微細藻類からのクロロフィル a および b 産生に及ぼす成長因子の影響評価

サマリー

本研究は、微細藻類から脂溶性色素を抽出し定量するためにJeffreyとHumphreyによって開発された方法を採用する利点を強調しています。この方法は、これらの生物のクロロフィル産生と細胞含有量に対する成長因子の影響を評価するための貴重なツールとして機能します。

要約

微細藻類には、クロロフィルとカロテノイドの2つの主要な顔料グループが含まれています。クロロフィルは、光エネルギーを吸収して化学エネルギーに変換し、有機化合物の合成を促進する緑色の顔料です。この顔料は、その高い抗酸化特性と着色能力により、食品、医薬品、化粧品業界のバイオテクノロジー投入製品の貴重な一次供給源として機能します。本研究の目的は、タグチ_L4実験計画法による成長因子(_CO2濃度、光色、光強度)の細胞増殖とクロレラ・ソロキニアナのクロロフィルaおよびbの細胞内含量に及ぼす影響を評価し、続いてヘマトコッカス・プルビアリスを用いた方法の検証を行うことであった追加の研究モデルとしての微細藻類。細胞増殖は、波長550nmの光学密度分光光度法を用いて定量化しました。クロロフィルの定量のために、純度90%のアセトン溶液を用いて細胞抽出物を得、続いて、JeffreyおよびHumphreyが記載した方法に従って、647nmおよび664nmの波長で分光光度法を用いてクロロフィルaおよびbの濃度を定量した。実験結果から、低_CO2添加、紫色光、低光強度の条件を制御することで、細胞増殖と細胞内のクロロフィルaおよびbの濃度が増加することが示された。このクロロフィル定量法の実施により、使用される波長が両方のタイプのクロロフィルの吸光度ピークにあるため、クロロフィル含有量を迅速、簡単、正確に測定でき、この手法は研究中の微細藻類に対して容易に再現可能になります。

概要

近年、人為的な活動によって引き起こされた環境問題の増加と、それが生態系の健康とバランスに悪影響を与えるため、より効率的で環境に優しい生産システムの探求が進められています。これにより、産業界でのプロセスが加速し、バイオレメディエーション治療の実施と、これらの有害な影響を軽減するためのバイオ化合物の開発が促進されました¹。

このような状況は、現在の環境的および経済的課題に対する革新的な解決策を見つける必要性に後押しされて、微細藻類の研究の大幅な成長につながっています。微細藻類は、太陽光と二酸化炭素をそれぞれエネルギー源と炭素源として使用して、水生環境で繁栄します。この特性により、彼らはさまざまな貴重な製品を生産するための持続可能で有望な代替手段となっています。この分野の研究は、これらの細胞の生理機能と代謝の理解、およびそれらの培養と加工のための効率的な技術の開発に焦点を当てています²。

微細藻類を研究するためのアクセス可能で信頼性の高いツールを開発して、研究プロセスを加速し、その生理学、代謝、および潜在的なアプリケーションの理解を深める必要があることは明らかです。これらのツールにより、これらの生物の健康と発達の基本的な指標であるクロロフィル濃度などの主要なパラメーターに対する環境要因と生産要因の影響を迅速に分析できるはずです。クロロフィル含有量の減少は、環境ストレス、栄養不足、または病気を示している可能性があります。

これらの緑色顔料は、光合成において重要な役割を果たし、太陽光エネルギーを捕捉して二酸化炭素と水をグルコースと酸素に変換し、微細藻類³のバイオマスの0.5%から5%を構成します。クロロフィルは、生命プロセスの維持に不可欠な役割を超えて、さまざまな産業で用途が見出されています。クロロフィル抽出物は、天然着色料として食品や飲料の加工に利用され、製品に鮮やかな緑の色合いを与えると同時に、抗酸化特性も提供します。さらに、クロロフィルベースのサプリメントは、解毒作用と抗炎症作用が主張されているため、健康とウェルネスの分野で人気を集めています。クロロフィルの多面的な特性を活用することで、産業界は視覚的な魅力と消費者の健康の両方に貢献する革新的な製品を開発することができます¹。

この点で、バイオテクノロジーとの関連性が高い微細藻類の1つは 、C.sorokinianaです。この微生物は、その急速な増殖速度で際立っており、バイオマス生産において非常に効率的です。さらに、 C. sorokiniana は、タンパク質、脂質、ビタミンなどの多様な栄養価の高い化合物を含んでおり、食品、飼料、バイオ燃料生産のさまざまな用途に有用です²。さらに、この微細藻類種は、多様な機能を持つ細胞外酵素を産生することがわかっており、廃水処理、バイオレメディエーション、医薬品などのバイオテクノロジーへの応用の可能性が開かれています⁴。その急速な成長と多様な用途に加えて、 C. sorokinianaは クロロフィル生産の大きな可能性も示しています。光合成微生物として、 C. sorokiniana は、微細藻類^のバイオマスの0.5%から5%を構成するクロロフィルの合成に必要な機構を持っています3。この能力により、 C. sorokiniana は商業規模のクロロフィル生産の魅力的な候補となり、緊急の環境および栄養上の課題に対する持続可能な解決策となることが期待されています⁵。

一方、非常に興味深い別の微細藻類種は 、H.pluvialisです。この微細藻類は、多くの工業用途を持つ強力な抗酸化色素であるアスタキサンチンの生産で有名です。アスタキサンチンは 、H. pluvialis 光化学系の保護メカニズムとして機能し、環境要因によって引き起こされる酸化ストレスから光化学系を保護します。この顔料は、その抗酸化特性と潜在的な健康上の利点により、化粧品、栄養補助食品、および水産養殖業界で非常に人気があります。アスタキサンチンを生産する豊富な能力を持つ H. pluvialis は、さまざまな産業および消費者のニーズに対応する革新的な製品を開発するための有望な道筋を示しています⁶。

最近の研究では、 H. pluvialis¹ がクロロフィル生産の可能性も強調されており、その産業的意義がさらに高まっています。例えば、ある研究では、さまざまな成長条件下で H. pluvialis のクロロフィル含有量を調査したところ、最適な培養パラメータの下で、 H. pluvialis は他の微細藻類種を凌駕する顕著なクロロフィル産生率を示したことがわかりました⁷。この知見は、 H. pluvialis がクロロフィルの持続可能な供給源としての可能性を強調しており、さまざまな産業分野での利用に新たな機会を提供している。

プロトコル

1. 培地調製と接種材料調製

1. 3N-BBM+ V(CCAP)増殖培地(主要栄養素:NaNO₃ [0.75 g ^L-1]、CaCl₂ [0.019 g ^L-1]、MgSO₄ [0.019 g ^L-1]、K₂HPO₄ [0.057 g ^L-1]、NaCl [0.025 g ^L-1]、KH₂PO₄ [0.175 g ^L-1]、微量栄養素:Na₂ EDTA [0.0186 g ^L-1]、 FeCl₃ [0.0024 g ^L-1]、MnCl₂ [0.001 g ^L-1]、ZnCl₂ [1.25 x ^10-4 g ^L-1]、CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1]、Na₂MoO₄ [9.98 x ^10-5 g ^L-1]⁾⁸ を 121 °C および 1.5 psi で 15 分間滅菌します。
2. 微細藻類C.sorokinianaのための約3×10⁶細胞^mL-1の濃度で1Lの成長培地をフラスコに接種する。または、増殖培地に5%から10%(v / v)の接種材料を追加します。
   注:無菌状態を維持するために、層流フード、手袋、白衣、フェイスマスクを使用することをお勧めします。
3. 接種したフラスコを、約3,600〜4,200ルクスの赤色光源の下で、22〜26°Cの温度で、 C. sorokiniana の光周期12時間と暗さ12時間の光周期、 H. pluvialisの光周期16時間と暗さ8時間の光周期でインキュベートし、24時間ごとに手動で攪拌します。 両方の株で約7日間。
   注: C. sorokiniana の場合は少なくとも7〜10日間(濃い緑色になるまで)、 H. pluvialisの場合は10〜12日間、成長条件下で維持します。動態学の接種物として機能する微細藻類濃縮物を得るためには、生成された藻類から上清媒体を除去する必要があります。
4. 無菌環境で、滅菌済みの15 mLコニカル遠心チューブに約10 mLの接種培地を充填し、3,000 x g で25〜30°Cで20分間遠心分離します。
5. 無菌条件下では、マイクロピペットを使用するか、無菌の50 mL円錐形遠心チューブにバイオマスを注いで濃縮することにより、上清を除去します。
6. キネティクスに必要な量の接種物が得られるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。
7. 接種の光学密度(OD₅₅₀ nm)を測定して微細藻類の細胞濃度を決定し、使用する準備ができるまで3〜4°Cの温度で保存します。
   注:直接細胞カウントは、最初に細胞濃度と吸光度を相関させるために行われました。カウントすると、接種物は4日以内に冷蔵保存することができます。

2. 成長動態の研究

1. 標準的な実験室の手順に従って、各実験に適した必要量の3N-BBM+ V(CCAP)を調製してください(C . sorokiniana のフォトバイオリアクターレベル試験は8 L、 H. pluvialisのフラスコレベル試験は0.5 L)。
2. フォトバイオリアクターとフラスコの両方で、光源を目的の色スペクトル(C . sorokiniana の場合は460 nmの青、紫、460 nmと630 nmの混合、 H. pluvialisの場合は630 nmの赤)に設定します。外部光の干渉を避けるために、両方のシステムを覆います。
   注:各発光ダイオードから放出される波長の変動により、各ダイオード9の波長と発光パワーを決定するために、光源の分光放射計を使用して分光放射測定^{を行った。}紫色光は、赤色LEDと青色LEDを組み合わせることで実現され、青色LEDの波長は460nmで発光電力は1.65W ^nm-1、赤色LEDの発光電力は630nmで発光電力は0.6W ^nm-1になりました。これらの測定値は、青色光と赤色光の下でのみ実施された試験に使用されました。
3. C. sorokiniana の場合は 12 時間の明るいサイクルと 12 時間の暗いサイクル、H. pluvialis の場合は 16 時間の明るいサイクルと 8 時間の暗いサイクルを交互に行うようにタイマーをプログラムします。
4. CO2曝気システムをフォトバイオリアクター培養容器に接続して、C. sorokinianaに12時間間隔で二酸化炭素を供給します。
5. 十分な量のプレシノキュラムを培養容器に接種して、開始細胞密度が3 x 10⁵ 細胞^mL-1 または光学密度で同等(OD₅₅₀ nm)= 0.180になるようにします。
   注:汚染を防ぐために、接種中は無菌技術を確保してください。
6. C. sorokinianaの場合は12時間、H. pluvialisの場合は8時間の間隔で定期的に培養物をサンプリングし、細胞増殖と生理学的パラメーターを監視します。無菌技術を使用してサンプルを採取し、培養物の完全性を維持します。

3. クロロフィルの定量

注:細胞定量のデータは 、補足ファイル1に記載されています。

1. サンプル40 mLをプラスチック製の円錐形遠心分離チューブに入れます。
2. 3,000 x g で15°Cで20分間遠心分離し、デカンテーションまたはパスツールピペットを使用して上清を廃棄します。
3. 酸化を防ぐために、アルミホイルで覆われたガラス管とスクリューキャップにセルペレットを移します。
4. ボルテックスを使用して、細胞ペレットを3 mLの純度90%アセトン溶液で再懸濁します。
5. 懸濁したサンプルを氷浴でそれぞれ5分間の2サイクル超音波処理し、4°Cで16時間¹⁰分休ませます。
6. 16時間後、前のステップ(ステップ3.5)で述べたのと同じ条件下で再度超音波処理し、前述の条件(ステップ3.2)で再度遠心分離する。
7. パスツールピペットを使用して顔料抽出物を分離し、光から保護された別のきれいなチューブに移します。
8. 顔料抽出物を石英セルに入れ、630 nm、647 nm、および664 nmの波長の分光光度計で読み取ります。
   注:事前に分光光度計を90%アセトンで校正してください。
9. クロロフィル濃度を計算するには、次の式¹¹を使用します。
   クロロフィル A = 11.93 A₆₆₄ - 1.93 A₆₄₇
   クロロフィル b = 20.36 A₆₄₇ - 5.50 A₆₆₄
   注:結果は抽出物のμg ^mL-1 で表され、抽出物の量を乗算し、サンプルのmL数で割って、培養物のμg ^mL-1 のクロロフィル濃度を得ます。
10. μgchlセル^-1の値を取得するには、次の式を使用します。
    μg CHL 細胞^-1 = 1 mLの培養液中の μg CHL / [cells ^mL-1]培養液中の細胞濃度。

結果

クロロフィル細胞濃度の変動を検出する技術の効率を観察し、C. sorokinianaの成長因子の影響を評価するために、CO₂体積の添加、光の色、および光強度を評価するタグチ_L4実験計画が確立されました。各因子は、表1に示すように、表2の実験計画で定義された条件下で、低レベルと高レベルで評価されました。

実験プロセスが終了すると、結果は、_CO2の低添加、紫光、および処理2に対応する高光強度(_C1、P、_I2)の組み合わせにより、微生物の増殖が7.83×10⁵細胞^mL-1に増加することを示しました。一方、_C2、P、_I2の条件下では、処理4ではクロロフィル含有量が高く、132時間で5.92×10-7μgの^cel-1の濃度に達し(図1)、紫色の光と高い光強度が両方の経験の要因の最適レベルと一致しました。

同時に、評価された4つのラインで同様の動作が観察されました。しかし、紫色の光の下で行われたテストでは、明確な好感度が観察されました。このパターンは、紫色の光が結果にプラスの影響を与え、細胞の成長または活動に最適な条件を促進する可能性があることを示唆しています。これらの知見は、生物学実験において照明条件を慎重に検討することの重要性を強調しています。

統計分析から、主効果プロットが得られました。 図2では、評価された因子の各レベルが C.sorokinianaのクロロフィル産生にどのように影響するかを観察できます。クロロフィル生成の最良の条件は、CO₂の高添加、紫色光、および高光強度(C₂、P、I₂)であり、色と二酸化炭素濃度は非常に近い有意値を示しますが、光強度は評価された応答変数に対して有意な影響が低くなります。

さらに、コントラスト図(図3)を生成、_CO2 体積添加の影響による細胞のクロロフィル濃度の挙動と、それらが受けた光の色を示しました。

紫色の光(青色光と赤色光の混合物)と高い光強度は、微生物の増殖とクロロフィルの生成を有意に促進することが観察されました。一方、CO₂の高添加は、実験中にクロロフィル細胞濃度を最大まで増加させますが、微生物の増殖を妨げるため、それぞれ両方のパラメーターにプラスとマイナスの影響を与えます。しかし、紫色の光の下では、8.5 ft³ ^h-1の流量で12時間ごとに_CO2の20秒パルスを_CO2体積で追加すると、両方のパラメータに対して良好な応答が得られることが注目されます。

C. sorokinianaから得られた方法と結果を検証するために、ストレス条件下でクロロフィルを分解してアスタキサンチンを合成するという自然な特性により、H. pluvialisに対して赤色光の下で確認フラスコレベルの試験を実施しました。これは、培地の塩分濃度を増加させることにより168時間で誘導されました。濃度グラフを生成(図4)し、最大クロロフィル濃度を0時間で1.41×10-7μgの^cel-1で求めた。この場合、天然の微細藻類の挙動により、クロロフィル濃度の低下が観察され、調査中の生物学的モデルに生理学的変化が生じる可能性が示唆されました。これはさらに図5に示されており、C. sorokinianaの顕微鏡写真(図5A)とH. pluvialisの2つの顕微鏡写真を示しています:1つは緑色期(図5B)で、もう1つは変化およびアスタキサンチン産生期(図5C)です。興味深いことに、この減少にもかかわらず、カロテノイド化合物の存在による干渉は発生しませんでした。カロテノイド化合物は、それらに存在する脂溶性色素です。これは、多様な能力と挙動を持つ微細藻類におけるこの技術の選択性と再現性の強力な証拠です。

グラフは、実験全体を通して総クロロフィル濃度が減少したことを示しています。特に、50時間でクロロフィルaがクロロフィルbと比較して増加し、クロロフィルbの濃度が大幅に減少します。クロロフィル濃度の最も大幅な低下は、指数関数的成長期の終わりに発生します。この減少は、H. pluvialisのカロテノイドの産生に起因しています。

同様に、クロロフィルaおよびb組成の分析は、図6のC.sorokiniana(_C1、P、_I2)の生産量が最も多い処理のために行われました。H. pluvialisとは対照的に、クロロフィルの産生は実験期間全体を通じて一貫した増加を示し、指数関数的段階でのみ分析されました。H. pluvialisと同様に、クロロフィルaは実験の開始時にクロロフィルbよりも低い割合で最初に存在することが観察されます。しかし、これらの比率は50時間地点で顕著な変化を遂げ、その後、クロロフィルAはクロロフィルBよりも高い生産率を示しています。

この研究で採用された分析手法は、生物学的モデル内および異なる生物学的モデル間での変化を検出するのに効率的であることが証明されています。これらの知見は、分析法の感度と精度を強調しており、生物学的システム内および生物学的システム間のクロロフィルダイナミクスの微妙な理解を可能にします。このような洞察は、色素の合成と代謝を支配する複雑なメカニズムを解明し、バイオテクノロジーおよび環境研究のさらなる進歩への道を開くために非常に貴重です。

図1:実験デザイン処理中のクロロフィル細胞含有量。 Chlorella sorokinianaで測定されたクロロフィル細胞含有量は、さまざまな実験的処理で測定されました。データは n = 3 の標準偏差として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:細胞のクロロフィル含有量の主効果プロット。Chlorella sorokinianaの細胞性クロロフィル含有量に対するさまざまな処理の影響を示す主な効果プロット。データは n = 3 の標準偏差として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:細胞のクロロフィル濃度の等高線図。 細胞のクロロフィル濃度、CO₂ 濃度、および明るい色の関係を示す等高線図。光の色は、軸 1 を青、軸 2 を紫で表し、中間レベルは赤色の光の追加を示します。データは n = 3 の標準偏差として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:H. pluvialisの生育速度におけるクロロフィル濃度。Haematococcus pluvialisの成長動態で測定されたクロロフィル濃度。データは n = 3 の標準偏差として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:C. sorokinianaとH. pluvialisの顕微鏡写真。 Chlorella sorokiniana (A) と Haematococcus pluvialis の顕微鏡写真画像で、緑相 (B) と赤相初期 (C) の標本を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:C. sorokinianaの成長速度におけるクロロフィル濃度。 クロレラ・ソロキニアナの成長動態で測定されたクロロフィル濃度。データは n = 3 の標準偏差として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

因子	低レベル	ハイレベル
CO2 添加(L)	C1	C2
明るい色	ブルー (B)	パープル(P)
光の強度 (ルクス)	私1	私2

表1:動力学の要因とレベル。 動力学係数とそれぞれのレベルの概要:C₁ = 0.078 L;C₂ = 0.15 L;B =ブルーライト;P =紫色の光;I₁ = 550ルクス;I₂ = 1200ルクス。

処遇	CO2 追加	明るい色	光の強度 (ルクス)
	(L)
1	C1	B	私1
2	C1	P	私2
3	C2	B	私1
4	C2	P	私2

表2:実験デザインと治療。 実験デザインと適用された治療の要約:C₁ = 0.078 L;C₂ = 0.15 L;B =ブルーライト;P =紫色の光;I₁ = 550ルクス;I₂ = 1200ルクス。

補足ファイル1:細胞定量データ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

H. pluvialisとC. sorokinianaの比較研究では、クロロフィル産生動態に有意な差があることが明らかになった。H. pluvialisは実験全体を通じてクロロフィル濃度の低下を示したが、C. sorokinianaは着実な増加を示した。さらに、当初は両種ともクロロフィルaの割合が低かったが、この比率は特定の成長条件で逆転し、これは特定の波長の選択性または曝露を通じて前記クロロフィルの産生が誘導されたことを示している可能性がある。これらの知見は、実験条件に対する各種のユニークな応答を示唆しており、生物学的モデル内および生物学的モデル間の変化を検出するために使用される分析手法の感度を強調しています。クロロフィルaとbの比率の微妙な変化を識別する能力は、微細藻類の色素合成の制御に関する新たな洞察を提供し、バイオテクノロジーや環境研究などの分野で重要な意味を持つ可能性があります。

クロロフィル産生の増加期間を検出することは、光合成プロセスにおける主要な色素としての役割のために重要です。クロロフィル a は、光エネルギーを捕捉して化学エネルギーに変換するために不可欠であり、それは細胞の成長と代謝を促進するために使用されます。したがって、クロロフィル a 産生の増加は、生物の光合成能力の増加を示しており、微生物の成長に最適な条件を示唆しています¹²。このことは、 C. sorokiniana において、高濃度のクロロフィルを生成した試験が、より大きな細胞増殖を得た試験であったという観察を裏付けており、光合成微生物の発生と増殖に最も有利な環境条件がいつであるかについての貴重な洞察を提供している。

特に、 H. pluvialis のクロロフィルの割合を理解することは、微細藻類のストレス状態に関する重要なシグナルを提供できるため、特に興味深いものです。高光や栄養不足などの条件が悪くなると、微細藻類はクロロフィルの生成を減らし、代わりにアスタキサンチン¹¹のようなカロテノイド色素を合成する可能性があります。この、高クロロフィル濃度を特徴とするグリーン成長期から、アスタキサンチンに富むストレス誘発期への移行は、アスタキサンチン収量の最大化に有益です。このことは、 H. pluvialis の栽培におけるストレス応答と色素産生動態の代理としてクロロフィルレベルをモニタリングすることの重要性を強調しています。

また、選択性が高いため限界は少ないものの、酸化を防ぐために抽出物を光から遠ざけたり、バイオマス残渣の濁りをなくすために遠心分離したサンプルを慎重に扱うなどの注意点が不可欠です。さらに、この分析法の欠点は、特に希釈培地やフラスコレベルでの長期キネティック研究の場合、比較的大量のサンプルが必要であることであり、これは物流上の課題を引き起こす可能性があります。これらの考慮事項は、微細藻類研究におけるクロロフィル分析技術の有効性を最大化するために、慎重な実験設計とサンプルの取り扱いの重要性を強調しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C3H6O	Meyer	67-64-1	アセトン90%
15 mLチューブ	Biologix	10-9502	試験管
2510-DTH	ブランソン	D-73595	ソニケーター
5mLスクリューキャップ試験管	Kimax	45066-13100	試験管
50mL遠心分離管	Biologix	10-9151	試験管
アルミホイル	レイノルズ	611標準、12インチx 1000フィート	試験管カバー
CaCl2	Meyer	0925-250	塩化カルシウム
遠心分離機	Dynamica	14 R	遠心分離機
冷蔵 CoCl2	Merck	1057-100	二塩化コバルト
FeCl3	Merck	157740	塩化鉄(III) 塩化
物 K2HPO4	Meyer	2051-250	リン酸二カリウム
KH2PO4	Meyer	2055-250	リン酸一カリウム
MgSO4	Meyer	1605-250	硫酸マグネシウム
マイクロピペット	LabNet	モデル β-Pette	マイクロピペット
MnCl2	Merck		429449 塩化マンガン(II) 塩化物
Na2 EDTA	メルク	200-449-4	エダタミル、エデタト二ナトリウム塩二水和物
Na2MoO4	メルク	243655	モリブデン酸ナトリウム
NaCl	Meyer	2365-500	塩化ナトリウム
NaNO3	Meyer	2465-250	硝酸ナトリウム
RGB LED ストライプ	Steren	GAD-LED2	ライトソース
分光光度計	パーキンエルマー	モデル ラムダ35	分光光度計
分光放射計	ギガヘルツ・オプティック	モデル BTS256
ボルテック	ス・サイエンティフィック・インダストリー	ズ ボルテックス・ジーニー® 2	ボルテック
ス ZnCl<サブ>2	メルク	208086	塩化亜鉛