ここでは、扁桃腺サンプルの収集と処理、高次元スペクトルフローサイトメトリーを使用した表現型解析、および教師なし解析の実施のためのプロトコルを紹介します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
ここでは、扁桃腺サンプルの収集と処理、高次元スペクトルフローサイトメトリーを使用した表現型解析、および教師なし解析の実施のためのプロトコルを紹介します。
T濾胞性ヘルパー細胞(Tfh)は、CD4+ Tヘルパー細胞のサブセットであり、B細胞のアイソタイプスイッチング、胚中心(GC)の形成、体細胞超変異、および親和性の成熟を助け、感染、自己免疫、およびワクチン接種中の二次リンパ組織における適応体液性免疫応答の調整を支援します。Tfh細胞の発生と機能を理解することは、効果的なワクチンを設計し、この集団が関与する疾患に対する標的治療戦略を開発するために重要です。ヒト扁桃腺細胞は、アクセス可能な粘膜リンパ器官です。これらは、Tfh細胞やGC細胞などの異なる免疫集団をプロファイリングし、細胞間相互作用を調査し、動的な細胞機能を評価し、臓器レベルでのそれらの調節メカニズムを明らかにするユニークな機会を提供します。さらに、扁桃腺細胞の in vitro 培養は処理が容易で、さまざまな条件下でのTfh細胞生物学の評価が可能です。ここでは、ヒト扁桃腺細胞の収集、単離、保存、培養のためのプロトコールを紹介します。また、Tfh細胞の詳細な特性評価のために設計された2つの最適化されたスペクトルフローサイトメトリーパネルについても説明します。最後に、ホスファターゼタンパク質2A(PP2A)阻害剤治療を例にとり、高次元フローサイトメトリーデータの教師なし解析の効率と力を実証し、高次元スケールで治療に起因する違いを効果的に明らかにします。
濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)は、胚中心(GC)の形成と機能、およびB細胞抗体産生に不可欠なCD4+ヘルパーT細胞の別個のサブセットです。Tfh細胞は、抗原提示細胞との相互作用、およびT細胞受容体シグナル伝達、B細胞との共刺激相互作用、サイトカイン、ケモカインなどの内因性および外因性因子の統合を通じて、ナイーブなCD4+ T細胞に由来します1。Tfh細胞はCXCR5とPD-1を発現し、GC内またはGC付近の位置を導きます。BCL-6は、Tfhの発生、維持、および機能1,2に重要なマスター転写因子です。Tfh細胞は、特にワクチン反応や細菌性およびウイルス性病原体に対する防御において、体液性免疫応答を増強するために極めて重要です。異常なTfh細胞応答は、自己免疫疾患、免疫不全、および潜在的にはある種の癌3,4,5,6を含むさまざまな障害に関与しています。したがって、それらの機能と制御を理解することは、効果的な....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
世界医師会の倫理規定(ヘルシンキ宣言)は、この研究のすべてのヒト研究で守られました。ヒト扁桃腺標本は、米国ワシントンDCの小児国立病院小児耳鼻咽喉科部門から提供された、睡眠呼吸障害または閉塞性睡眠時無呼吸症候群を引き起こす腺脊椎肥大の患者から採取されました。この研究は、国立小児病院の治験審査委員会(IRB)から承認を受けました(IRBプロトコル番号00009806)。インフォームド コンセントは、登録されたすべての参加者の親または保護者によって署名され、7 歳以上の未成年の参加者から同意が得られました。
1.ヒト扁桃腺の収集と単一細胞の分離と保管
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
全体的な細胞生存率を比較するために、扁桃腺を3つの類似した部分に切断し、(1)即日処理、(2)4°Cでの一晩保存、および(3)氷上での一晩保存の3つの条件下でプロトコルを使用して処理しました。これら3つの条件の実行可能性は、有意な差なしに非常に類似していました(図1A)。また、解凍プロセスが細胞の生存率に与える影響も評価しました。私たちが使用した滴下融解法は、同じドナーからの凍結扁桃腺サンプルを融解した後の直接培地融解法と比較して、細胞生存率が有意に高かった(図1D)。次に、回収した凍結扁桃細胞を32色の細胞内サイトカインパネルと28色の転写因子パネルを使用して染色し、スペクトルフローサイトメトリーによるTfh細胞の詳細な特性評価を可能にしました。この染色により、両方のパネルからのフローサイトメトリーデータに教師なし解析をさらに適用することができました(図1E)。
フローサイトメトリーデータからの細胞内サ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
新鮮な扁桃腺は手術後3時間以内に処理する必要があるという以前の報告19とは対照的に、新鮮な扁桃腺サンプルは、4°Cで保存し、24時間以内に処理すると生存能力を維持できることがわかりました。液体窒素貯蔵から解凍した扁桃腺組織からの細胞生存率を最適化するために、高い細胞生存率が高く評価されるシングルセルシーケンシングで推奨されるドロップワイズ解凍法を採用しました12。このアプローチにより、一般的に使用される直接の迅速な解凍法と比較して、生細胞の回収を最適化することができました(図1D)。手術によって生じた破片や焼灼組織を取り除くと、生存可能な扁桃腺細胞の収量が向上します。扁桃腺処理中の遠心分離時間を延長すると、細胞収量がさらに向上します。しかし、処理が長引くと、特に複数のサンプルを同時に扱う場合、細胞全体の生存率が損なわれる可能性があります。
当社の酵素消化フリー扁.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者には、開示すべき利益相反はありません。
この研究は、NIAIDの学内研究部門、NIHによって支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機械および機器 | |||
| 3 mL プラスチックシリンジ | BD | 309657 | |
| 96 ウェル U ボトムプレート | Thermo Scientific | 163320 | |
| 1.2 mL 極低温バイアル | Corning | 430487 | |
| セルストレーナー 70 & micro;m ナイロン | ファルコン | 352350 | |
| 細胞培養皿 (60 mm) | VWR | 10062-890 | |
| 遠心分離機 | Thermo Scientific | Sorvall Legend XTR | |
| ベンチマーク B2000-2 MyBath 2L デジタル ウォーター バス | ベンチマーク | B2000-2 | |
| ファイン ハサミ - シャープ | FST | 14060-11 | |
| プラスチック製器具ケース | FST | 20830-05 | |
| スペクトルフローサイトメーター、オーロラ | Cytek | 5L 16UV-16V-14B-10YG-8R | |
| 標準パターン鉗子 | FST | 11000-13 | |
| 標準パターン鉗子 | FST | 11000-20 | |
| Vi-cell Blu 細胞生存率アナライザー | Beckman Coulter | C19201 | |
| 試薬 | |||
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality Biology | 351-027-101 | |
| 2-メルカプトエタノール | Gibco | 21985-023 | |
| ACK 溶解バッファー | Gibco | A10492-01 | |
| 抗生物質と抗真菌剤の混合物 (ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン B 懸濁液、100x) | Gibco | 15240-062 | |
| ブリリアント染色バッファープラス (RUO) | BD | 566385 | |
| カンタリジン | シグマ | C7632-25MG | |
| サイトフィックス固定バッファー | BD | 554655 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | シグマ | D8418-250ml | |
| DNAase I | ロシュ | 10104159001 | |
| 胎児ウシ血清 (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FoxP3/転写因子染色バッファーセット | eBioscience | 00-5523-00 | |
| ゲンタマイシン (50 mg/mL) | Gibco | 15750-060 | |
| ゴルジプラグ | BD | 555029 | |
| ゴルジストップ | BD | 554724 | |
| HEPES (1 M) | ギブコ | 15630-080 | |
| イオノマイシン | シグマ | I0634-1mg | |
| L-グルタミン (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| パラホルムアルデヒド 16% 溶液、EM グレード (PFA) | 電子顕微鏡 Science | 15710 | PBS で希釈 |
| PBS、pH 7.4 | Gibco | 10010072 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) | Sigma | P8139-1mg | |
| レート制御凍結容器 | Millipore | Corning CoolCell FTS30 | |
| RPMI (+L-グルタミン) | Gibco | 11875-085 | |
| ピルビン酸ナトリウム (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| True-Stain 単球遮断薬 | BioLegend | 426103 | |
| Buffers | |||
| 培地 | 10% 熱不活化 FBS (VWR)、 2 nM グルタミン、 0.055 mM 2-メルカプトエタノール、 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、 1 mM ピルビン酸ナトリウム、 10 mM HEPES、 RPMI 中の 1% 非必須アミノ酸 (+L-グルタミン) | ||
| FACS バッファー | PBS 中 2 mM EDTA および 2% 熱不活化 FBS | ||
| 培地 | 90% 熱不活化 FBS および 10% DMSO | ||
| 解凍バッファー | 洗浄バッファー + 0.1 mg/mL DNaseI | ||
| 扁桃腺培地 | RPMI に 5% 熱不活化 FBS、 10 mM グルタミン、 0.05 mg/mL ゲンタマイシン、 1% 抗生物質と抗真菌剤の混合物 を添加。(ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンB)。 | ||
| 10% 熱不活化FBSおよび10 mM HEPES | 洗浄バッファ | ||
| ); | |||
| ビオチン抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体 | BioLegend | 328604 | 2 &200 &mu の L;ウェルあたりのL完全培地。 この抗体は、PMA/イオノマイシン刺激中に細胞とともに添加されました。 |
| Live Dead染色 | 100 &ウェルあたりのLミックス | ||
| 1 : 800, 0.125 & ミュー;100 & ミューの L;L PBS per well. | |||
| 単球ブロック | 50 μウェルあたりのLミックス | ||
| L True Stain 単球遮断薬および 45 &L ウェルあたりのFACSバッファー | |||
| サイトカインパネルの表面抗体 | |||
| モカイン受容体ミックス | μL/ウェル | ||
| 抗ヒト CCR6-BV711 | BioLegend | 353436 | 1 |
| 抗ヒト CCR7-BV421 | BioLegend | 353208 | 1 |
| 抗ヒト CXCR3-PE-Cy5 | BD | 551128 | 5 |
| 抗ヒト CXCR5-BV750 | BD | 747111 | 1 |
| ブリリアント染色バッファープラス (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 18 & ミュー;ケモカイン受容体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックバッファー | |||
| その他の表面抗体混合物 | μL/ウェル | ||
| 抗ヒト CD103-BUV661 | BD | 749993 | 2.5 |
| 抗ヒト CD14-スパーク ブルー 550 | バイオレジェンド | 367148 | 2.5 |
| 抗ヒト CD19-スパーク NIR 685 | バイオレジェンド | 302270 | 2.5 |
| 抗ヒト CD25-BB515 | BD | 564467 | 10 |
| 抗ヒト CD27- スーパーブライト 436 | サーモ | 62-0279-42 | 5 |
| 抗ヒト CD3-BV510 | バイオレジェンド | 344828 | 2.5 |
| 抗ヒト CD38 APC-Fire810 | バイオレジェンド | 303550 | 1 |
| 抗ヒト CD4 CF YG584 | Cytek | R7-20041 | 2.5 |
| 抗ヒト CD45RA-BUV395 | BD | 740315 | 0.6 |
| 抗ヒト CD56-BUV737 | BD | 612766 | 3.5 |
| 抗ヒト CD57-FITC | BioLegend | 359604 | 1.2 |
| 抗ヒト CD69-BUV563 | BD | 748764 | 1 |
| 抗ヒト CD8-BUV805 | BD | 612889 | 1.2 |
| 抗ヒト FAS-BB700 | BD | 566542 | 0.6 |
| 抗ヒト HLA-DR APC-Fire 750 | BioLegend | 307658 | 2 |
| 抗ヒト PD1-BV785 | BioLegend | 329929 | 1.2 |
| 抗ヒト CD45-PerCP | Thermo | MHCD4531 | 1.2 |
| Brilliant Stain Buffer Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| FACS バッファー | 61 | ||
| 112 & ムー;他の表面抗体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックバッファーに直接添加します(50&μ;L)およびケモカイン受容体ミックス(18μL、50 + 18 + 112 = 180 &ミュー;ウェルあたりの合計 L) | |||
| サイトカインパネルの細胞内サイトカイン抗体 | μL/ウェル | ||
| 抗ヒトグランザイム B-PE | BD | 561142 1 | |
| 抗ヒト IL10-PE-Dazzle 594 | BioLegend | 506812 | 1 |
| 抗ヒト IL17A-BV605 | BioLegend | 512326 | 1 |
| 抗ヒト IL2-BV650 | BioLegend | 500334 | 3 |
| 抗ヒト IL21- Alexa Fluor 647 | BD | 560493 | 10 |
| 抗ヒト IL4-PerCP Cy5.5 | BD | 561234 | 1 |
| 抗ヒト パーフォリン-APC | BioLegend | 353312 | 2.5 |
| 抗ヒト TNFa-PE-Cy7 | BioLegend | 502930 | 0.1 |
| 抗 IFN&ガンマ;-パシフィック ブルー | BioLegend | 502522 1 | |
| SAv-BUV615 | BD | 613013 | 0.25 |
| ブリリアント ステイン バッファー プラス (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 1x 透過処理バッファー&nBSP; | eバイオサイエンス | 00-5523-00 | 19.15 |
| (50 & ミュー;L mix per well) | |||
| Antibodies & Other regents for transcription factor panel | |||
| CD40抗体、抗ヒト | Miltenyi Biotec | 130-094-133 | 0.5 & mu;作業濃度の培地のg / mL |
| Live Dead染色 | 100 & mu;ウェルあたりのLミックス | ||
| 1 : 800, 0.125 & ミュー;100 & ミューの L;L PBS per well. | |||
| 単球遮断薬バッファー | BioLegend | 426103 | 5 & mu;L True Stain 単球遮断薬および 45 &L ウェルあたりのFACSバッファー |
| 転写因子パネルの表面抗体 | |||
| ケモカイン受容体混合物 | μL/ウェル | ||
| 抗ヒト CCR6-BV711 | BioLegend | 353436 1 | |
| 抗ヒト CCR7-BV421 | BioLegend | 353208 | 1 |
| 抗ヒト CXCR5-BV750 | BD | 747111 | 1 |
| ブリリアント染色バッファープラス (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 13 & ムー;ウェルあたりのLミックス | |||
| L/ウェル | |||
| 抗ヒト 4-1BB-PE-CY7 | BioLegend | 309818 2.5 | |
| 抗ヒト CD14-Spark Blue 550 | BioLegend | 367148 | 2.5 |
| 抗ヒト CD19-Spark NIR 685 | BioLegend | 302270 | 2.5 |
| 抗ヒト CD200-PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher | 46-9200-42 | 2.5 |
| 抗ヒト CD25-PE-Cy5 | BioLegend | 302608 | 5 |
| 抗ヒトCD3-BV510 | BioLegend | 344828 | 2.5 |
| 抗ヒトCD38-APC-Fire810 | BioLegend | 303550 | 1 |
| 抗ヒトCD4-パシフィックブルー | バイオレジェンド | 317423 | 1 |
| 抗ヒトCD40L-PE | BD | 15 | |
| 抗ヒトCD45RA-BUV395 | BD | 740315 | 0.6 |
| 抗ヒトCD56-BUV737 | BD | 612766 | 3.5 |
| 抗ヒト CD69-BUV650 | BioLegend | 310934 | 2.5 |
| 抗ヒト CD8-BUV805 | BD | 612889 | 1.2 |
| 抗ヒト HLA-DR APC-Fire 750 | BioLegend | 307658 | 2 |
| 抗ヒト ICOS-BUV563 | BD | 741421 | 1.2 |
| 抗ヒト OX40-APC | BioLegend | 350008 | 5 |
| 抗ヒト PD1-BV785 | BioLegend | 329929 | 1.2 |
| 抗ヒト CD45-PerCP | サーモ | MHCD4531 | 1.2 |
| ブリリアント ステイン バッファー プラス (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| FACS バッファー | 54.1 | ||
| 117 &ミュー;他の表面抗体のウェルあたりのLミックス。 単球ブロックに直接追加 バッファー (50 &L)およびケモカイン受容体ミックス(13 & mu;L、50 + 13 + 117 = 180 &ミュー;ウェルあたりの合計L) | |||
| 転写因子パネルの転写因子抗体 | μL/ウェル | ||
| 抗ヒト T-bet-BV605 | BioLegend | 644817 | 4 |
| 抗ヒト Bcl6-PE-CF594 | BD | 562401 | 4 |
| 抗ヒト FoxP3-Alexa Fluor 488 | BD | 560887 1.6 | |
| 抗ヒト GATA3-BB700 | BD | 566642 | 2 |
| 抗ヒト Ki67-Alexa Fluor 700 | BD | 561277 | 0.4 |
| 抗ヒトRorgt-Alexa Fluor 647 | BD | 563620 | 2 |
| ブリリアント染色バッファープラス (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 1 x 透過処理バッファー | eBioscience | 00-5523-00 | 16 |
| 40 & ミュー;ウェルごとのLミックス | |||
| 教師なし分析用のソフトウェアとパッケージ | |||
| /Software/package | Version | Source | |
| 1 | data.表 | 1.16.2 | The Comprehensive R Archive Network |
| 2 | FlowJO | 10.9.0 | Becton,Dickinson and Company |
| 3 | pheatmap | 1.0.12 | The Comprehensive R Archive Network |
| 4 | R | 4.3.2 | The Comprehensive R Archive Network |
| 5 | readxl | 1.4.3 | The Comprehensive R Archive Network |
| 6 | Rstudio | 2023.12.1+402 | Posit PBC |
| 7 | Seurat | 5.1.0 | The Comprehensive R Archive Network |
| 8 | SeuratData | 0.2.2.9001 | 包括的な R アーカイブ ネットワーク |
| 9 | SpectroFlo | 3.0 | Cytek |
| 10 | tidyverse | 2.0.0 | 包括的な R アーカイブ ネットワーク |
| 11 | viridis | 0.6.5 | 包括的な R アーカイブ ネットワーク |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
この記事は公開されました
動画は近日公開