方法論記事

馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用

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DOI：

10.3791/67244

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

この記事について

サマリー

腸内グリアは、腸の恒常性や術後合併症を含む疾患プロセスにおける役割についてますます認識されるようになっています。緊急の探索的開腹術から回復した馬の患者は、炎症性術後疾患のリスクが高いことに苦しんでおり、研究のために再現性のある馬の腸内グリア初代細胞培養を確立することの重要性が強調されています。

要約

ウマ疝痛(急性腹部)の炎症性術後状態は、クライアントの費用、患者の不快感、入院時間の増加に寄与するだけでなく、多くの場合、生命を脅かすことが証明されています。腸内細胞のユニークな集団である腸内グリアは、胃腸環境を感知し、周囲の細胞タイプとコミュニケーションをとる役割についてますます認識されています。腸内グリアと腸上皮との間の相互作用は、馬の腸内グリアが粘膜バリアを変化させて健康と疝痛の炎症を調節する方法を確立する上で重要であることが証明される可能性があります。

この相互作用を研究するために、ウマ空腸から一次ウマ腸グリア培養を確立し、培養物を疝痛に存在することが知られている炎症状態にさらす方法を提示します。一次腸管グリア培養物は、疝痛とは無関係の理由で安楽死させた成馬から得られた。腸絨毛と固有層をマイクロ解剖して粘膜下層を露出させました。単離された粘膜下組織体は、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびウシ血清アルブミンによる酵素消化を2〜3時間受けました。次に、遠心分離、ピペッティング、および細胞ストレーナー(40-100 μm)を含む機械的消化により、0.05 mg/mLのポリ-L-リジンコーティングウェルに~400,000細胞/300 μLの培地の濃度でプレーティングするために使用されるペレットが得られました。

コンフルエンスと最初の継代に続いて、腸管グリア細胞をウマ組換えIL-1β(0、10、25 ng)に24時間曝露しました。疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するために、コントロールまたは治療された腸グリアのいずれかによって調整された培地を、二重電極EndOhmチャンバーを使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定しながら、コンフルエントなウマ空腸単層に直接追加しました。これらのデータは、ウマの腸管グリア培養の多くの潜在的影響力のある応用の1つに過ぎません。

概要

馬の疝痛は、緊急相談のための最も一般的な医学的提示の苦情です1。これらの馬の最大17%が外科的矯正を必要としているため、術後の転帰を増やすための努力は、馬の医学研究の最前線にあるべきです2。現在、術後疝痛患者は、敗血症/内毒素ショック(患者の12.3%)や術後イレウス(患者の13.7%)3など、生命を脅かすいくつかの障害のリスクが高くなっています。術後合併症の治療は進んでいるものの、これらの疾患の予防や治療には高度な治療法が引き続き求められています。

最近の研究では、疝痛患者の局所的および全身的な炎症状態が強調されています4.例えば、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターロイキン1β(IL-1β)、インターロイキン6(IL-6)、単球化学誘引性タンパク質-1などの炎症誘発性タンパク質は、いずれも正常な腸組織と比較して、疝痛腸粘膜における発現が有意に増加することが示されている4。全身の観点から、腸組織における TNF アルファの増加は、術後経鼻胃逆流のリスク増加と相関していることが実証されています 2 L を超える、術後の運動障害の一般的な測定値 4.また、インターロイキンIL-1βおよびTNFαの投与は、敗血症性ショック5の臨床徴候を誘発することができることも知られている。

疝痛腸組織の炎症状態とその術後合併症との関連についての潜在的な説明は、腸上皮バリアです。健康では、腸管を覆う円柱上皮の単層をつなぐタイトジャンクション複合体は、管腔内容物とその細菌成分が粘膜下腔と血流に到達するのを制限する機能的な障壁を提供します。しかし、手術中の疝痛に伴う腸閉塞や腸管操作による膨満感や損傷により、この腸バリア機能が乱れる可能性があります。

腸壁全体の機能的構成要素に関しては、腸神経系内の粘膜下腸管グリアネットワークは、炎症経路に関連する術後合併症の病態生理学的進行に重要であることが示されており、特定の治療標的を提供する可能性があります6,7,8,9 .腸内グリアは、胃腸管全体に存在するだけでなく、腸内環境のセンサーとして働き、腸壁の多数の細胞タイプでシグナル伝達に影響を与え、腸バリア6を直接調節します。したがって、これらの腸の強力なセンサーは、損傷や炎症によって活性化され、バリア透過性の変化などの急性反応を引き起こす可能性があると推定するのが妥当です。

この研究は、ウマの腸内グリアの培養、より具体的には、炎症性ウマ腸グリアが腸のバリア機能に果たす役割について説明した最初の研究です。ここでは、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養法と炎症性IL-1βへの曝露に対する反応、IL-1β曝露後の腸グリア生成物がウマ腸細胞単層の透過性に及ぼす影響の評価、およびウマ血清の適用による遮断の可能性について紹介します。

プロトコル

馬の腸管グリア初代培養物は、この研究とは無関係の理由でバルビツール酸の過剰摂取で人道的に安楽死させた3頭の馬から得られました。培養研究のために選択された馬は、胃腸疾患の現在の病歴がない成馬でした。

1.粘膜下、ウマ、腸内グリア、一次培養

  1. 3頭の別々の成馬馬から得られた空腸陰窩から馬の上皮単層を成長させます。
    1. 24ウェルプレートをコーティング溶液で37°Cで2時間または室温で一晩コーティングし、滅菌水で2回洗浄し、細胞がプレーティングの準備ができるまで室温で保存します。
    2. 人道的な安楽死に続いて、60分以内に空腸の一部を取り出し、氷の上の冷たいリンガー溶液に入れます。
    3. 空腸から10cmの部分を取り出し、非リンパ領域を組織の中心に保つために、無腸境界で開きます。部分を約7cmx7cmのセクションにトリミングします。解剖する前に、新しいリンガー溶液で組織をよくすすいでください。
    4. シリコンエラストマーでコーティングされたペトリ皿に組織を冷たいリンガー溶液またはPBS粘膜面を上にして固定し、組織をできるだけ伸ばします(図1A)。
    5. 湾曲した鉗子(図1B)で腸絨毛を切除し、続いて約5 cm x 5 cmの非リンパ領域(図1C)から固有層層を切除します。
      注:これらの層は粘膜下組織から容易に分離します(図1B)。
    6. 粘膜下組織を片方の角にあるマイクロダイセクションハサミで解放して1枚のシートから取り出し、空腸の内側の円形筋層から粘膜下組織を剥がしながら自然な分離を観察します(図1D)。
    7. 採取した粘膜下層を2〜5mmに細かく刻み、5mLの「Organo-FBS」(表1)、0.825mgのコラゲナーゼ、5mgのプロテアーゼ、および20mgのウシ血清アルブミンを含む50mLの円錐管に入れます。組織を37°Cで2〜3時間インキュベートし、酵素消化します。
    8. インキュベーション後、室温の「オルガノ+FBS」を10mL加えて酵素の作用を停止します。10 mLの血清学的ピペットで組織混合物を約15回上下にピペットで動かし、組織から細胞を解離した後、室温で3,000 × g で3分間遠心分離します。
    9. 上清を廃棄し、10 mLの血清学的ピペットで約15回ピペッティングを再び上下させて、ペレットを10 mL室温PBSで再懸濁し、組織から細胞を解離します。
    10. コニカルチューブを3,000 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を捨て、10 mLの血清学的ピペットで約15回ピペッティングして、室温の「Organo + FBS」でペレットを再懸濁し、組織から細胞を解離します。
    11. 100 μm、70 μm、40 μmの細孔サイズのセルストレーナーで細胞を連続的にろ過します。
    12. ろ過した細胞と培地を3,000 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを「オルガノ+FBS」1mLに再懸濁します。
    13. トリパンブルーで染色して生細胞を同定し、血球計算盤でカウントします。
    14. 24ウェルプレートの各ウェルで、300 μLの「Organo + FBS」に約400,000個の細胞をシードし、各ウェルに成長因子(N2 5 μL/ウェル、G5 5 μL/ウェル、B27 10 μL/ウェル)を添加します。24ウェルプレートを5% CO2 を入れた37°Cインキュベーターに置き、細胞を接着させます。24時間後、メディアを上記の成長因子を持つ「グリアメディア」(表1)に交換し、48時間ごとに交換します(図2)。

2. 免疫蛍光細胞診

  1. 腸管グリア細胞を初代培養(P0)(ステップ2.1.14)から70〜80%のコンフルエントまで増殖させ、それらを1回継代します(P1)。
  2. 0.1% PBSアジドを塗布する前に、4%パラホルムアルデヒドを使用して1次培養(P0)細胞をウェル内で5分間固定します。
  3. PBSアジド、4%ロバ血清、および0.5%Triton-Xからなる飽和溶液を調製します。300 μLの飽和溶液をウェルに加え、室温で2時間細胞を透過処理します。
  4. グリアマーカーの一次抗体であるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)と線維芽細胞マーカーの一次抗体であるα平滑筋アクチンを飽和溶液で1:1,000希釈で添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。
  5. ロバ抗ウサギIgG Alexa Fluor 594およびヤギ抗マウスIgG Alexa Flour 488の二次抗体を添加する前に、PBSで3回洗浄し、飽和溶液で1:500希釈して2〜3時間。
  6. 核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でPBSで1:1,000希釈して5分間染色します。
  7. PBSで3回洗浄した後、細胞を0.1%PBSアジドに保存します。

3. 粘膜下、ウマ腸内グリア、初代培養IL-1β曝露

  1. 最初の継代(P1)の細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、IL-1β曝露実験を行う。ウェルを0 ng、10 ng、および25 ngのIL-1βに24時間さらします。24時間後、各ウェルからの培地を-80°Cで保管し、保存します。

4. 腸細胞単分子膜の作製のためのウマオルガノイド培養

注:2018年に発表されたStewartらのプロトコルに従って、バンク化された馬の腸の陰窩と凍結バンクされた芽は、2Dエンテロイド研究10のために拡張されました。

  1. トランズウェルインサートあたり約700〜1,000個の芽/陰窩フラグメント(単一細胞に解離した場合は40,000〜50,000個の細胞)を使用します。腸細胞を添加する前に、トランズウェルインサートに42μLの0.05%マトリゲルをコーティングします。マトリゲルをインサートに固定するには、37 °Cで1時間インキュベートします。余分な培地を吸引し、トランズウェルを蓋なしで30分間乾燥させます。各トランズウェルインサートに200 μLのDMEM-F12培地を加え、プレートを37°Cで保存して使用します。
  2. オルガノイドを含むマトリゲルパテをPBSで洗浄し、氷上で500μLの細胞回収にさらします。それらを繰り返しピペットで動かして、細胞が15 mLチューブに完全に収集されるようにします。
  3. チューブを300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去し、腸管上皮幹細胞(IESC)培地の目標容量に細胞ペレットを懸濁します。目的の単分子膜の数に200μLの培地を掛けて、目標体積を計算します。(表1)。
  4. 1 mLシリンジをIESC培地にプレコートし、16 Gの針で細胞懸濁液を吸引します。16 Gの針を28 Gの針に交換し、細胞懸濁液を排出してオルガノイドの分離を促進します。
  5. 得られた細胞懸濁液の200μLを被覆したトランズウェルの頂端側に、500μLのIESCおよび前述の成長因子をトランズウェルインサート10の基底側に置く。コンフルエンスに達するまで、24〜48時間ごとに培地と成長因子を交換します。コンフルエンスは、1,000 Ωsxcm 2,11 の TEER に対応するセル密度として定義します。測定については、ステップ5.1を参照してください。

5. 炎症性サイトカインおよびウマ腸グリア産物への曝露後のウマ腸細胞単層透過性

  1. 二重電極TEER測定チャンバーを使用して、単層全体のTEERを定量化し、各トランズウェル透過膜全体のベース読み取り値を確立します。測定を行う前に、IESC媒体とトランズウェルが室温になるまで15分かかることを確認してください。カルチャーカップに1.5 mLのIESC培地を満たし、トランズウェルインサート内に正確に200 μLの培地が存在することを確認して、測定時に流体ラインが一致するようにします。
  2. トランズウェルインサートの基底外側を、ウェルあたり25 ng IL-1β、10 ng、および25 ngのインターロイキン6(IL-6)の炎症性サイトカイン、または10 ngまたは25 ngのIL-1βに曝露した培養物のグリア産物に曝露します。コントロールトランズウェルインサートの基底外側をグリア培地に、およびIL-1βに曝露されていない培養物からのグリア培地に曝露します。
  3. 各トランズウェルを培養カップに入れて、10〜15分間隔でTEERを45分間測定します。

6. 統計学

  1. 各トランズウェルのTEERの時間軸変化を、0分、10分、20分、30分、45分で計算します。
  2. 選択したソフトウェア( 資料表を参照)を使用して、減少したTEERとIL-1β(25 ng)、IL-6(10 ng、25 ng、および100 ng)、およびグリア培地(0 ng IL-1β、10 ng IL-1β、および25 ng IL-1βに曝露)への基礎側曝露との相関を比較し、不対応の片側 t検定を使用して培地を制御します。

結果

ウマの空腸を粘膜下層までマイクロダイセクション(図1)すると、さらに酵素的および機械的消化が行われ、ウマの腸グリアの生存細胞培養が可能になる可能性がある。細胞は、他の種の腸管グリアと一致する紡錘形細胞の優勢を伴う多形性を示しました(図2A)。培養物は、選択的グリアマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)に対して陽性であり、線維芽細胞の汚染は低かった(α SMA、 図2B)。場合によっては、粘膜下層の顕微解剖が十分に制御されておらず、線維芽細胞マーカーである平滑筋アクチンの免疫蛍光法により観察された高割合の線維芽細胞で培養物が汚染されていました(図3)。

次に、ウマ腸グリア培養の有用性の例として、IL-1βに曝露された腸グリアが腸管上皮バリア機能に及ぼす影響を評価した。10 ngおよび25 ngのIL-1βに24時間曝露されたウマ粘膜下腸グリア培養物からの培地への基底外側曝露は、透過性を有意に増加させた(それぞれp = 0.05および0.04、対照培地の平均= 0.9、グリアの平均10 ng IL-1β群= 0.8、95%信頼区間= -0.2〜0.02、グリアの平均25 ng IL-1β群= 0.8、 95%信頼区間 = -0.1995 〜 0.01060、n = 3-4) (図 4A)。しかし、IL-1βに曝露された腸内グリアによって産生され、げっ歯類モデル12において腸細胞透過性の増加を誘導することが実証された炎症性サイトカインである基底外側10〜25 ngのウマIL-6へのウマ上皮単層の曝露は、ウマ腸細胞単層透過性を有意に増加させませんでした(図4B)

figure-results-1
図1:マイクロダイセクションと酵素的および機械的消化によるウマ空腸からの腸グリアの分離 (A)空腸は無腸境界に沿って切断され、粘膜側を上にして固定されました。(B)腸絨毛を顕微鏡で視覚化し、細い固有層が視覚化されるまで穏やかに掻き取って除去しました。(C)次に、平滑筋線維が半透明の粘膜下層を通して見えるようになるまで、固有層を除去しました。(D)粘膜下組織をテントで張って筋肉層から剥がし、必要に応じて繊維状タグに切り込みを入れました。画像は10倍解剖顕微鏡(B、C)で取得しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:ウマの粘膜下腸グリア培養物のイメージング (A)ウマ腸グリアの星状(矢印)、紡錘状(開いた矢印)、および神経節(閉じた矢印)の形態は、位相差顕微鏡によって評価されました。(B)培養物の純度はGFAPの染色により評価し、線維芽細胞マーカーについては平滑筋アクチンスケールバー= 100 mm(A)、400 mm(B)で評価しました。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:失敗したウマの粘膜下腸グリア培養のイメージング。 培養物の純度は、GFAP(赤)および線維芽細胞マーカーである平滑筋アクチン(緑)の染色によって評価され、線維芽細胞汚染の割合が高いことが示されました。黄色の矢印はGFAPを示し、白い矢印の先端は平滑筋アクチンを示します。スケールバー= 400 mm。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:炎症性サイトカインおよび炎症性グリア製品への曝露後のウマ上皮単層TEER. (A)ウマ粘膜下腸グリア培養物からの培地への基底外側曝露は、10 ngおよび25 ngのIL-1βに24時間曝露され、透過性が有意に増加した(*p = 0.05および0.04、それぞれ、n = 3-4)。(B)ウマ腸細胞単層の基底外側25 ngのIL-1βおよび10-25 ngのウマIL-6への急性曝露は、ウマの上皮単層透過性を有意に増加させなかった(n = 2-4)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:単離および培養用の試薬。 以下の試薬を使用して、ウマ腸グリア単離、腸グリア培養、およびウマ腸上皮幹細胞培養用の培地を調製しました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究の目的は、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養の再現性のある方法を開発し、疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するためのその応用を実証することでした。腸内グリアの分離と培養は、ウマでは新規であり、ブタとげっ歯類のモデル、およびヒトの腸疾患経路を理解するのに有益であることが証明されています6,7,13,14。この細胞集団の研究は、腸内環境の上皮下センサーとしての役割と、腸壁内の周囲の細胞と相互作用し、通信する能力があるため、潜在的に重要です。彼らの鋭い感知能力により、腸組織が膨張、虚血、および潜在的に外科的操作によってストレスを受ける馬疝痛におけるグリアの潜在的に重要な役割を想像することは難しくありません6。

Lisowskiらによる以前の研究では、疝痛手術時のウマ腸組織の炎症状態が亢進していることが示されました。この炎症環境を緩和することの重要性は、腸のバリア機能を破壊する能力を持つ製品を合成できることが証明されているげっ歯類の腸内グリア培養物によって強調されています7,12。腸管腔の内容物が腸壁に漏れると、炎症反応を引き起こすだけでなく、循環器内に浸潤する可能性があり、それがエンドトキセミックショック/敗血症を引き起こす可能性があります。馬の疝痛術後患者は、残念ながら、敗血症や術後イレウスなど、多数の炎症性術後合併症に悩まされており、生存率と患者の快適性を低下させるだけでなく、クライアントのコストと精神的苦痛を増加させます3.疝痛時の上皮-グリア相互作用のモデルを確立すると、疝痛における馬の腸管バリア透過性の潜在的な経路が解明され、可能な予防法が明らかになる可能性があります。

ウマの粘膜下腸グリアの培養には、種の特性による適応と制限が含まれます。最も重要なことは、効果的な酵素消化に必要な時間の長さが滴定されたことです。その結果、この酵素と37°Cで2〜3時間インキュベートすることが、ウマの腸内グリアの単離を成功させるために必要であることが分かった。さらに、継代前にウマの腸内培養物が80%以上の合流点に達することを許すことは、培養生存率に有害であると思われます。この日付でのこの方法の主な制限は、サンプルサイズです。この研究には、研究に関連しない理由で疝痛手術または安楽死を受けた馬から得られた組織/細胞のみが含まれていました。追加の被験者からのウマ腸内グリアの継続的な培養、およびウマ腸グリアの凍結と保存のためのプロトコルの開発は、この研究の力を大幅に高めます。

この研究では、ウマの疝痛および胃腸疾患の理解に役立つ可能性のある方法論として、ウマの粘膜下腸グリア培養とウマ腸細胞の初代培養の新たな有用性を紹介します。また、単離された腸管内窩やオルガノイドから成長したウマの上皮単分子膜は、これまでも十分に確立されてきましたが、今回の研究は、モデルとしての有用性を引き続き示すだけでなく、ウマの腸内細胞や腸壁内に見られる他の細胞種との相互作用を調べるさらなる研究を後押ししています。

これらの細胞タイプ間で観察された相互作用には、疝痛および炎症性腸疾患(IBD)や大腸炎などの他の炎症性胃腸疾患の両方への潜在的な応用が含まれています。さらに、腸グリアと腸細胞の培養法の継続的な改良により、将来的に共培養研究を確立することができます。さらに、現在の研究は、上皮単層への近接性と腸のバリア機能に焦点を当てているため、粘膜下腸グリア集団に焦点を当てていますが、腸壁の筋腸神経叢からのウマ腸グリアの機能を培養および評価するために追加の作業が行われる可能性があります。これは、炎症性ウマ腸グリアが運動性に与える影響を決定するのに役立つ可能性があります15。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者は、このプロジェクトに資金を提供してくれたモリス動物財団に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 M HEPES バッファーGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4'6-ジアミニジノ-2-フェニルリンドールInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
アルファ平滑筋アクチン抗体アブカム7817
アムホテリシン BSigmaAA95294.4 g/mL ストックアリコート、最終濃度 1.1 & マイクロ;g/mL
抗酸化薬 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
ウシ血清アルブミンΣAA3311
BSA 50 mg/mL 原液ΣA3311
CaCL2ACROS Organiics 206791000馬のリンガーのコンポーネント's ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。
コラゲナーゼSigma9891
DMEM-F12 培地サーモフィッシャー11320033
ロバ 抗ウサギ IgG アレクサ フロー 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm デュアル電極 TEER-測定チャンバーワールド プレシジョン インスツルメンツEVM-EL-03-01
EVOMマニュアル TEER 測定ワールド プレシジョン インストゥルメントEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
ゲンタマイシン溶液SigmaG1272最終濃度 20 µg/mL
GFAP抗体Abcam4674
ヤギ抗マウス IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1&β;ELISAサーモフィッシャーESIL1B
KClサーモフィッシャーP330-500馬用リンガーのコンポーネントs ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。
L-グルタミン溶液Corning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2サーモフィッシャーM33-500馬のリンガーの成分s ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。
N2Gibco17502048
Na2HPO4サーモフィッシャーBP332-1馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。
NaClモフィッシャーS271-10馬リンガーのコンポーネント's ストック1:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック2を完成させる」リンガー's ソリューション」。
NaH2PO4サーモフィッシャーBP329-500馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。
NaHCO3サーモフィッシャーS637-212馬リンガーのコンポーネントs Stock 2:他の材料と組み合わせ、このストック100 mLをメスシリンダーに加え、脱イオン水で1Lに希釈します。5% CO2.
Combine with Equine Ringer' で pH を 7.4 に調整します。sストック1を完成させる」リンガー's ソリューション」。
ペン/溶連菌感染症Gemini400-109
Poly-L-lysineSigmaP26360.5 mg/mL in 1x ホウ酸バッファー
プリズムソフトウェアGraphPad
プロテアーゼSigmaP4630
重炭酸ナトリウム溶液SigmaS87617.5% ストック溶液
サー溶液

参考文献

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

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馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用
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