気道極低温空気吸入マウスモデルの確立

サマリー

寒冷環境刺激は、さまざまな慢性疾患の発症に関与しています。そのため、前臨床研究のための動物モデルを確立することが重要です。本システムは、このニーズに応えるため、病原性メカニズムに関する基礎研究の要件を満たす刺激モデルを作成するデバイスを提供します。

要約

現在、低温環境刺激のマウスモデルの構築には、低温熱プレートとウェアラブル冷却デバイスを採用しています。これらの方法は、低温刺激に対するマウスの皮膚または神経回路の応答と調節効果を研究するための要件を部分的に満たすことができます。数多くの臨床研究により、低温環境への曝露とさまざまな疾患の発症との相関関係が実証されています。近年、臓器や組織間の継続的な情報交換が注目され、人体の長年の課題に対する新たな視点が生まれています。しかし、既存の設備では、マウスが冷気を吸い込むモデルを構築することができません。

寒い環境にマウスを置くことは魅力的に思えますが、かなりの制限があります。マウスは冷たい空気を吸い込む一方で、皮膚も寒さによって刺激を受けているため、病理変化が離れた臓器の相互作用による肺の刺激によるものなのか、皮膚受容体や神経信号の伝達によるものなのかは不明です。これは、関連する研究にかなりの混乱を引き起こします。このスキームは、極度の冷気吸入刺激のためのマウスモデルを構築するための新しいアプローチを提供します。この装置により、マウスは体を常温に保ったまま、非常に低温のガスを吸い込むことができます。極端な周囲温度がマウスに及ぼす刺激効果のシミュレーションを最大化し、極端な環境温度と関連疾患との関係を研究するための研究ニーズを満たします。

概要

この方法は主に、非侵襲的で標準化された安定したバッチ式半導体冷凍温度フィードバックデバイスを使用して、マウスの超低温空気刺激モデルを提供します。低温に関する臨床実験では、様々な疾患の発症率や予後と密接な関係が確認されています。中国の272の主要都市を対象とした時系列研究では、合計1,826,186件の非事故死亡が得られた。気温と死亡率の関係は一貫して逆J字型の曲線を示しており、寒さによる死亡率が高いフェーズは他の温度よりも大幅に長くなります。これは、低温が脳卒中や心血管疾患に与える影響は、寒冷期に限らないことを示唆しています。寒冷期が治まった後の期間も、影響は継続します。

事故死以外の死亡者のうち、14.33%は環境温度要因によるもので、中程度の寒さ(-1.4〜22.8°C)と極端な寒さ(-6.4〜-1.4°C)がそれぞれ10.49%と1.14%を占めています。死因は、心血管疾患および脳血管疾患が17.48%、冠状動脈性心疾患が18.76%、虚血性脳卒中が14.09%、出血性脳卒中が18.10%、呼吸器系疾患が10.57%、慢性閉塞性肺疾患が12.57%^{となっています}1。中国では、脳卒中の疫学研究は、北から南への明確な勾配を示唆しています²。中国北東部の極寒の気候では、脳卒中の有病率は南部地域と比較して2.36倍高くなっています³。実質的な研究により、低温環境が死亡率と脳卒中の発生率に直接的な影響を与えることが確認されています^4,5,6。したがって、気候の大きな温度差は、無視できない環境要因を表しています。

低温環境と脳卒中や心臓の問題の発生率の増加との相関関係を説明する効果的な科学的推論の欠如は、依然として調査対象のトピックです。従来の知恵では、低温は皮膚の炎症や交感神経の興奮を通じて血圧を上昇させる可能性があることが示唆されています^が7、個人は通常、寒さに応じて自分自身を断熱し、体温の平衡を維持するための措置を講じます。低温にさらされると、現代人は主要な防御メカニズムとして皮膚ではなく呼吸器系に依存しています。厚手の衣服は皮膚を外部の寒さから守ることができますが、気道に冷たい空気を吸い込み、気管や肺胞を強烈な寒さの刺激にさらすのを防ぐことはできません。現在の低温刺激動物モデルの構築方法は、大きく分けて2つの側面に分かれています。まず、低温刺激に対するマウスの皮膚の応答と調節メカニズムを調査することに多くの研究が焦点を当てています。1つの方法は、温度変化を制御できるプレート(4-25°C)にマウスを置くことを含み、寒冷刺激^8,9に応答した体温調節および回避行動の特定の調節メカニズムを調査する。他の研究では、体温調節における神経回路の役割を探るために、マウスの背中に冷却装置を取り付けました¹⁰。

逆に、いくつかの研究では、マウスを可変温度(4〜30°C)の小さなチャンバーに配置しました。LalらとQianらによる研究では、この方法を使用して、寒冷刺激のマウスモデルを構築し、寒さによる摂食行動の神経内分泌制御を調節する神経回路を探索しました^11,12。ただし、前述の 2 つの方法には制限があります。まず、最低温度は4°Cであり、極端な低温の空気刺激をシミュレートするには不十分です。この方法では、寒冷環境に対する皮膚と神経回路の調節効果を排除することはできません。空気交換の主要な部位として、肺は寒さに敏感なニューロンが集中している器官でもあります^13,14。さまざまな疾患における寒冷感受性ニューロンの調節的役割も、いくつかの研究者によって確認されています15,16,17。その結果、気道低温動物モデルを安定的に、大規模に、そして規範的に構築するための方法が急務となっています。極低温空気刺激下での様々な慢性疾患における肺と寒冷感受性ニューロンの制御役割を理解することは、寒冷地における脳卒中、冠状動脈性心疾患、呼吸器系疾患の予防と治療のための理論的基礎を提供するために不可欠です。私たちのチームは、過去2年間で低温デバイスを構築することで、この重大なギャップに対処しました。このデバイスは、再現性、実用性、シンプルな構造、低コストを特徴としており、このような研究に適しています。

プロトコル

実験動物倫理委員会は、ハルビン医科大学第一附属病院の動物を対象とするすべての手続きを承認しました。

1. 装置の組み立て

メモ: デバイスのコンポーネントについては、 図 1 を参照してください。

1. 金属コネクタを使用して、2セットの真鍮シェルを2セットの半導体冷却チップに固定します。真鍮シェルと半導体冷却チップの間に熱伝導性シリコーングリースを塗布します。
2. 真鍮シェルと半導体冷却チップの間にサーマルグリースを塗布します。
3. 下の半導体冷凍部品の各部分に2つのファングループを接続します。真鍮シェル、ファン、半導体冷却チップ、および熱伝導性シリコーングリースが完全なユニットとしてしっかりと接続されていることを確認します。
4. デバイス全体をガス収集ジャーとスロットの2つのカバープレートに入れます。
5. プレートをガス収集ジャーの上下に取り付けます。
6. 給水管と出水管をそれぞれ真鍮シェルの給水口と出水器に接続します。
7. 真鍮製のシェルの4つのグループをパイプでガス収集ジャーの上部と下部に接続します。
8. ウォーターポンプをウォーターインレットパイプに接続します。
9. 排水管を貯水槽に入れます。
10. 4セットの半導体クーラーとウォーターポンプを2セットの電源(12Vと40A)に接続します。

2.実験のための動物の準備

注:これらの実験には、4週齢のC57Bl/6雄マウスを使用しました。モデル調製の3〜5日前にマウスを固定具に順応させることをお勧めします。実験環境は室温で、実験全体を通して騒音を避けるために静かに保つ必要があります。

1. マウスを固定具に固定する: マウスを固定具に置き、マウスの鼻の前部を固定具の開口部に配置します。対応するスポンジプラグを使用して、固定具の後部を埋めて固定し、通気孔があることを確認します。次に、マウス固定具をガス収集ジャーの円筒形スロットに入れます(図1D)。

3. 実験運用の流れ

1. 氷と水の混合物を準備し、貯水槽に入れます。
   注:このステップでは、氷と水の混合物の水位がポンプよりも高いことを確認して、混合物が実験全体を通して時間内に追加されるようにします。室温で水を使用することはお勧めしません
2. ウォーターポンプを氷水混合物内に配置して、出口ホースが水没していることを確認します。
3. 温度センサープローブをガス収集ジャーの温度測定穴の中に入れます。
4. ウォーターポンプを電源に接続し、電源を入れます。
5. 電源を温度コントローラーに接続し、冷凍ユニットの電源アダプターを温度コントローラーの電源ソケットに差し込み、コントローラーで希望の温度範囲を設定します。
6. 温度コントローラーの温度範囲を設定します。
7. 実験後、マウスを取り外してハウジング環境に戻します。
8. 温度コントローラーへの電源を切ります。
9. ウォーターポンプの電源を切ります。

4.サーマルイメージング

注:マウスがこの装置内で正常な体温を維持しながら非常に低温の空気を吸い込むことができることを実証および確認するために、ガス収集ジャー内の温度を熱画像カメラを使用して測定しました(図2)。

1. ハンドヘルド赤外線カメラを使用して、ガス収集ジャーの空気穴と温度測定穴の両方の温度を最適な距離から確認します。
2. 測定場所を示す赤いレーザーポイントを、指定された温度測定エリアの中心に正確に配置します。
3. 同じ方法を使用して、マウスの体温を再測定します。

結果

半導体冷凍チップ、熱伝導性シリコーングリース、ガス収集ジャー、温度コントローラー、ファン、水冷循環システム、マウス固定具、電源アダプターなど、このデバイスの全体的な構造を観察できます。1つのユニットで最大16匹のマウスのモデリングニーズに同時に対応できます(図1A、B)。本体には、ガス回収ジャー、水冷循環システム、半導体冷凍チップ、ファン、マウス固定具が構成されています(図1C)。デバイスの本体内部では、マウス固定具の前端をガス収集ジャーに挿入できるため、マウスの鼻が低温ガスを直接吸い込むことができます(図1D)。デバイスの本体の内側の上部には4セットのファンがあり、ファンの裏側は熱伝導性シリコーングリースを介して半導体冷凍チップに接続されています(図1E)。マウス固定具は、装置と組み合わせて使用され、円筒形で、フロントエンドはガス収集ジャーに拡張可能です。固定具には、中央に通気孔があり、背面には固定用のプラグがあり、さまざまなサイズのマウスの固定要件を満たしています(図1F)。

実験中、プロトコルステップ3.3で詳述されているように、通常、温度センサープローブを使用して、ガス収集ジャー内の温度をリアルタイムで継続的に監視します。マウスが本装置内で体温を正常に保ちながら極低温の空気を吸い込むことができることを実証・確認するため、ガス回収ジャー内の温度を赤外線カメラで測定しました(図2)。ガス収集ジャー内の温度は約-20°Cであることが観察されました。 その結果、拘束装置内のマウスの体温は影響を受けなかったことが明確に示されました。その結果、この装置により、マウスは体温を正常な状態に保ちながら、極低温のガスを吸い込むことができることが確認されました。現在、複数の研究者が、極低温条件下での慢性疾患の影響と病態メカニズムに注目しています。本装置は、そのような研究のニーズを満たすことができます。この装置を適用することで、安定した動物モデルを構築することができ、その後の研究のための強固な基盤を築くことができます。

図1:装置の全体構造と各部品の分解図(A)実験状態における装置全体の表示。(B)デバイス全体の上向きの図は、ガス収集ジャーの底に2セットの半導体冷凍シートと真鍮シェルを示しています。(C)ガス収集瓶の部分拡大画像。(D)タンクの上部装置の局所的に拡大された画像を削除した後、実験中にマウス固定具のヘッドエンドを瓶に伸ばすことができ、マウスの鼻のみが低温環境にさらされることを確実にすることができることが観察できる。(E)ファンの拡大写真。(F)マウス固定装置の画像は、装置のヘッドエンド、通気孔、およびテールの接着剤プラグを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:デバイスの動作中の冷却効果の監視図。 (A)遠赤外線温度計の監視下では、装置全体を低温状態で観察することができます。(B) 実験中にマウスホルダーが置かれている換気口の温度を遠赤外線温度計で測定すると、ガス回収キャニスター内の温度は-21.1°Cであることが観察できます。 このデバイスは、当社の設計要件を満たしています。(C)実験では、マウスを装置から取り出し、遠赤外線温度計を用いてマウスの鼻と体の温度を測定しました。その結果、マウスの鼻の温度は有意に低く、体内の温度は正常なままであることが示されました。(D)実験装置の上部に温度測定穴を開ける。遠赤外線温度計を用いて、温度測定穴から集ガスジャー内の温度を測定したところ、集ガスジャーの内部温度は-21°Cであり、低温研究に利用できることが証明されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

低温刺激モデルの構築では、実験の精度と動物の福祉を確保するために、いくつかの重要な手順と予防措置が必要です。室温の水の代わりに氷水の混合物を使用して、実験全体を通して冷却水の低温状態を維持し、非常に低温の環境をシミュレートするのに役立ちます。冷凍システムの効率的な運用を確保するために、再循環冷却水システムが遮られていないことを確認してください。氷と水の混合物を準備するときは、次の点を考慮してください:(1)氷と水の混合物とは、固体の氷の下に固体の氷があり、固体の氷の上に水があることを意味します。(2)実験中は、固体の氷が溶ける過程を注意深く観察してください。このような浮氷は、ポンプの表面を塞ぎ、効果的な熱放散を妨げる可能性があります。実験終了時には、ウォーターポンプの手前で冷凍ユニットの電源を切ります。これにより、再循環水システムは、シャットダウン後も冷凍半導体から熱を放散し続けることができ、結果に影響を与える可能性のある急激な温度上昇を防ぐことができます。温度監視のために、このデバイスはインテリジェントな温度コントローラーを使用します。デバイスの電源はインテリジェント温度コントローラーに接続され、コントローラーを使用して温度範囲を設定します。実験中、温度プローブをガス収集ジャーに入れて、温度変化を連続的に監視します。温度が設定範囲を超えると、コントローラーは自動的にデバイスの電源を切断して、温度を設定範囲内に維持します。

実験中に冷凍効率が大幅に低下した場合、または冷凍装置が故障した場合は、次の可能性を考慮してください:(1)ポンプが氷水混合物内にあることを確認します。(2)水温が極端に高いか確認してください。(3)半導体冷凍シートに損傷がないか検査します。(4)半導体冷凍シートの電源接続ラインが断線していることを確認します。

このデバイスには制限があります。実験中、半導体冷凍シートを冷却するために大量の氷水混合物が必要であり、デバイスの冷却効率は半導体冷却チップの冷却効率に影響されます。将来の改善には、ウォーターサイクル冷凍装置を閉ループ装置として設計し、冷却媒体として冷凍液または不凍液を使用することが含まれる可能性があります。同時に、機器の外観を最適化し、パイプラインや電力接続ラインのむき出しの漏れに対処することで、デバイスの持ち運びと普及の利便性が向上します。さらに、マウスによる低温ガスの吸入を一定かつ安定して維持するために、マウス固定装置とゴム栓を用いてマウスを固定した。非常に冷たいガスを吸入するため、マウスの健康を保護し、凍傷や心理的問題を防ぐために、刺激プロセスの持続時間は制限されました。今後の取り組みでは、マウスの刺激段階でのさらなる害を最小限に抑えるために、フィクスチャを強化することに焦点を当てます。

この技術は、低温環境が生物に及ぼす影響に関する基礎科学研究に重要なだけでなく、寒冷地に住む人々の慢性疾患の病因を研究する上でも応用できる可能性があります。極端に冷たい空気の定義は、地域や環境によって異なります。しかし、温度制御システムを設定することで、室温から-20°Cまでのあらゆる温度の研究要件を満たすようにデバイスを調整することができます。 この柔軟性により、研究者の多様な温度ニーズに対応できます。さらに、低温条件下での臓器間コミュニケーションにおける肺の役割の探求に貢献し、寒冷地での脳卒中、冠状動脈性心臓病、呼吸器系疾患の予防と治療のための強固な基盤を提供します。これらの手順と予防措置に従うことで、研究者は、極低温環境が生物に及ぼす影響を研究するための安定した標準化された動物モデルを構築することができ、関連疾患の予防と治療のための科学的根拠を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
真鍮シェル	センHaidaハイテク電子機器会社
貯水槽	センGongdechengプラスチック産業
ファン	ChaoJingYin electoronic.、LTD	4010	12 V
ガス収集瓶	深センGongdechengプラスチック産業
インテーク/アウトレットパイプ	上海深センゴムとプラスチック製品 工場
マウス固定具	ランジエケ技術
パワー	深セン Haida ハイテク電子機器会社		12 V 40 A
半導体冷却チップ	深セン Haida ハイテク電子機器会社	TEC2-19006	二重層冷凍
スポンジ プラグ	深セン Gongdecheng プラスチック産業
ステンレス鋼ファスナー	深セン ハイダ ハイテク電子機器会社
熱伝導性シリコーングリース	深セン Haida ハイテク電子機器会社	DRG102
ウォーターポンプ	深セン Jutai ポンプ株式会社	DC005	12 V
ウォーターポンプ電源アダプター	Chaoke 電源アダプター工場	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V

深深