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方法論記事

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

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DOI:

10.3791/67200

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2025年1月3日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

この記事について

サマリー

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、がん治療の様相を変え、これまで不治の病であった血液がんの記録的な寛解率をもたらしました。これらの成功により、免疫応答の調節と阻害を主に担うCD4+ T細胞の小さいながらも重要なサブセットである制御性T細胞(Treg)にCARプラットフォームを適応させることへの関心が高まっています。制御性T細胞の免疫抑制活性を任意の細胞外標的にリダイレクトする能力は、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、および移植片対宿主病の細胞療法の作成に多大な影響を及ぼします。ここでは、ヒト末梢血からの 真正な 制御性制御性制御細胞の単離、アデノ随伴ウイルスを介した相同指向性修復(HDR)テンプレート送達を使用したレンチウイルスまたはCRISPR/Cas9支援ノックインを利用したヒト制御性制御細胞の遺伝子改変、および安定したヒトCAR制御細胞の ex vivo 拡大のための方法論について詳しく説明します。最後に、ヒトCAR Tregの表現型の安定性と in vitro 抑制機能の評価について説明し、ヒトCAR Tregが前臨床および臨床応用でどのように振る舞うかについての洞察を提供します。

概要

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療に革命をもたらし、これまで治療できなかったがんにおいて非常に高い寛解率を達成しました1,2。CAR-T細胞を用いた膠芽腫3,4,5の治療に用いた初期の結果は、CAR技術の汎用性と、幅広い悪性腫瘍を標的とする将来の可能性を浮き彫りにしています。この分野でCARのさらなる応用が検討されるにつれて、制御性T細胞(Treg)が有望な細胞タイプとして浮上しています。制御性T細胞は、免疫恒常性を維持し、IL-2の隔離、免疫抑制性サイトカインの分泌、抗原提示細胞の調節など、いくつかのメカニズムを通じて免疫応答を調節する上で重要な役割を果たします6,7。

CAR技術により、制御性T細胞は、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギーや喘息などの炎症性疾患の治療に活用することができます6,8,9。CAR-Tregsは、免疫系全体を阻害し、有害な副作用と関連している免疫抑制薬の使用を減らすことにより、患者の転帰と生活の質の大幅な改善につながる可能性があります10,11。前臨床モデルは、CAR技術を制御性T細胞に変換する上で有望な結果を示しており、1型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの疾患への応用に成功しています9,12,13,14,15。クリニックでは、固形臓器移植拒絶反応16を防ぐためにCAR制御性Tregsが現在調査されています。

この記事では、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を作製するための詳細な方法論を紹介します。このプロトコルでは、ヒト末梢血から制御性T細胞を分離し、レンチウイルス形質導入やCRISPR/Cas9遺伝子編集およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた精密な遺伝子ノックインなどの技術を用いてTregを遺伝子組み換えします。また、これらの操作された制御性T細胞の表現型の安定性と抑制機能の評価についても説明します。これは、治療の可能性を検証するための重要なステップです17,18,19。このアプローチは、CAR-T細胞療法の設計と早期試験を効率化し、CAR-T細胞療法の変革的な影響を拡大して免疫系を調節する可能性を秘めています。私たちの方法論を共有することで、急成長しているCARトレグ療法の分野でさらなる研究と革新を促したいと考えています9,20。

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プロトコル

1. ヒトTregの単離

  1. ロイコパック加工
    1. ロイコパックの内容物を50mLのコニカルチューブに移します。ピペットで穏やかに混合することにより、等量のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)+2%ウシ胎児血清(FBS)を追加します。
    2. 室温(RT)で300 × g




















    6. figure-protocol-1

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結果

ここで説明するプロトコルは、自己免疫疾患、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、およびアレルギーの生きた治療法を作成することを目的として、ヒト制御性T細胞(Treg)における新しいキメラ抗原受容体(CAR)コンストラクトを評価するための合理化された標準化されたパイプラインを提供します。図1は、ex vivo増殖後の高レベルのTreg系統転写因子FOXP3およびHERIOSによって評価された、FACSを使用して末梢血から高純度のヒトTregを取得する方法を示しています(図1A)。

ヒト制御性T細胞で遺伝子改変を行うための2つの方法、レンチウイルス形質導入(図2)とCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックイン(図3)の2つの方法を紹介します。レンチウイルス骨格構造の合成、レン...

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ディスカッション

このプロトコルは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR Tregs)を生成および評価するための合理化された包括的な方法論を提供します。CAR技術が血液がんの治療に成功したことで、T細胞の免疫抑制サブセットであるTregsへの応用が促されました。従来のT細胞とは異なり、制御性T細胞は免疫応答を阻害し、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギーなどの望ましくない免疫に起因する疾患の治療法となる可能性がある9。CAR制御性Tregsを利用することで、抗原特異的な治療が可能になり、広域スペクトル免疫抑制剤11に関連する副作用を回避する可能性を秘めています。ここでは、CARを使用したエンジニアリングでTreg系統の安定性と機能を検証するためのin vitroプロトコルについて説明します。この記事では説明しませんが、免疫不全のNSGマウスは、移植片対宿主病および臓器移植13,14<...

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開示事項

LMRFは発明者であり、遺伝子操作された免疫細胞に関する特許からロイヤリティを受け取っており、Guidepoint GlobalとMcKessonのコンサルティングを行っています。残りの著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

LMRFは、Human Islet Research Network(HIRN)のEmerging Leader in Type 1 Diabetes助成金U24DK104162-07、American Cancer Society(ACS)のInstitutional Research Grant IRG-19-137-20、South Carolina Clinical and Translational Research(SCTR)Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01、Diabetes Research Connection(DRC)の助成金IPF 22-1224、Swim Across America Grant 23-1579から資金提供を受けています。RWCは、細胞・生化学・分子科学研修助成金のT32GM132055とHollings Cancer Center Lowvelo大学院フェローシップの支援を受けています。この研究は、サウスカロライナ医科大学Hollings Cancer CenterのFlow Cytometry and Cell Sorting Shared Resource(P30 CA138313)によって部分的に支援されました。CAR変異プラスミドを寄贈してくださったカリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)のQizhi Tang博士に心から感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アデノ随伴ウイルス (AAV)Charles River Laboratories
CAR標的発現K562細胞(例:CD19-K562
セシウム-137照射器
抗ヒトCD8 PerCP(クローンSK1)、バイオレジェンド344708
抗ヒトCD4 PE/Cy7(クローンSK3)、バイオレジェンド344612
DynaMag-15磁石モフィッシャー12301D
ゴーストBV510生存率染料 とんぼ13-0870-T100
K562 細胞American Type Culture CollectionCCL-243
0.5 M EDTA, pH 8.0Gibco 
1 M HEPESGibco15630080
塩化アンモニウム溶液STEMCELL Technologies7850
抗ヒト CD127 PE (クローン hIL-7R-M21)BD Biosciences557938
抗ヒト CD25 APC (クローン BC96)バイオレジェンド 302610
反ヒトCD4 FITC(クローンSK3)バイオレジェンド 
反ヒトCD71 PE(クローンSK1)バイオレジェンド334106
反ヒトCD8 PerCP(クローンSK1)バイオレジェンド 
反ヒト CTLA-4 PerCP-e710サーモフィッシャー46-1529-42
反ヒト EGFR APC (クローン AY13)バイオレジェンド352905
反ヒト FOXP3 eFluor 450サーモフィッシャー48-4776-42
反ヒト HELIOS PEバイオレジェンド137216
Ca2+およびMg2+遊離ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS) Gibco14190144
Cell Counter (TC20 Automated Cell Counter)Bio-Rad1450102
Cell Counting SlidesBio-Rad1450016
CellTrace Violet Cell Proliferation KitThermoFisherC34571
DNA LoBind TubesEppendorf22431021
Easy 50 EasySep magnet STEMCELL Technologies18002
EasySep Human CD4+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19052
EasySep Human CD8+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19053
EasySep 磁石 STEMCELL Technologies18000
eBioscience Foxp3転写因子染色バッファーセットThermoFisher00-5523-00
Falcon 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き、5 mLFisher Scientific08-771-2340μm
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140079
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
蛍光活性化セルソーターBD BiosciencesFACS Aria III セルソーター
GlutaMAXGibco35050061
Human CD3/28 T Cell Expansion and Activation DynabeadsGibco11131D
Invitrogen ネオントランスフェクションシステムThermoFisher10431915
Invitrogen ネオントランスフェクションシステム 100 μLキットThermoFisher10114334
レンチウイルスVectorBuilder
MEM 非必須アミノ酸溶液 Gibco11140050
Myc Tag 抗体 A647 (クローン 9B11)Cell Signaling Technologies2233S
Opti-MEM I 還元血清培地ThermoFisher31985062
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液Gibco15140122
組換えヒトインターロイキン-2 (rhIL-2)Peprotech200-02
RPMI 1640 培地,グルタミンなし Gibco11875093
ピルビン酸ナトリウムGibco11360070
スペクトルフローサイトメーターCytekNorthern Lights
TRAC gRNASynthegoSequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoFisherA36496
Trypan Blue solution シグマ T8154-100ML
1/10 ロイコパックSTEMCELL Technologies200-00921-20億PBMC
、、、サー15575020344604344707

参考文献

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