極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

Summary

このプロトコールは、 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)を例に、サンプル調製の最適化を通じて不均一な粒子分布に対処する実用的な方法を提示し、研究者が極低温電子顕微鏡(クライオEM)を使用して高分子構造を効率的に解明するための参考資料を提供します。

Abstract

極低温電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)は、ガラス質の氷に懸濁した天然に近い条件での高分子構造の研究を可能にすることにより、構造生物学に革命をもたらしました。この技術により、結晶化を必要とせずにタンパク質やその他の生体分子を高解像度で可視化することが可能となり、その機能とメカニズムについて重要な洞察を得ることができます。近年の単粒子解析の進歩と計算データ処理の改良により、クライオ電子顕微鏡は現代の構造生物学において不可欠なツールとなっています。クライオ電子顕微鏡は、その採用が進んでいるにもかかわらず、その有効性を制限する可能性のある永続的な課題、特に粒子分布の不均一さに直面しています。この問題は、多くの場合、再構築されたタンパク質構造の分解能の低下や精度の低下につながります。この記事では、 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)由来の小さな熱ショックタンパク質を例に、この課題に対処するためのシンプルで実用的なアプローチを概説します。この分析法は、サンプル調製を最適化して優先的な吸着を最小限に抑え、より均一な粒子分布と高品質のタンパク質クライオ電子顕微鏡構造を確保します。この手法は、構造研究における同様の課題の克服を目指す研究者にとって貴重なガイダンスを提供します。

Introduction

装置ハードウェア^1,2と画像処理ソフトウェア^3,4,5の最近の進歩により、極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、現代の構造生物学において人気があり強力なツールとして浮上しています。これらのブレークスルーにもかかわらず、クライオ電子顕微鏡を使用して高分解能の高分子構造を実現するには、依然としてボトルネックがあります。そのような重要な課題の1つは、主に空気-水界面^6,7,8,9で観察される配向選好現象を含む不均一な粒子分布である。

サンプルのガラス化中、一部の分子はグリッド上の特定の軸に沿って整列する傾向を示します。これにより、最終データセットのパーティクル ビューの分布が不均一になります。特定の配向性が過大評価され、他の配向性が過小評価されたり、完全に欠落した....

Protocol

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. タンパク質精製

1. 大腸菌BL21(DE3)における組換えMjsHSP16.5の発現を誘導し、前述の²⁶と同様にニッケルキレートクロマトグラフィーカラムを用いてタンパク質を精製する。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム²⁶で精製した後、5 μLのピークフラクションを12.5% SDS-PAGEゲルにロードし、標準的なクマシーブルー染色²⁸で可視化することにより、タンパク質の純度を調べます(図2)。
2. MjsHSP16.5を含むプール画分を、分子量カットオフが50 kDaの遠心フィルターを使用して、4°Cで約65 mg/mLに濃縮します( 材料表を参照)。
   注:遠心分離中は、タンパク質の凝集を防ぐために、5分ごとにタンパク質溶液を静かにピペットで分注してください。
3. 濃縮後、サンプルを 16,000 x g で 4 °C で 10 ....

Results

MjsHSP16.5の最適なグリッド条件を特定するために、主にさまざまなタンパク質バッファー条件の調査に焦点を当てた最初のクライオEMスクリーニングが実施されました:(1)MjsHSP16.5の安定性と均質性を確保し、その結晶化に重要な最終精製^{バッファー30};(2)高品質のMjsHSP16.5結晶の成長に必要な条件から適応した^{バッファー30};(3)以前にMjsHSP16.5^31,32の電子顕微鏡(EM)研究で使用されたバッファー。

バッファーの最適化(ステップ3で説明したマイクロダイアリシスボタンを使用したバッファー交換)と並行して、ステップ4で概説したように、グリッドの表面電荷を変更するために、さまざまなグロー放電パラメータを調べました。グリッドは、放電されないまま(疎水性)か、グロー放電されて、負または正の電荷を持つ親水性の表面を作り出しました。バッファやグリッドの電.......

Discussion

すべてのタンパク質構造研究は、タンパク質の精製から始まり、タンパク質ターゲットを高純度かつ均一に単離しながら、その本来の機能を維持するための反復プロセスです。タンパク質サンプルを精製および保存するためのバッファー組成は、精製プロセス中に慎重に選択されますが、これらのバッファーは、その後のクライオ電子顕微鏡サンプル調製およびイメージング中に頻繁に課題をもたらします⁶。この問題は、バッファーの成分と最適なクライオ電子顕微鏡分析の前提条件との間の不一致から生じ、したがって、タンパク質貯蔵バッファーを効果的なクライオ電子顕微鏡分析に適したものに最適化するという重要なステップが必要になります。しかし、各タンパク質が独自の構造的および機能的特徴を持っているため、万能のアプローチは存在しない²⁴。したがって、最適なサンプル調製は、調査中の特定のタンパク質によって異なる場合があります。

タンパク質は基本的に特定のpH範囲内で安定性を示す.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL丸底チューブ	SPL Life Sciences	40114
250 µL ガスタイト シリンジ モデル 1725 LTN	ハミルトン	81100	セメント針、22s ゲージ、2 インチ、ポイント スタイル 2
50 & マイクロ;L透析ボタン	ハンプトンリサーチ	HR3-326
50 mLガラスビー	カーDIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット	ミリポア		UFC905024 50-KDa NMWL
Bradford 試薬	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
マイクロ遠心チューブ 1.5 mL	HD マイクロ	H23015
PCR チューブ 0.2 mL、フラットキャップ	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow グロー 放電ユニット	Ted Pella	91000
PELCO TEM グリッドホルダーブロック	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 メッシュ、Cu	電子顕微鏡科学	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC 透析メンブレンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	086705B	3500 ダルトン MWCO
スーパース 6 増加 10/300 GL	サイティバ	29091596
酢酸ウラニル	メルク	8473
Vitrobot Mark IV	サーモフィッシャーサイエンティフィック	VITROBOT
VitroEase バッファー スクリーニング キットと洗剤	サーモフィッシャー サイエンティフィック	A49856