に4°Cで最大2週間保存できるようになりました。
  5. 組織スライスを48ウェルプレートのウェルに移します。
  6. メスとまな板を使用してインサートのマージンを取り除き、ティッシュスライスの周りを切り取ります。各スライスを48ウェルプレートのウェルに入れます。100 μLの0.1 Mリン酸緩衝液を添加します。
  7. 透過処理のために、バッファーを吸引し、1% Triton X-100を含む0.1 Mリン酸バッファー100 μLをウェルに添加し、室温で5分間放置します。
  8. 溶液を吸引し、ウェルあたり100 μLのブロッキング溶液( 表1を参照)を加えます。室温で2時間静かに振とうします。
  9. ブロッキングステップでは、一次抗体または抗PAR試薬をブロッキング溶液中で希釈(1:800)します。
  10. ブロッキング溶液を取り出し(洗浄不要)、各ウェルに100 μLの一次抗体ミックスを加えます。室温で2時間穏やかに振とうします。
  11. 二次抗体を0.2% Triton X-100 (1:500) を含む0.1 Mリン酸緩衝液で希釈し、光への曝露を最小限に抑えます。
  12. 一次抗体溶液を吸引し、0.2% Triton X-100を含む0.1 Mリン酸緩衝液でスライスを5分×3回、室温で穏やかに振とうしながら洗浄します。
  13. 洗浄液を100 μLの二次抗体溶液(1:500希釈)と交換します。暗所で室温で2時間穏やかに振とう続けます(プレートをアルミホイルで覆います)。
  14. DAPI溶液を調製するには、原液(2 mg/mL)を1x PBSで1 μg/mLに希釈します。
  15. 二次抗体との2時間インキュベーションが終了する20分前に、最終DAPI溶液20μLを各ウェルに加え、20分間振とう続けます。液体を吸引し、洗浄液で3 x 5分間、穏やかに振って洗浄します。
  16. 埋込みは、顕微鏡スライドガラス上に組織を上に向けて置き、封入剤を加え、カバーガラスで覆います。スライドを平らな面に置き、室温で暗所で一晩乾燥させます(ダピを含む封入剤の使用は避けてください)。
  17. スライドは4°Cで防光ボックスに保管します。
  18. 共焦点顕微鏡と適切なフィルターを使用して顕微鏡画像をキャプチャします。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図1は、小脳器官型培養の一般的な外観を示しています。 図1A の上段は培養で維持される小脳葉状化を示し、下段はカルビンジンD-28kで染色されたPC(緑)とNeuNで染色された神経核(赤)を示しています。 図1Bでは、PCのアストロサイト(赤)を、中間フィラメントIII型タンパク質であるGFAP(緑)について染色しています。 図2 および 図3 は、これらの培養物を2つのDNA損傷剤(どちらも強酸化剤)である臭素酸カリウム(最終濃度10 mM、12時間)およびパラコート)で処理した後に観察されたPAR染色を示しています。PAR応答は、対照群と比較して、小脳葉で処理されたPCでマークされました。

figure-results-1
図1:マウスの小脳器官型培養の概要 (A)上の行は、培養物で維持されている小脳の葉を示しています。一番下の行はPCレイヤーに焦点を当てています。PCはCalbindin D-28k(緑)で強調表示されています。NeuN染色(赤)は、層全体のニューロン核を同定します。(B)PCを詳しく見る(赤)。GFAP(緑)は、アストロサイトを際立たせる中間フィラメントIII型タンパク質です。スケールバー = 968.8 μm (A、上段)、42.1 μm (A、2 段目)、72.7 μm (B、上段)、18.2 μm (B、2 段目)。略語:PC = Purkinje cells;GFAP = グリア線維性酸性タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:臭素酸カリウムで処理した小脳切片のPAR染色。 小脳切片は、強力な酸化剤である臭素酸カリウム(KBrO3)で、最終濃度10 mMで12時間処理しました。スケールバー = 775 μm。略語:PAR = poly(ADP-ribose);DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:スーパーオキシドアニオンの強力な生産者であるパラコートに曝露された小脳切片におけるPAR応答。 (A)小脳葉の一般的な見方。制御器と比較して、特に PC での PAR 応答が堅牢であることに注意してください。(B)より詳細な調査では、PCや他の細胞タイプでのPAR応答が示されています。スケールバー = 193.8 μm (A)、18.2 μm (B)。略語:PAR = poly(ADP-ribose);DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ソリューションとバッファー
解決  ざいりょう
解剖媒体0.5%のD-グルコースを含むハンクの平衡塩溶液(HBSS)。0.5 mLの50%D-グルコース溶液を、Mg2+ およびCa2+を含まない50 mLのHBSSに加えます。
BME培地フェノールレッドを含み、L-グルタミンまたはHEPESを含まない100 mLのBasal Medium Eagle(BME)を、フェノールレッドを含むHBSS50 mL、熱不活化ウマ血清50 mL、50 mLの50%D-グルコース、および1 mLの200 mM L-グルタミンと混合します。.無菌環境で0.22μmフィルターで混合し、ろ過します。4°Cで保存
免疫染色用ブロッキング溶液0.1 M リン酸バッファー中:0.5% Triton X-100、10% ヤギ血清を添加してください。
二次抗体希釈バッファー0.1 M リン酸バッファー、0.2%Triton X-100
ウォッシュバッファー0.1 M リン酸バッファー、0.2%Triton X-100
固定液アクテノ:メタノール (1:1 v:v)
透過化ソリューション0.1 M リン酸バッファー、1%Triton X-100
DAPIソリューション1x PBSで1 μg/mLに希釈したストック溶液(2 mg/mL)
リン酸バッファーAとBの2つのソウルをご用意ください(下記参照)。以下に指定される比率に従って溶液を混合し、0.2 Mリン酸緩衝液を作製します。次に、0.2M溶液を重水素減少水(1:1)で希釈して、0.1Mリン酸緩衝液(作業溶液)を作ります。
溶液A(0.2 M用)12 gのリン酸ナトリウム一塩基性無水物(Na2HPO4 FW 141.96)
500 mLの重水素減少水
ソリューションB(0.2 M用)14.2 gのリン酸ナトリウム二次塩基性無水物(Na2HPO4 FW 141.96)
500 mLの重水素減少水
0.2 Mを作るための混合溶液1Lを調製します:溶液A230mLと溶液B770mL
0.1 M リン酸バッファー混合溶液を重水素減少水(1:1)で希釈します。

表1:ソリューションとその組成。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一般的なコメント
器官型培養システムの主な利点は、小脳皮質組織を使用した研究を容易にし、培養皿のセットアップでその構造組織を数週間保存することです。このシステムは、樹状突起スパインや超微細構造の特徴52,53,54,55,56,57,58,59の詳細な検査を含む、プルキンエ細胞(PC)の詳細な形態学的解析を行うのに役立ちます。私たちの観察は、DNA損傷応答(DDR)がこれらの培養内のPCで特に活性であることを示しています。しかし、このシステムの主な制限には、使用期間が限られていることや、細胞プロセスを監視するための顕微鏡イメージングへの依存などがあり、適切なイメージング技術を開発または適応する継続的な必要性が浮き彫りになっています。

注意の別の言葉は、組織スライスを準備するために解剖される小脳部分に関連しています。私たちは、異なる小脳葉が著しく異なる内部組織と全体的な品質の培養物を生み出す可能性があることを観察しました。したがって、小脳虫部の中矢状切片を介して得られたスライスから培養を確立することを好みます。これらのスライスでは、小脳皮質の葉が便利に見えます。

小脳皮質の特徴的な葉状を示す小脳虫部から得られた組織切片を利用することをお勧めします。これらのスライスは、数週間にわたって文化の中で組織構造を維持します。さらに、培養物を用いた実験手続きは、樹立後約7-12日で開始することが推奨される。これらの培養におけるDNA損傷応答を評価するために設計された典型的な実験では、放射線照射または培地へのDNA損傷化学物質の添加によって損傷を開始する必要があります。続いて、組織固定および染色が様々な時間間隔で行われる。化学的損傷からの回復を評価するために、新鮮な培地でのインキュベーション期間が含まれています。長期実験は、できるだけ早い機会、理想的には培養確立後約7日で開始することをお勧めします。

小脳器官型培養物は、抗生物質を含まない培地で維持されます。したがって、設立中に無菌環境を維持することが不可欠です。小脳が収穫される子犬の年齢は非常に重要で、推奨される範囲は9〜12日です。この年齢層は、小脳皮質が切片化のために十分に発達しているため、最適です。特に、高齢の動物では、組織がブレードに付着する傾向があります。解剖されるまで、小脳を冷たい解剖液に浸したままにしておくことが重要です。

培養の最初の5〜7日間で、組織切片は、腫脹および乳白色の変色を特徴とする炎症を連想させる徴候を示すことがある。これらの特性は、生理学的パラメータの測定や免疫染色技術の有効性に影響を与える可能性があります。

スライス中の厚さの不一致を避けるために、小脳を350μmより薄くスライスしないことを強くお勧めします。350 μmスライスの組織は、培養7日後には約90 μm(Zスタック測定に基づく)まで大幅に薄くなることに注意してください。

ここでは、PCのDDRを調査するために使用されるツールキットにPAR染色7,50を紹介します。この読み出しは迅速で感度が高く、DDRの動的な性質を捉えており、野生型およびAtm欠損PCのDDRの分析に特に役立つことが証明されています。ここで概説するプロトコルは、小脳に影響を与えるゲノム不安定性症候群を研究する研究者にとって特に有益であるはずです。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この研究に関連する利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちの研究室での研究は、ミリアム博士とシェルドンG.アデルソン医学研究財団とイスラエルAT病と戦うための協会によってサポートされています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬および機器
150 x 30 cm シャーCorning Inc.3261
35 x 10 mmシャーレコーニング社3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
接着顕微鏡スライドMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
チョッパー用ブレードTED PELLAModel TC752-1 スタイルカミソリ刃BME
GIBCO41010-026 500ml. L-Glut なし
細胞培養は、ミリポアPICM0RG50
D-グルコース生物学的インド02-015-1A
HBSS w/o フェノールレッドSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS with フェノールレッドザルトリウス02-015-1A
馬用血清 GIBCO26050088熱不活性化
虹彩鉗子CellPathGZX-0100-00A130mm 鈍い鋸歯状
虹彩ヘラF.S.T10092-12
L-グルタミン (200 mM)Gibco41010026
メタノールSigma-Aldrich322412-1L
メタノール Sigma-AldrichG5767
顕微鏡オリンパス
マウント(GRIGENE なし)。Ltd、イスラエルK239320A
パラコートグマ-アルドリッチ856177-250MGパラコート二塩化物(メチルビオロゲン)
PARG-ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ阻害剤トクリスバイオサイエンス、英国PDD 00017273光感受性 
リン酸塩緩衝液生物学的インド。02-018-1A
さみ、皮膚組織
6ウェルプレートコーニング社製CLS3516
スペアチョッピングディスク TED PELLAモデル 10180-01
ティッシュチョッパーMcIlwainモデル TC75210180-220
ピンセット、ポインテッド
ウリンナリー カップ
抗体
Alexa fluor 488 ロバ アンチ ウサギ IgG 
Invitrogen		A212061:500; 二次抗体;二次希釈バッファー; 室温で2時間のインキュベーション
抗グリア線維性酸性プロチエンミリフォアMAB34021:1500; 一次抗体; ブロッキング;ホスト:マウス
抗カルビンジン-D-28KSwant CB3001:2000; 一次抗体; ブロッキング; 宿主: ウサギ 
抗カルビンジン-D-28KスワントCB-38a1:2000; 一次抗体; ブロッキング 
抗パン-ADP-リボース試薬ミリフォアMABE10161:800; 一次抗体; ブロッキング; 室温で 2 時間インキュベーション
DAPI (4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩)細胞シグナル伝達40841:1000; 二次希釈バッファー; 室温で 20 分間インキュベーション
レ を挿入します。シ は

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

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