高次元フローサイトメトリーによる効率的な扁桃T濾胞ヘルパー細胞プロセッシングと機能解析

Summary

ここでは、扁桃腺サンプルの収集と処理、高次元スペクトルフローサイトメトリーを使用した表現型解析、および教師なし解析の実施のためのプロトコルを紹介します。

Abstract

T濾胞性ヘルパー細胞(Tfh)は、CD4⁺ Tヘルパー細胞のサブセットであり、B細胞のアイソタイプスイッチング、胚中心(GC)の形成、体細胞超変異、および親和性の成熟を助け、感染、自己免疫、およびワクチン接種中の二次リンパ組織における適応体液性免疫応答の調整を支援します。Tfh細胞の発生と機能を理解することは、効果的なワクチンを設計し、この集団が関与する疾患に対する標的治療戦略を開発するために重要です。ヒト扁桃腺細胞は、アクセス可能な粘膜リンパ器官です。これらは、Tfh細胞やGC細胞などの異なる免疫集団をプロファイリングし、細胞間相互作用を調査し、動的な細胞機能を評価し、臓器レベルでのそれらの調節メカニズムを明らかにするユニークな機会を提供します。さらに、扁桃腺細胞の in vitro 培養は処理が容易で、さまざまな条件下でのTfh細胞生物学の評価が可能です。ここでは、ヒト扁桃腺細胞の収集、単離、保存、培養のためのプロトコールを紹介します。また、Tfh細胞の詳細な特性評価のために設計された2つの最適化されたスペクトルフローサイトメトリーパネルについても説明します。最後に、ホスファターゼタンパク質2A(PP2A)阻害剤治療を例にとり、高次元フローサイトメトリーデータの教師なし解析の効率と力を実証し、高次元スケールで治療に起因する違いを効果的に明らかにします。

Introduction

濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)は、胚中心(GC)の形成と機能、およびB細胞抗体産生に不可欠なCD4⁺ヘルパーT細胞の別個のサブセットです。Tfh細胞は、抗原提示細胞との相互作用、およびT細胞受容体シグナル伝達、B細胞との共刺激相互作用、サイトカイン、ケモカインなどの内因性および外因性因子の統合を通じて、ナイーブなCD4⁺ T細胞に^{由来します1}。Tfh細胞はCXCR5とPD-1を発現し、GC内またはGC付近の位置を導きます。BCL-6は、Tfhの発生、維持、および機能^1,2に重要なマスター転写因子です。Tfh細胞は、特にワクチン反応や細菌性およびウイルス性病原体に対する防御において、体液性免疫応答を増強するために極めて重要です。異常なTfh細胞応答は、自己免疫疾患、免疫不全、および潜在的にはある^種の癌3,4,5,6を含むさまざまな障害に関与しています。したがって、それらの機能と制御を理解することは、効果的なワクチンと治療戦略を開発するために重要です⁷。

Th1、Treg、Th17などの他のCD4⁺ Tヘルパー細胞がin vitro 分化系が^{十分に確立されている}のとは対照的に8、Tfh細胞は、その発生が動的な細胞間相互作用と特殊な解剖^{学的構造7}を含むため、研究がより複雑です。したがって、Tfh細胞の研究は、主にヒト末梢循環Tfh細胞(cTfh)の ex vivo 表現型決定と in vivo マウスモデルに依存してきました。したがって、Tfh細胞上の特定の分子の制御を調べることは、特にヒトTfh細胞にとって困難です⁹。したがって、リンパ組織に由来するTfh細胞の詳細な ex vivo 研究は、ヒトTfh細胞の理解を深めるために不可欠です。

扁桃腺は、二次リンパ器官として、プレTfh(CXCR5^intPD-1^int CD4⁺)細胞やGC-Tfh(CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺)細胞など、末梢血には存在しないユニークな細胞集団を保有しており、どちらもGCの形成に役立っています。さらに、口蓋扁桃腺は、小児手術で最も一般的に除去される組織の一部であり、容易にアクセスできるため、Tfh細胞が関与する複雑な免疫メカニズムを探索するための貴重なヒト組織源となっています。扁桃腺は、呼吸器ウイルス感染の主要な部位である上気道に位置しているため、そのようなウイルス感染に対する免疫応答を調べるのに有利な組織を提供します。例えば、私たちの研究室では以前、COVID-19から回復した子供の扁桃腺とアデノイドのTfh細胞を特徴付け、これらの組織を感染していない対照の組織と比較しました¹⁰。ここでは、扁桃腺細胞の処理と保存のためのプロトコルの概要を説明します。PP2A阻害剤で処理された扁桃腺を例にとり、高次元スペクトルフローサイトメトリーを通じてこれらの細胞を特徴付け、教師なし分析を使用してデータを分析する方法について詳しく説明します。

Protocol

世界医師会の倫理規定(ヘルシンキ宣言)は、この研究のすべてのヒト研究で守られました。ヒト扁桃腺標本は、米国ワシントンDCの小児国立病院小児耳鼻咽喉科部門から提供された、睡眠呼吸障害または閉塞性睡眠時無呼吸症候群を引き起こす腺脊椎肥大の患者から採取されました。この研究は、国立小児病院の治験審査委員会(IRB)から承認を受けました(IRBプロトコル番号00009806)。インフォームド コンセントは、登録されたすべての参加者の親または保護者によって署名され、7 歳以上の未成年の参加者から同意が得られました。

1.ヒト扁桃腺の収集と単一細胞の分離と保管

1. 扁桃細胞の単離
   1. 手術検体採取
      1. 扁桃摘出術を受けている患者から扁桃腺を取得し、手術室で新鮮な組織片を手術室で収集します 25-35 mL の氷冷滅菌扁桃腺培地で満たされた 50 mL 遠心分離チューブ: RPMI 5% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、0.05 mg/mL ゲンタマイシン、10 mM グルタミン、および抗生物質 - 抗真菌剤ミックス (100 単位/mL ストレプトマイシン、100 単位/mL ペニシリン、 および0.25μg/mLのアンホテリシンB)。
         注:上記の培地中の扁桃腺は、4°Cで一晩保存し、翌日処理することができます。細胞生存率の低下は、同日処理と比較して一晩で保存した場合に認められました(図1A)。扁桃腺は、氷上で一晩で輸送することもできます。
   2. 扁桃腺の処理
      注:すべての培地、緩衝液、および手術器具は無菌でなければならず、扁桃腺細胞の分離はバイオセーフティフード内の氷上で行う必要があります。
      1. 5 mLの冷やした扁桃腺培地を含む60 mmのプラスチック細胞培養皿に扁桃腺を置きます。氷の上で作業します。滅菌ピンセットとはさみまたはメスを使用して、目に見える血栓、脂肪、結合組織を慎重に取り除きます(図1B、C)。
      2. 扁桃腺を新しい60 mm細胞培養皿に移し、5 mLの氷冷扁桃腺培地を入れます。扁桃腺片を3〜5mmの断片にスライスします。
      3. 10 mLの冷扁桃培地で新しい60 mm細胞培養ディッシュを準備し、70 μmの細胞ストレーナーをディッシュに入れます。
      4. 扁桃腺の破片をストレーナーに移動し、滅菌済みの3mLシリンジのプランジャー端を使用して扁桃腺の破片をストレーナーに通して粉砕します。
      5. ストレーナーの外側にある細胞を含む培地を皿に集め、50 mLの円錐管に移します。
      6. さらに10 mLの扁桃腺培地をストレーナー付きの皿に加え、プランジャーで扁桃腺の破片を粉砕し、培地を円錐形のチューブに集めます。大きな扁桃腺の場合は、結合組織の断片だけがストレーナに残るまで、この手順をさらに2〜3倍繰り返します。残りのティッシュと使用済みのプレートは、バイオハザードバッグに入れ、医療廃棄物に入れます。
      7. 50 mLのコニカルチューブの上部に扁桃腺培地を入れます。
      8. 400 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
         注:遠心分離を20分に延長すると、収率が向上する場合があります。
      9. 慎重に吸引またはピペッティングして上清を取り除き、ペレットを室温(RT)で5 mLのアンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解バッファーに再懸濁して赤血球を溶解します。.室温で5分間インキュベートし、その後、35 mLの冷やしたPBSを加えて、さらなる溶解を防ぎます。400 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
      10. 冷やしたPBS50mLで一度洗浄し、遠心分離します。10 mLのPBSで再懸濁し、70 μmのプラスチックストレーナーで細胞を濾過します。セルをカウントします。
2. 扁桃細胞の凍結保存
   1. 凍結媒体(90%熱不活化FBSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO))を準備します。
      注:これは4°Cで最大1か月間保存できます。
   2. 細胞懸濁液(ステップ1.1.2.10)を400 × g で4°C、5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを凍結培地で再懸濁します。
      注:細胞を10×10⁶ 〜50 × 10⁶ 細胞/ mLの凍結培地¹¹の密度で凍結することをお勧めします。
   3. 0.5〜1 mLの細胞懸濁液を滅菌クライオバイアルに分注します。バイアルを-80°Cの冷凍庫で速度制御された凍結容器に入れて凍結します。バイアルを液体窒素の入った貯蔵タンクに移し、長期保存のために1週間以内に行ってください。
3. 凍結細胞の解凍
   注:シングルセルRNAシーケンシング用のサンプル調製プロトコルから参照される逐次希釈融解アプローチを以下に概説します¹²。他の解凍方法もうまくいくかもしれませんが、このアプローチでは、細胞をすぐに温かい解凍バッファーに入れる場合と比較して、細胞の生存率が高いことがわかりました(図1D)。洗浄バッファーは事前に調製することができます。解凍バッファーは、洗浄バッファーと 0.1 mg/mL DNase I で構成されています (DNase I は解凍開始の直前に追加する必要があります)。遠心分離時間を1 min/mL(15 mLチューブの場合)に増やすことは、細胞収量を増やすためのオプションです。
   1. ウォーターバスを37°Cに温めます。 解凍液と洗浄バッファーを37°Cのウォーターバスで予温します。
      注:すべての細胞洗浄はRTで行われます。
   2. クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで2〜3分間解凍します。バイアルを水浴に完全に浸すことは避けてください。小さな氷の結晶が見えたまま、バイアルをウォーターバスから取り出します。
   3. 解凍した細胞を、バイオセーフティフードのワイドボアピペットチップを使用して、15 mLのコニカルチューブに静かに移します。0.5 mLの予熱融解緩液でクライオバイアルをすすぎ、15 mLのコニカルチューブに一滴ずつ(5秒ごとに1滴)すすぎを加え、チューブを静かに振って混合します。
   4. 15 mL のコニカルチューブで 2 mL を段階的に添加し、次に 4 mL の培地を添加し、添加間隔を ~1 分空けて細胞を順次希釈します。3〜5秒ごとに1mLの割合で培地をチューブに加え、穏やかに渦巻いて混合します。
   5. 400 × g でRTで5分間遠心分離します。
   6. 上清を取り除きます。細胞ペレットを300μLの解凍緩衝液に再懸濁します。RTで5分間インキュベートします。
   7. 10 mLの洗浄バッファー(DNase Iなし)を加えます。再度、400 × g でRTで5分間遠心分離します。
   8. もう一度洗浄する:上清を取り除き、細胞ペレットを10mLの洗浄バッファーに再懸濁します。400 × g でRTで5分間遠心分離します。
   9. 70 μmのストレーナで細胞をろ過します。RTで400 × g で再度5分間遠心分離し、細胞をカウントします。培地に再懸濁します。

2. ex vivo 処理後の細胞内サイトカインおよび転写因子の発現測定

注:ここでは、2つの高次元フローサイトメトリーパネルを使用した扁桃Tfh細胞の表現型特性評価の方法について詳しく説明します。PP2A活性が最適なBCL-6タンパク質発現とTfh分化⁴に不可欠であることを考慮すると、PP2A阻害剤カンタリジン(CAN)で処理した扁桃腺細胞の検査を通じて、Tfh細胞の維持と機能の評価を示します。

1. フローサイトメトリー染色
   1. 細胞内サイトカイン染色
      注:インキュベーションは暗闇で行われます。試薬、抗体、および両方のパネルで使用されるウェルあたりのそれぞれの量は、 材料表に記載されています。T細胞の脱顆粒を評価するために、抗CD107a抗体を治療ステップ中に添加して、その内部化によって引き起こされる偽陰性の結果を最小限に抑える¹³。
      1. プレート 2 × 10⁶ 扁桃腺細胞と 200 μL の培養培地 (1 × 10⁷ 細胞/mL) を 96 ウェル U プレート ウェルに入れ、次の量の PP2A 阻害剤 CAN を 16 時間使用しました: ビヒクル制御、3 μM、および 6 μM。
         注:CANは1% DMSOで0.1 Mで再構成しました。
      2. モネンシン(0.7 μL/mL)、ブレフェルジン(1:1,000)、ミリスチン酸ホルボール酢酸(50 ng/mL、PMA)、イオノマイシン(1,000 ng/mL)、および2 μL抗CD107aを各ウェルに2.5時間、5% CO₂ インキュベーター(37 ^°C)で2.5時間加えます。総培養量はウェルあたり200 μLです。
      3. 抗体を染色する抗体を~16,000 × g で4°Cで3〜5分間遠心分離し、抗体凝集体を除去します。ステップ 2.1.1.8 では、ケモカイン受容体、Brilliant Stain Buffer Plus、および FACS バッファーを除くすべての表面抗体を含む表面抗体ミックスを調製します (各容量は 材料表に記載されており、反応ごとに合計 112 μL の混合物)。
      4. 培養で2.5時間完了した後、400 × g で4°Cで2分間遠心分離することにより、200 μLの氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。 洗浄の合間に、プレートをすばやく反転させて上清を捨てます。同じプレートで染色を行います。
      5. 1:800希釈したLIVE/DEAD Blue色素をPBS中で15分間、RTで100 μL/ウェルで細胞をインキュベートし、200 μLのFACSバッファーで2回洗浄します。
      6. True Stain Monocyte Blocker (5 μL Monocyte Blocker + 45 μL FACS buffer per well) を使用して、RTで5分間細胞を再懸濁します。
      7. ケモカイン受容体抗体を染色反応に直接順次添加します(まず、抗CXCR3および抗CCR7をそれぞれ10分間、次に抗CXCR5および抗CCR6を混合し、10 μLのBrilliant Stain Buffer Plusを室温で5分間投与します)。添加するたびに、数回ピペッティングしてよく混ぜます。抗体の量については、 材料の表 を参照してください。
      8. ステップ 2.1.1.3 で調製した表面抗体ミックスを染色反応液に直接加え、室温で 30 分間インキュベートします。反応あたりの染色量の合計は 180 μL です: バッファー中の 50 μL 単球ブロッカー (ステップ 2.1.1.6 を参照) + 18 μL の抗ケモカイン受容体抗体 (ステップ 2.1.1.7 を参照) + 112 μL の表面抗体ミックス (ステップ 2.1.1.3 を参照)。
      9. 200μLの冷たいFACSバッファーで2回洗浄します。
      10. 細胞を再懸濁し、80 μL/ウェルのパラホルムアルデヒドベースの固定バッファーと室温で20分間インキュベートします。
      11. 160 μLの1x透過化バッファーを、すでに固定バッファーが含まれている各ウェルに加えます。プレートを400 × g で室温で2分間遠心分離し、200 μLの透過化バッファーで1回洗浄します。
      12. 抗サイトカイン抗体、Brilliant Stain Buffer Plus、および透過化バッファーを含む細胞内サイトカイン(ICS)抗体ミックスを調製します(総容量50 μL/well、 材料表)。この細胞内サイトカイン抗体ミックスと細胞を室温で30分間インキュベートします。
      13. 200 μL/well透過化バッファーで2回洗浄します。200 μL/ウェルのFACSバッファーで再懸濁します。
      14. 染色した細胞を暗所で4°Cで保存し、24時間以内にスペクトルフローサイトメーターでデータを取得して、染色強度の損失を最小限に抑えます¹⁴。
   2. 核転写因子染色
      1. ステップ2.1.1.1のようにCANで細胞を培養します(細胞を刺激せずに)。
      2. 抗ヒトCD40抗体(0.5 μg/mL)を培地に加え、細胞で15分間培養してから染色を開始してください。細胞が刺激された場合は、活性化^15,16時のCD40Lの内在化を防ぐために、刺激開始の15分前にこの抗体を添加する。
      3. 染色用抗体を遠心分離し、ステップ2.1.1.3と同様の表面抗体混合物を調製します: 材料表の表面抗体、10 μL/ウェルのBrilliant Stain Buffer Plus、および54.1 μL/ウェルのFACSバッファー。
         注:ウェルあたりの総染色量は180μLです:バッファー中の単球ブロッカー50μL+ケモカイン受容体抗体13μL+表面抗体ミックス117μL。
      4. 細胞を洗浄し、ステップ2.1.1.5-2.1.1.8のようにLIVE/DEAD Blue染色と表面染色および洗浄を行います。
         注:抗CXCR3抗体はこのパネルに含まれていません。
      5. FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Setの核転写因子固定バッファー80 μLで細胞を固定します。室温で30分間インキュベートします。
      6. ステップ2.1.1.11のように、細胞を透過化バッファーで洗浄します。
      7. 材料表に記載されている抗転写因子抗体、10 μLのBrilliant Stain Buffer Plus、16 μLの透過化バッファー(総容量40 μL/ウェル)を含む細胞内転写因子(TF)抗体ミックスを調製します。この混合物を用いて細胞を4°Cで1時間インキュベートします。
      8. ステップ2.1.1.13-2.1.1.14のように、スペクトルサイトメーターで洗浄して取得します。

3. 高次元フローサイトメトリーデータの教師なし解析

注:解析に使用したソフトウェア、パッケージ、およびそれらのバージョンは、 資料表に記載されています。ステップ 3.2 から 3.4 までの画面キャプチャは 、補足ファイル 1 にあります。ステップ 3.5 から 3.7 までの模範的なスクリプトは Supplemental File 2 と Supplemental File 3 に、ステップ 3.8 から 3.9 は Supplemental File 4 と Supplemental File 5 にあります。スクリプトの ICS raw ファイルと TF raw ファイルは、それぞれ 補足ファイル 6 と 補足ファイル 7 で提供されます。

1. 図 1Eに示すように、「.fcs」ファイルが保存されているフローサイトメトリー解析ソフトウェアのワークスペースを開き、ゲーティングを完了します。
2. ターゲットノード(この場合はCD4⁺ T細胞)を右クリックします。[ Select Equivalent Nodes] を選択します。
3. ターゲットノードを再度右クリックします。 [母集団のエクスポート/連結] を選択します。
4. [Populations: Export or Concatenate] ウィンドウが開くのを待ち、CSV チャネル値を選択して、エクスポートされたファイルの宛先を選択します。「イベントを含める」ボックスにすべてのセルを含め、「パラメーター」ボックスで「補正されたすべてのパラメーター」を選択します。[詳細オプション] を展開し、プレフィックスを入力してファイルの名前を変更し、[エクスポート] をクリックしてファイルを宛先フォルダーにエクスポートします (サンプルごとに 1 つの.csvファイルをエクスポートします)。
5. エクスポートされた「*.csv」ファイルをRで読み取ります(サンプルごとに1つずつ)。各セルにサンプル ID を割り当て、すべてのサンプルのセルを 1 つのデータ フレームに結合します。
6. メタデータ (サンプルに関する追加情報) をデータ フレームに追加またはマージします。
7. 次の分析のために、サンプルごとに同数の細胞をランダムにダウンサンプリングします。この手順はオプションです。
   注:この例では、各条件の合計CD4⁺ T細胞から8,000個のCD4⁺ T細胞がダウンサンプリングされ、これはCD4⁺ T細胞の総数の少なくとも1/7に相当します。
8. Seuratオブジェクトの作成:Seuratオブジェクトを作成する際に、抗体マーカーの チャネル値を 遺伝子発現レベルとして解釈します。
   1. ステップ3.6で生成されたデータフレームを使用してSeuratオブジェクトを作成します。 NormalizeData ステップをスキップして、「データ」アッセイとして直接保存します。
   2. フロー パネルからサーフェス マーカーを選択して、教師なしクラスタリングの VariableFeatures として使用します。
   3. ScaleData、RunPCA、FindNeighbors、FindClusters、RunUMAP を Seurat から導入された標準パイプラインとして実行します (ただし、NormalizeData ステップ¹⁷ を除く)。
   4. [FindClusters] ステップの解像度パラメーターを調整してクラスターの数を変更し、基になる生物学的コンテキストをより正確に反映するようにします。
9. Seuratパッケージと互換性のある DimPlot や FeaturePlot などの視覚化ツールを使用します。グループごとに複数のサンプルを含むグループを比較するには、被験者ごとに各クラスターの割合を計算し、統計的な比較を実行します。その後、より高度な統計分析のために数理モデルを使用します¹⁰。

Results

全体的な細胞生存率を比較するために、扁桃腺を3つの類似した部分に切断し、(1)即日処理、(2)4°Cでの一晩保存、および(3)氷上での一晩保存の3つの条件下でプロトコルを使用して処理しました。これら3つの条件の実行可能性は、有意な差なしに非常に類似していました(図1A)。また、解凍プロセスが細胞の生存率に与える影響も評価しました。私たちが使用した滴下融解法は、同じドナーからの凍結扁桃腺サンプルを融解した後の直接培地融解法と比較して、細胞生存率が有意に高かった(図1D)。次に、回収した凍結扁桃細胞を32色の細胞内サイトカインパネルと28色の転写因子パネルを使用して染色し、スペクトルフローサイトメトリーによるTfh細胞の詳細な特性評価を可能にしました。この染色により、両方のパネルからのフローサイトメトリーデータに教師なし解析をさらに適用することができました(図1E)。

フローサイトメトリーデータからの細胞内サ...

Discussion

新鮮な扁桃腺は手術後3時間以内に処理する必要があるという以前の報告¹⁹とは対照的に、新鮮な扁桃腺サンプルは、4°Cで保存し、24時間以内に処理すると生存能力を維持できることがわかりました。液体窒素貯蔵から解凍した扁桃腺組織からの細胞生存率を最適化するために、高い細胞生存率が高く評価されるシングルセルシーケンシングで推奨されるドロップワイズ解凍法を採用しました¹²。このアプローチにより、一般的に使用される直接の迅速な解凍法と比較して、生細胞の回収を最適化することができました(図1D)。手術によって生じた破片や焼灼組織を取り除くと、生存可能な扁桃腺細胞の収量が向上します。扁桃腺処理中の遠心分離時間を延長すると、細胞収量がさらに向上します。しかし、処理が長引くと、特に複数のサンプルを同時に扱う場合、細胞全体の生存率が損なわれる可能性があります。

当社の酵素消化フリー扁...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
機械および機器
3 mL プラスチックシリンジ	BD	309657
96 ウェル U ボトムプレート	Thermo Scientific	163320
1.2 mL 極低温バイアル	Corning	430487
セルストレーナー 70 & micro;m ナイロン	ファルコン	352350
細胞培養皿 (60 mm)	VWR	10062-890
遠心分離機	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
ベンチマーク B2000-2 MyBath 2L デジタル ウォーター バス	ベンチマーク	B2000-2
ファイン ハサミ - シャープ	FST	14060-11
プラスチック製器具ケース	FST	20830-05
スペクトルフローサイトメーター、オーロラ	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
標準パターン鉗子	FST	11000-13
標準パターン鉗子	FST	11000-20
Vi-cell Blu 細胞生存率アナライザー	Beckman Coulter	C19201
試薬
0.5 M EDTA pH 8.0	Quality Biology	351-027-101
2-メルカプトエタノール	Gibco	21985-023
ACK 溶解バッファー	Gibco	A10492-01
抗生物質と抗真菌剤の混合物 (ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン B 懸濁液、100x)	Gibco	15240-062
ブリリアント染色バッファープラス (RUO)	BD	566385
カンタリジン	シグマ	C7632-25MG
サイトフィックス固定バッファー	BD	554655
ジメチルスルホキシド (DMSO)	シグマ	D8418-250ml
DNAase I	ロシュ	10104159001
胎児ウシ血清 (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/転写因子染色バッファーセット	eBioscience	00-5523-00
ゲンタマイシン (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
ゴルジプラグ	BD	555029
ゴルジストップ	BD	554724
HEPES (1 M)	ギブコ	15630-080
イオノマイシン	シグマ	I0634-1mg
L-グルタミン (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
パラホルムアルデヒド 16% 溶液、EM グレード (PFA)	電子顕微鏡  Science	15710	PBS で希釈
PBS、pH 7.4	Gibco	10010072
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)	Sigma	P8139-1mg
レート制御凍結容器	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-グルタミン)	Gibco	11875-085
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)	Gibco	11360-070
True-Stain 単球遮断薬	BioLegend	426103
Buffers
培地			10% 熱不活化 FBS (VWR)、 2 nM グルタミン、 0.055 mM 2-メルカプトエタノール、 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、 1 mM ピルビン酸ナトリウム、 10 mM HEPES、 RPMI 中の 1% 非必須アミノ酸 (+L-グルタミン)
FACS バッファー			PBS 中 2 mM EDTA および 2% 熱不活化 FBS
培地			90% 熱不活化 FBS および 10% DMSO
解凍バッファー			洗浄バッファー + 0.1 mg/mL DNaseI
扁桃腺培地			RPMI に 5% 熱不活化 FBS、 10 mM グルタミン、 0.05 mg/mL ゲンタマイシン、 1% 抗生物質と抗真菌剤の混合物   を添加。(ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンB)。
10% 熱不活化FBSおよび10 mM HEPES	洗浄バッファ
);
ビオチン抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体	BioLegend	328604	2 &200 &mu の L;ウェルあたりのL完全培地。 この抗体は、PMA/イオノマイシン刺激中に細胞とともに添加されました。
Live Dead染色	100 &ウェルあたりのLミックス
			1 : 800, 0.125 & ミュー;100 & ミューの L;L PBS per well.
単球ブロック	50 μウェルあたりのLミックス
			L True Stain 単球遮断薬および 45 &L ウェルあたりのFACSバッファー
サイトカインパネルの表面抗体
モカイン受容体ミックス			μL/ウェル
抗ヒト CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗ヒト CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗ヒト CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
抗ヒト CXCR5-BV750	BD	747111	1
ブリリアント染色バッファープラス (RUO)	BD	566385	10
	18 & ミュー;ケモカイン受容体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックバッファー
その他の表面抗体混合物			μL/ウェル
抗ヒト CD103-BUV661	BD	749993	2.5
抗ヒト CD14-スパーク ブルー 550	バイオレジェンド	367148	2.5
抗ヒト CD19-スパーク NIR 685	バイオレジェンド	302270	2.5
抗ヒト CD25-BB515	BD	564467	10
抗ヒト CD27- スーパーブライト 436	サーモ	62-0279-42	5
抗ヒト CD3-BV510	バイオレジェンド	344828	2.5
抗ヒト CD38 APC-Fire810	バイオレジェンド	303550	1
抗ヒト CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
抗ヒト CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗ヒト CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗ヒト CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
抗ヒト CD69-BUV563	BD	748764	1
抗ヒト CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗ヒト FAS-BB700	BD	566542	0.6
抗ヒト HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗ヒト PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗ヒト CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS バッファー			61
			112 & ムー;他の表面抗体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックバッファーに直接添加します(50&μ;L)およびケモカイン受容体ミックス(18μL、50 + 18 + 112 = 180 &ミュー;ウェルあたりの合計 L)
サイトカインパネルの細胞内サイトカイン抗体			μL/ウェル
抗ヒトグランザイム B-PE	BD		561142 1
抗ヒト IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
抗ヒト IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
抗ヒト IL2-BV650	BioLegend	500334	3
抗ヒト IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
抗ヒト IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
抗ヒト パーフォリン-APC	BioLegend	353312	2.5
抗ヒト TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
抗 IFN&ガンマ;-パシフィック ブルー	BioLegend		502522 1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
ブリリアント ステイン バッファー プラス (RUO)	BD	566385	10
1x 透過処理バッファー&nBSP;	eバイオサイエンス	00-5523-00	19.15
	(50 & ミュー;L mix per well)
Antibodies & Other regents for transcription factor panel
CD40抗体、抗ヒト	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 & mu;作業濃度の培地のg / mL
Live Dead染色	100 & mu;ウェルあたりのLミックス
			1 : 800, 0.125 & ミュー;100 & ミューの L;L PBS per well.
単球遮断薬バッファー	BioLegend	426103	5 & mu;L True Stain 単球遮断薬および 45 &L ウェルあたりのFACSバッファー
転写因子パネルの表面抗体
ケモカイン受容体混合物			μL/ウェル
抗ヒト CCR6-BV711	BioLegend		353436 1
抗ヒト CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗ヒト CXCR5-BV750	BD	747111	1
ブリリアント染色バッファープラス (RUO)	BD	566385	10
	13 & ムー;ウェルあたりのLミックス
			L/ウェル
抗ヒト 4-1BB-PE-CY7	BioLegend		309818 2.5
抗ヒト CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
抗ヒト CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗ヒト CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
抗ヒト CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
抗ヒトCD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗ヒトCD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗ヒトCD4-パシフィックブルー	バイオレジェンド	317423	1
抗ヒトCD40L-PE	BD		15
抗ヒトCD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗ヒトCD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗ヒト CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
抗ヒト CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗ヒト HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗ヒト ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
抗ヒト OX40-APC	BioLegend	350008	5
抗ヒト PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗ヒト CD45-PerCP	サーモ	MHCD4531	1.2
ブリリアント ステイン バッファー プラス (RUO)	BD	566385	10
FACS バッファー			54.1
			117  &ミュー;他の表面抗体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックに直接追加 バッファー (50 &L)およびケモカイン受容体ミックス(13 & mu;L、50 + 13 + 117 = 180 &ミュー;ウェルあたりの合計L)
転写因子パネルの転写因子抗体	μL/ウェル
抗ヒト T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
抗ヒト Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
抗ヒト FoxP3-Alexa Fluor 488	BD		560887 1.6
抗ヒト GATA3-BB700	BD	566642	2
抗ヒト Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
抗ヒトRorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
ブリリアント染色バッファープラス (RUO)	BD	566385	10
1 x 透過処理バッファー	eBioscience	00-5523-00	16
			40 & ミュー;ウェルごとのLミックス
教師なし分析用のソフトウェアとパッケージ
	/Software/package	Version	Source
1	data.表	1.16.2	The Comprehensive R Archive Network
2	FlowJO	10.9.0	Becton,Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	The Comprehensive R Archive Network
4	R	4.3.2	The Comprehensive R Archive Network
5	readxl	1.4.3	The Comprehensive R Archive Network
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	The Comprehensive R Archive Network
8	SeuratData	0.2.2.9001	包括的な R アーカイブ ネットワーク
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	包括的な R アーカイブ ネットワーク
11	viridis	0.6.5	包括的な R アーカイブ ネットワーク