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方法論記事

頭部固定マウスの脳幹からの急性単一ユニット多電極記録

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DOI:

10.3791/67205

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2024年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

この記事について

サマリー

このプロトコルは、頭部固定マウスの脳幹から in vivoで高密度の単一ニューロン記録を取得する方法を説明する。このアプローチは、全身麻酔前および全身麻酔中に、腹外側水道周囲灰色 (急速眼球運動 (REM) 睡眠中に不活性な脳幹領域) のニューロンの活動電位発火を測定するために展開されます。

要約

シリコン多電極ベースの記録は、多くの脳領域における活動電位の時間分解能でニューロン活動を研究するためにますます人気が高まっています。しかし、マルチチャネルプローブを使用して脳幹のような深部尾側構造からのニューロン活動を記録することは依然として困難です。大きな懸念事項は、上矢状静脈洞や横静脈洞などの大きな血管を避けるプローブ挿入の軌道を見つけることです。これらの大きな静脈を損傷すると、広範な出血、下にある脳組織の損傷、そして潜在的に死に至る可能性があります。このアプローチでは、前座標と角度付きアプローチを結合して脳幹構造を標的とし、記録プローブが高リスク血管構造の下の脳を貫通できるようにする方法を説明しています。厳密に垂直なアプローチと比較して、角度付きアプローチは、ターゲットにできる脳領域の数を最大化します。この戦略を使用すると、レム睡眠に関連する脳幹領域である腹外側脳水道周囲灰色 (vlPAG) に再現性があり確実にアクセスして、セボフルラン麻酔前および麻酔中に頭部固定マウスで単一ユニットの多電極記録を取得できます。vlPAGおよび周囲の核のニューロン活動を高い時間分解能で記録する能力は、レム睡眠と麻酔の関係の理解を前進させる一歩です。

概要

シリコンマルチ電極ベースの記録は、単一活動電位分解能1,2,3,4で多くの脳領域にわたるニューロン活動を測定するためにますます人気が高まっています。この10年間で、高密度記録技術は大幅に進歩しました。現在のシリコンベースの記録電極は、多チャンネル数、光ファイバー、および皮質電図(ECoG)記録デバイス5,6に対応できます。さらに、これらの電極の慢性的な埋め込みは、長期記録7,8を可能にする。

近年の技術の進歩にもかかわらず、マルチチャネルプローブで脳幹のような深部尾側構造を標的とすることは依然として困難です。腹外側脳水道周囲灰色(vlPAG)などの脳幹構造を標的とする場合、大きな障害の1つは、主要な血管(上矢状静脈洞や横静脈洞など)を回避するプローブ軌道を特定することです。これらの大きな静脈の損傷は、広範な出血、下にある脳組織の損傷、さらには死を引き起こす可能性があります9,10。私たちは、斜めに前方座標から脳幹構造を標的とすることを提案します。これにより、記録プローブはそのような高リスク血管構造の下の脳を貫通できます(図1を参照)。この角度付きアプローチは、垂直アプローチと比較して、記録可能な脳領域の数を最大化します。さらに、ECoG記録が望まれる実験状況では、プローブ挿入のための開頭窓がより前方に配置されるため、角度のある前方アプローチにより、ECoGヘッドセットの埋め込みに利用できる頭蓋骨表面が大きくなります10,11。

麻酔によるレム睡眠の変化に関与する特定の細胞群と回路を特定することは、依然として麻酔研究の主要な目標です。したがって、ここでの目的は、レム睡眠に関連する脳幹領域であるvlPAGに再現性があり確実にアクセスして、セボフルラン麻酔前および麻酔中の頭部固定マウスで単一ユニットの多電極記録を取得することでした12,13。以前の研究では、覚醒マウスのvlPAGの電気生理学的局所電位(LFP)測定を使用して、麻酔14,15に関連する神経状態の変化を特定しています。しかし、LFP測定は、記録された領域16内の活動電位ではなく、主にシナプス活動に敏感である。したがって、麻酔薬がvlPAGニューロンによって生成される神経活動パターンに直接影響を与える方法についての理解は限られています。ここでは、頭部固定マウスの脳幹から高密度の単一ニューロン記録を得る方法について説明する。この方法は、他のさまざまな深部および後部脳幹構造からの単一ニューロン活動を記録するようにも適応できます。

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プロトコル

すべての研究は、バージニア大学(バージニア州シャーロッツビル)の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。体重25-30gの生後3-7ヶ月の雄C57BL/6Jマウス5匹を用いた。ここで使用する試薬や機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ヘッドプレートとヘッドセットの埋め込み

  1. ペルフルオロアルコキシ(PFA)コーティングされたステンレス鋼線を3ピンコネクタヘッダーにはんだ付けして、ECoGヘッドセットを作成します(図2A)。
  2. マウス定位アトラス17に基づいて挿入座標を特定する。ピタゴラスの定理を使用してプローブ挿入の角度と深さを計算することは、特に文献に情報がほとんどない場合に、合理的な出発点です(図1)18。
    注:最終的には、試行錯誤によって座標が調整されます。vlPAGを標的とするために、成体マウスで次の座標を使用しました:前後(AP)-3.6 mm、中外側(ML)+ 0.5 mm、背腹側(DV)-4 mm。プローブは20°の角度で挿入されました(AP)。
  3. マウスを誘導室(酸素中の1.5%-3%イソフルラン)に入れることにより、全身麻酔を誘発します。麻酔をかけたら、マウスを定位固定装置フレームに配置し、動物の鼻をノーズコーンに置き、ヘッドバーで頭を安定させます。
  4. 角膜の損傷を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。体温を37°Cに保つために、温度制御システムを使用してください。
  5. 脱毛クリームを塗るか、頭皮全体に毛を剃り、ポビドンヨードと70%アルコールで消毒します。「チップのみ」の無菌技術を使用して、無菌の手術野を維持します。
  6. つま先つま先つまみテストを行い、麻酔の深さを確認します。
  7. 鎮痛剤を投与する:カルプロフェン2.5 mg / kg、背中に皮下投与。.
  8. 頭皮を5mm切開して、頭頂骨と後頭骨の上の皮膚の円形パッチを取り除きます。メスの刃で髄膜をこすり落とすようにして、髄膜をそっと取り除きます。
  9. メスの刃を使用して筋肉の付着物を切断し、頭頂骨と後頭骨を露出させます19。必要に応じて過酸化水素を塗布して出血を抑え、頭蓋骨の表面を乾燥させます。乾いた頭蓋骨に歯科用セメントと樹脂を塗布して、強力な結合を実現することが重要です。
  10. まず、頭蓋骨20のブレグマとラムダのランドマークを特定します。次に、ノーズコーンの位置を調整して頭蓋骨の前後の位置を水平にし、2つのランドマーク間に100μm以上の高さ差がないことを確認します。
  11. 頭蓋骨の内側外側の位置を水平にするには、ブレグマとラムダの間の2つの反対側のポイントを選択し、それぞれが矢状縫合糸から1mmのところにあり、それらのレベルを確認します。両者の間に100μm以上の高さ差がある場合は、ヘッドバーを操作して頭蓋骨の内側外側の位置を調整します。
  12. ブレグマとラムダの間の距離を測定し、それをFranklin-Paxinos定位固定アトラスで報告された距離(通常は4.2 mm)17と比較します。測定された距離と報告された距離の差を使用して、AP 座標を比例的にスケーリングします。滅菌した鉛筆で頭蓋骨の開頭座標をマークします。
    注:測定されたbregma-λ距離が4.2 mmと異なる場合は、座標を比例してスケーリングする必要があります。定位アトラスで報告されるすべての AP 座標は、標準化された bregma-lambda 距離に対応します。マウスの頭蓋骨のサイズは変動するため、それに応じて座標を調整することが重要です。
  13. 定位固定装置マイクロマニピュレーターを使用して、ヘッドプレートをラムダ縫合糸の真上に配置し、ヘッドプレートとその周囲に歯科用セメントを塗布して頭蓋骨に固定します(図3A、B)。セメントが乾くまで少なくとも10分待ちます。
  14. 2つの皮質電極(前頭皮質と頭頂皮質)と参照電極として機能する1つ(小脳)用のバリ穴(直径0.5mm)をドリルで開けます。被覆した銀線電極の剥がれた端部(0.5mm)をバリ穴内に置き、紫外線活性化樹脂で固定します。
  15. コーティングされたステンレス鋼線を歯科用セメントで完全に覆い、ワイヤーが露出しないようにします。ヘッドセットの下側と側面を歯科用セメントで覆い、しっかりと固定します。ヘッドセットを所定の位置に固定した後、ブレグマ縫合糸とラムダ縫合糸が見えたままであることを確認してください(図2B)。
  16. マウスを最低7日間回復させ、動物と手術部位に異常がないか毎日調べます。必要に応じて鎮痛薬(カルプロフェン2.5 mg / kg、SC)を投与します。.

2. シリコンプローブの配置と記録

  1. マウスを記録装置に慣れさせ、頭部を固定します(2日間で少なくとも1.5時間)(図2D)。
  2. 録音の日に、マウスを麻酔室(酸素中のイソフルラン1.5%〜3%)に入れます。
  3. マウスを定位固定装置フレームに配置し、1.3の説明に従ってノーズコーンとヘッドバーを調整します。定位固定手術中は麻酔(イソフルラン1.5%-3%酸素中)を維持します。つま先つま先つまみテストを行い、麻酔の深さを確認します。
  4. 眼に眼軟膏を塗り、適切な体温を維持します。.
  5. ブレグマとラムダを特定し、2つの解剖学的ランドマークの間に100μm以上の高さ差がないことを確認します。
  6. 計算された座標を見つけて頭蓋骨に滅菌鉛筆でマークし、座標の周りに2mmx2mm開頭術ウィンドウのアウトラインを作成します。
  7. つま先つま先つまみテストを実施して、麻酔の深さを確認します。
  8. 高速ドリルを使用して、2 mm x 2 mmの開頭ウィンドウを作成します。脳表面が乾燥するのを防ぐために、0.5〜1mLの生理食塩水を適用します。シリンジ針と細い鉗子を使用して硬膜を取り除きます。
    注意: 過度の出血を避けるために、主要な血管(上矢状静脈洞、横静脈洞)に注意してください(図3)。
  9. 高速ドリルを使用して、シリコンプローブの参照電極用に、通常は頭蓋窓から1~2mmのところに別のバリ穴を作成します。
  10. 付属のアプリケーターを使用して、0.2 mLの低毒性シリコン接着剤を頭蓋骨に塗布し、開頭術を完全に密封します。
  11. マウスを約1時間回復させます。
  12. ヘッドプレートとネジを使用して、マウスのヘッドを電気生理学記録装置に取り付けます(図2D)。
  13. シリコンプローブシャンクに蛍光色素DiI(1:4 DiI:Ethanol)をコーティングし、実験後にプローブの軌道を再構築できるようにします。
  14. プローブをマニピュレーターに取り付け、希望の角度を設定します。vlPAGを標的にするために、15〜20°のAP角度が適用されました。
  15. 記録プローブを頭蓋窓の中心内の脳表面まで下げます。まず、プローブを~300μmの深さまで手動で挿入します。この深さまで挿入したら、組織の損傷を最小限に抑えるために、プローブを自動的に(例えば、200μm/min)目標の深さまでゆっくりと下げます21 (図2C)。
    注意: 最初はプローブを手動で挿入することをお勧めします。プローブの手動挿入により、プローブが最初の挿入時に曲がった場合に、プローブを停止して引っ込めることができます。プローブが組織を完全に貫通すると、通常、自動モードでプローブを下降し続けるのは安全です。
  16. 開頭窓内の脳表面にミネラルオイルを塗布して、乾燥を防ぎます。
  17. 挿入後、記録プローブを10分間安定させます。
  18. Intanレコーディングコントローラーを使用して、シリコンプローブとECoGからのデータを30kHzで記録します。
  19. 記録後1〜2時間後、経心灌流技術を使用して、脳を4%パラホルムアルデヒド22に固定します。
    注:セメントのため、頭蓋骨の吻側部分を取り除くのが難しい場合があります。そのため、頭蓋骨の背側部分を切除して脳を切除することが望ましいです。
  20. マウスの首を切り落とし、背側の正中線に沿って首から下顎まで皮膚を切ります。頭蓋骨に付着している筋肉や組織を取り除き、脳にアクセスしやすくするために下顎を切り取ります。
  21. 灌流が正しく行われると、脳は少し縮小し、大孔の背側部分に細かいハサミを挿入するのに十分なスペースが残ります。後頭骨に内側に1つ、外側に1つ、反対側に1つの切り傷を1つ、サイズが約1mmの切り込みを入れます。
  22. 眼科用鉗子を使用して、頭蓋骨の背側部分を慎重に取り除きます。後頭骨から始めて、脳の背側部分全体が露出するまですべての頭蓋骨の破片を取り除きます。
  23. マイクロヘラを脳の下に滑り込ませ、嗅球から始めて脳をすくい取ります。
  24. 灌流して除去すると、脳は4°Cで24〜48時間4%パラホルムアルデヒドに保存できます。

3. プローブ軌道再構築のための組織学

  1. ビブラトームを使用して脳を70μmの冠状切片に切片化します。
  2. 細胞核を染色するDAPI封入剤を使用して、切片をスライドにマウントします。スライドを覆い、透明なマニキュアで密封します。
  3. 蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。プローブトラックがはっきりと見えるようにコントラスト/明るさを調整します。MATLAB コードがスムーズに実行されるように、結果の tiff イメージ ファイル サイズが 10 MB 未満であることを確認してください。MATLAB コード23 を使用してプローブ トラックを再構築します。

4. 電気生理学的データ解析

  1. シリコンプローブから記録された神経信号を、オフライン検出および自動選別ソフトウェア(Kilosort)24を使用して分析します。
  2. Phyを使用して検出されたクラスターをマルチユニットまたはシングルユニットとして手動で分類する25。クラスターが生理学的スパイク波形形状を持ち、クロスコレログラムに不応期を示し、振幅ビューが正規分布を示す場合は、クラスターを単一ユニットとして分類します。
  3. 単一ユニットデータをMATLABにインポートして解析する 23.

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結果

5台のオス型C57BL/6JにECoGヘッドセットとヘッドプレートを埋め込みました(図4A)。回復後、マウスは、別々の日に2回の1.5時間のセッション中に頭部固定と電気生理学記録装置に慣れました(図4B)。次に、2 mm x 2 mm の開頭窓を作成し (図 4C)、マウスをウェイクアップして頭を固定した状態でシリコンプローブを挿入しました (図 4D)。2種類のシリコンUCLAプローブが使用されました:(1)64 M:ワンシャンク、64電極プローブ。(2)256 ANS:4シャンク、256電極プローブ。セボフルランと酸素は、電気生理学リグに固定されたノーズコーンを使用して投与されました。酸素とセボフルランのレベルは、インラインガス分析計を使用して5分ごとにモニターされました。経心灌流後、脳を採取し(図4E)、プローブの軌跡を評価しました(<...

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ディスカッション

脳幹核は、呼吸、意識、睡眠などの基本的な機能を媒介する26,27,28。脳幹の位置(深部および後部)は、標準的な技術を使用してin vivoでそのニューロン活動を研究する上で課題となります。ここでは、頭部固定マウスでの再現性のある単一ユニット記録を可能にするために、角度付き前方アプローチが示されています。

多電極シリコンプローブを慎重に挿入することは、主要な血管への損傷を回避しながら、レム睡眠に関連する脳幹構造を一貫して標的にするために重要です。エントリー13の最適な座標と軌道を解決するには、かなりの程度の精巧さ、集中力、忍耐力が必要です。

プローブの軌道が角度付きで、深部構造物をターゲットとするのに必要な距離...

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開示事項

著者は、この作品に基づく競合する金銭的利益またはその他の利益相反はありません。

謝辞

図 1、 図 3、 図 4、 図 8 、 図 9 は BioRender.com を使用して作成されました。MATLAB コードのサポートとスクリプトの共有にご協力いただいた Scott Kilianski に感謝いたします。プローブ軌道の再構築に協力してくれたAnna Grace Carnsに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1024 チャネル RHD レコーディング コントローラーIntan Technologies, Los Angeles, California, USAC3008シリコン プローブ レコーディング; レコーディング ハードウェアとソフトウェア
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, USA48393-081Histology
4% PFA in PBSThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAJ61899.AK組織学;灌流溶液
C&Bメタボンパターソンデンタル、リッチモンド、バージニア州、米国粉末:5533559、クイックベース:5533492、触媒:55335007ヘッドプレート&ヘッドセット移植
C57 / 6Jマウス4-6週間、オスジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州、米国000664
Capnomac UltimaDatex、ヘルシンキ、フィンランド ULT-SVi-27-07ガス分析計 販売終了 代替ガス分析計はBionet Americaから購入できます 
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAV22888シリコンプローブのコーティング用赤色蛍光染料
コネクタヘッダーDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA1212-1788-NDECoG Headset
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA0100-20Histology
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Virginia,アメリカ044-1113ヘッドプレート&ヘッドセットの埋め込み;for 頭蓋骨にステンレス鋼線を固定する
低毒性シリコン接着剤World Precision Instruments、サラソタ、フロリダ州、米国KWIK-SILヘッドプレート
マイクロマニピュレーターシステムNew Scale Technologies、ビクター、ニューヨーク、米国マルチプローブマニピュレーター:XYZステージアセンブリ:06464-0000、MPMシステムキット:06267-3-0001、MPM-Platform-360、MPMマニュアルアーム用MPMリング、MPM_Ring-72 DEG:06262-3-0000シリコンプローブの記録。脳へのプローブの挿入
MicroprobesUCLA, Los Angeles, California, USA256 ANS, 64MDiscontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLSilicon probe recording; preventing the tissue from dry during the
recording 生理食塩水ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAZ1376ヘッドプレート&ヘッドセットの埋め込み;手術中の脳の乾燥を防ぐ
PFAコーティングされたステンレス鋼線-直径0.008インチ ストライプエンドでコーティングAMシステム、スクイム、ワシントン州、米国791400ECoG用ヘッドセット&参照電極 
プラチナ線 24AWG World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAPTP201シリコンプローブ記録用参照電極 
Shandon Colorfrost Plus顕微鏡スライドThermoFisherScientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国99-910-01学
ステンレス鋼ヘッドプレートスターラピッド、中国カスタムメイドパーツヘッドプレート&ヘッドセットの埋め込み;ご要望に応じて利用可能なデザイン
脳定位固定装置KOPF、カリフォルニア州ツジュンガ、米国モデル940 デジタルディスプレイコンソール付き小動物定位固定装置器具ヘッドプレート&ヘッドセットの埋め込み
ド組織

参考文献

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