このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、がん治療の様相を変え、これまで不治の病であった血液がんの記録的な寛解率をもたらしました。これらの成功により、免疫応答の調節と阻害を主に担うCD4+ T細胞の小さいながらも重要なサブセットである制御性T細胞(Treg)にCARプラットフォームを適応させることへの関心が高まっています。制御性T細胞の免疫抑制活性を任意の細胞外標的にリダイレクトする能力は、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、および移植片対宿主病の細胞療法の作成に多大な影響を及ぼします。ここでは、ヒト末梢血からの 真正な 制御性制御性制御細胞の単離、アデノ随伴ウイルスを介した相同指向性修復(HDR)テンプレート送達を使用したレンチウイルスまたはCRISPR/Cas9支援ノックインを利用したヒト制御性制御細胞の遺伝子改変、および安定したヒトCAR制御細胞の ex vivo 拡大のための方法論について詳しく説明します。最後に、ヒトCAR Tregの表現型の安定性と in vitro 抑制機能の評価について説明し、ヒトCAR Tregが前臨床および臨床応用でどのように振る舞うかについての洞察を提供します。
概要
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療に革命をもたらし、これまで治療できなかったがんにおいて非常に高い寛解率を達成しました1,2。CAR-T細胞を用いた膠芽腫3,4,5の治療に用いた初期の結果は、CAR技術の汎用性と、幅広い悪性腫瘍を標的とする将来の可能性を浮き彫りにしています。この分野でCARのさらなる応用が検討されるにつれて、制御性T細胞(Treg)が有望な細胞タイプとして浮上しています。制御性T細胞は、免疫恒常性を維持し、IL-2の隔離、免疫抑制性サイトカインの分泌、抗原提示細胞の調節など、いくつかのメカニズムを通じて免疫応答を調節する上で重要な役割を果たします6,7。
CAR技術により、制御性T細胞は、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギーや喘息などの炎症性疾患の治療に活用することができます6,8,9
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プロトコル
1. ヒトTregの単離
- ロイコパック加工
- ロイコパックの内容物を50mLのコニカルチューブに移します。ピペットで穏やかに混合することにより、等量のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)+2%ウシ胎児血清(FBS)を追加します。
- 室温(RT)で300 × g
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結果
ここで説明するプロトコルは、自己免疫疾患、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、およびアレルギーの生きた治療法を作成することを目的として、ヒト制御性T細胞(Treg)における新しいキメラ抗原受容体(CAR)コンストラクトを評価するための合理化された標準化されたパイプラインを提供します。図1は、ex vivo増殖後の高レベルのTreg系統転写因子FOXP3およびHERIOSによって評価された、FACSを使用して末梢血から高純度のヒトTregを取得する方法を示しています(図1A)。
ヒト制御性T細胞で遺伝子改変を行うための2つの方法、レンチウイルス形質導入(図2)とCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックイン(図3)の2つの方法を紹介します。レンチウイルス骨格構造の合成、レン.......
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ディスカッション
このプロトコルは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR Tregs)を生成および評価するための合理化された包括的な方法論を提供します。CAR技術が血液がんの治療に成功したことで、T細胞の免疫抑制サブセットであるTregsへの応用が促されました。従来のT細胞とは異なり、制御性T細胞は免疫応答を阻害し、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギーなどの望ましくない免疫に起因する疾患の治療法となる可能性がある9。CAR制御性Tregsを利用することで、抗原特異的な治療が可能になり、広域スペクトル免疫抑制剤11に関連する副作用を回避する可能性を秘めています。ここでは、CARを使用したエンジニアリングでTreg系統の安定性と機能を検証するためのin vitroプロトコルについて説明します。この記事では説明しませんが、免疫不全のNSGマウスは、移植片対宿主病および臓器移植13,14<.......
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開示事項
LMRFは発明者であり、遺伝子操作された免疫細胞に関する特許からロイヤリティを受け取っており、Guidepoint GlobalとMcKessonのコンサルティングを行っています。残りの著者は、競合する利益を宣言しません。
謝辞
LMRFは、Human Islet Research Network(HIRN)のEmerging Leader in Type 1 Diabetes助成金U24DK104162-07、American Cancer Society(ACS)のInstitutional Research Grant IRG-19-137-20、South Carolina Clinical and Translational Research(SCTR)Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01、Diabetes Research Connection(DRC)の助成金IPF 22-1224、Swim Across America Grant 23-1579から資金提供を受けています。RWCは、細胞・生化学・分子科学研修助成金のT32GM132055とHollings Cancer Center Lowvelo大学院フェローシップの支援を受けています。この研究は、サウスカロライナ医科大学Hollings Cancer CenterのFlow Cytometry and Cell Sorting Shared Resource(P30 CA138313)によって部分的に支援されました。CAR変異プラスミドを寄贈してくださったカリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)のQizhi Tang博士に心から感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アデノ随伴ウイルス (AAV) | Charles River Laboratories | ||
| CAR標的発現K562細胞 | (例:CD19-K562 | ||
| セシウム-137照射器 | |||
| 抗ヒトCD8 PerCP(クローンSK1)、 | バイオレジェンド | 344708 | |
| 抗ヒトCD4 PE/Cy7(クローンSK3)、 | バイオレジェンド | 344612 | |
| DynaMag-15磁石 | モフィッシャー | 12301D | |
| ゴーストBV510生存率染料 | とんぼ | 13-0870-T100 | |
| K562 細胞 | American Type Culture Collection | CCL-243 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Gibco | ||
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 塩化アンモニウム溶液 | STEMCELL Technologies | 7850 | |
| 抗ヒト CD127 PE (クローン hIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | |
| 抗ヒト CD25 APC (クローン BC96) | バイオレジェンド | 302610 | |
| 反ヒトCD4 FITC(クローンSK3) | バイオレジェンド | ||
| 反ヒトCD71 PE(クローンSK1) | バイオレジェンド | 334106 | |
| 反ヒトCD8 PerCP(クローンSK1) | バイオレジェンド | ||
| 反ヒト CTLA-4 PerCP-e710 | サーモフィッシャー | 46-1529-42 | |
| 反ヒト EGFR APC (クローン AY13) | バイオレジェンド | 352905 | |
| 反ヒト FOXP3 eFluor 450 | サーモフィッシャー | 48-4776-42 | |
| 反ヒト HELIOS PE | バイオレジェンド | 137216 | |
| Ca2+およびMg2+遊離ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Cell Counter (TC20 Automated Cell Counter) | Bio-Rad | 1450102 | |
| Cell Counting Slides | Bio-Rad | 1450016 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34571 | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| Easy 50 EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human CD4+ T cell Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19052 | |
| EasySep Human CD8+ T cell Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19053 | |
| EasySep 磁石 | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| eBioscience Foxp3転写因子染色バッファーセット | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Falcon 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き、5 mL | Fisher Scientific | 08-771-23 | 40μm |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2 | |
| 蛍光活性化セルソーター | BD Biosciences | FACS Aria III セルソーター | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Human CD3/28 T Cell Expansion and Activation Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Invitrogen ネオントランスフェクションシステム | ThermoFisher | 10431915 | |
| Invitrogen ネオントランスフェクションシステム 100 μLキット | ThermoFisher | 10114334 | |
| レンチウイルス | VectorBuilder | ||
| MEM 非必須アミノ酸溶液 | Gibco | 11140050 | |
| Myc Tag 抗体 A647 (クローン 9B11) | Cell Signaling Technologies | 2233S | |
| Opti-MEM I 還元血清培地 | ThermoFisher | 31985062 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | Gibco | 15140122 | |
| 組換えヒトインターロイキン-2 (rhIL-2) | Peprotech | 200-02 | |
| RPMI 1640 培地,グルタミンなし | Gibco | 11875093 | |
| ピルビン酸ナトリウム | Gibco | 11360070 | |
| スペクトルフローサイトメーター | Cytek | Northern Lights | |
| TRAC gRNA | Synthego | Sequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT) | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | ThermoFisher | A36496 | |
| Trypan Blue solution | シグマ | T8154-100ML | |
| 1/10 ロイコパック | STEMCELL Technologies | 200-0092 | 1-20億PBMC |
参考文献
- Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
- Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell thera....
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再版と許可
