Method Article

キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

DOI:

10.3791/67338

⸱

January 31st, 2025

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

In This Article

Summary

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この記事では、健康なドナーキメラ抗原受容体T細胞におけるゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するための消耗に対する in vitro モデルの適用に関するプロトコルについて説明しています。

Abstract

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キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がんの治療に革命をもたらした革新的な標的免疫療法です。ただし、耐久性のある応答は依然として制限されています。最近の研究では、注入前のCART細胞製品のエピジェネティックな状況が治療への反応に影響を与える可能性があることが示されており、その解決策として遺伝子編集が提案されています。しかし、最適な遺伝子編集戦略を決定するためには、さらに多くの作業を行う必要があります。ゲノムワイドなCRISPRスクリーニングは、耐性のメカニズムを調査し、遺伝子編集戦略を最適化するための一般的なツールとなっています。しかし、初代細胞への応用には多くの課題があります。ここでは、健康なドナーのCART細胞でゲノムワイドなCRISPRノックアウトスクリーニングを完成させる方法について説明します。概念実証モデルとして、CD19抗原を標的とするCART細胞の枯渇の進行を調べるために、この手法を設計しました。しかし、このアプローチは、さまざまなCARコンストラクトや腫瘍モデルにおける治療に対する耐性のさまざまなメカニズムに対処するために使用できると考えています。

Introduction

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キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、B細胞悪性腫瘍の治療において目覚ましい成功を収めています。ただし、耐久性のある応答は30〜40%に制限されています1,2,3,4,5。研究者は、CAR設計の最適化、遺伝子編集、併用療法など、CART細胞療法に対する耐性のメカニズムに対処するためのいくつかのアプローチを開発およびテストしてきましたが、耐性の発生はほとんどわかっていません。最近、注入前CART細胞製品のベースライン遺伝子発現プロファイルが、CART療法の毒性と有効性の両方の重要な決定要因であるという証拠が増えています6,7,8,9。そのため、CART細胞産生中の遺伝子編集は、CART細胞治療の成功を向上させるための一般的なアプローチとなっています。

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Protocol

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重要なことに、以下に概説するプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB 18-005745)および施設バイオセーフティ委員会(IBC HIP00000252.43)のガイドラインに従い、承認を受けています。レンチウイルスの産生を含むすべての細胞培養作業は、適切な個人用保護具を備えた細胞培養フードで実施する必要があります。特に、レンチウイルスの作業は、廃棄前に10%漂白剤を使用してアイテムを消毒するなど、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の予防措置の下で実施する必要があります。

1. CRISPRライブラリーの増幅

  1. メーカーの推奨に従ってCRISPRライブラリを増幅します。簡単に説明すると、以下を完了することにより、CRISPRライブラリをエレクトロポレートしてエレクトロコンピテントセルの4つのアリコートにします。
    1. 1.0 mmキュベット中の25 μLのエレクトロコンピテントセルに、2 μLの50 ng/μL CRISPRライブラリープラスミドを添加します。
    2. 10 μF、600 Ω、1,800 V、3.5 ms〜4.5 msの時定数の設定を使用して、サンプルをエレクトロポレートします。
    3. 975 μLのリカバ....

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Results

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CART細胞の活性を偏りなく改善するために編集可能な遺伝子と経路を調べるために、in vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーンを設計しました(図1)。このスクリーニングには、CART細胞産生期と選択圧期の2つのフェーズがあります。CART細胞の産生段階では、少なくとも110×106 T細胞が最初に健康なドナーPBMCから単離され、CD3+/CD28+ビーズで活性化されます。翌日の1日目に、MOI3.0でCARレンチウイルスを添加し、CD19抗原を標的とするCART細胞(CART19細胞)を作製します。2日目に、CRISPRライブラリーレンチウイルスをMOI0.3でCART細胞に加えます。3日目から8日目まで、CART細胞をTCMの1×106細胞/ mLの濃度に維持し、ピューロマイシンを1μg.......

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Discussion

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遺伝子編集は、治療に対する耐性のメカニズムを理解するだけでなく、CART細胞の寿命と活性を改善するための新しいCART細胞療法を設計する上でも強力なツールとなっている16,17,26。一部の遺伝子編集戦略では、前臨床モデルと臨床試験の両方でCART細胞活性の改善が示されていますが、遺伝子編集戦略を最適化するためにはまだやるべきことがあります。このニーズに対処するために、研究者はCART細胞15,16における標的CRISPRスクリーニングを完了し始めています。ただし、このアプローチでは、以前に公開された戦略に基づくバイアスが導入されます。ここでは、CART細胞におけるin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するためのプロト.......

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Disclosures

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SSKは、ノバルティス社(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティス社との契約)、ヒューマニゲン社(メイヨークリニック社)、メタフォージ社(メイヨークリニック社)、マスタングバイオ社(メイヨークリニック社)、カイマールセラピューティクス社(メイヨークリニック社)にライセンス供与されたCAR免疫療法分野の特許の発明者です。CS、CMR、およびSSKは、Immix Biopharmaにライセンス供与された特許の発明者です。SSKは、Kite、Gilead、Juno、BMS、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc.、Lentigenから研究資金を受けています。SSKは、Kite/Gilead、Calibr、Luminary Therapeutics、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio、Novartisとのアドバイザリーミーティングに参加しています。SSKは、HumanigenおよびCarismaとともに、データの安全性および監視委員会の委員を務めてきました。SSKは、Torque、Calibr、Novartis、Capstan Bio、BMS、Carisma、Humanigenのコンサルタントを解雇しました。CMSとSSKは、このプロトコルから生まれた知的財産の発明者です。

Acknowledgements

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この研究は、Mayo Clinic Center for Individualized Medicine(SSK)、Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center(SSK)、Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics(SSK)、National Institutes of Health K12CA090628(SSK)およびR37CA266344-01(SSK)、Department of Defense grant CA201127(SSK)、Predolin Foundation(SSK)、およびMinnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics(SSK)から一部資金提供を受けました。CMSは、メイヨークリニック生物医科学研究科の支援を受けています。CRISPRの画面図(図1)は、BioRender.com(Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054)を用いて作成しました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293T 細胞ATCCCRL-3216レンチウイルス産生に使用される細胞
ビオチン プロテイン L 抗体GenScriptM00097CAR 検出用抗カッパ鎖抗体
シ血清アルブミンミリポア シグマA7906
カルベニシリン二ナトリウム塩ミリポア シグマC1389-1Gカルベニシリン抗生物質
CD4 分離ビーズMiltenyi Biotec130-045-101 
CD8 分離ビーズMiltenyi Biotec130-045-201
CTS (細胞治療システム) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
DNase-Free WaterInvitrogenAM9937
ダルベッコ修飾鷲培地 (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩水Gibco14190-144
EasySep ヒト T 細胞分離キットSTEMCELL Technologies17951RF陰性分離キット
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1回収培地付きエレクトロコンピテント細胞
エタノールミリポア シグマE7023
ウシ胎児血清 (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR ノックアウト プール ライブラリ AAddGene1000000048CRISPR ライブラリ プラスミド
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105エレクトロポレーター
グリコーゲンミリポア シグマ10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ 標的細胞 
Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬ThermoFisher ScientificL3000075薬キット(Lipofectamine 3000試薬)と中性共脂質試薬(p3000)
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851密度勾配培地
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi キットThermoFisher Scientific 12748412Maxi-prep kit
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SHigh Fidelity PCR mastermix
Opti-MEM I 還元血清培地Gibco31985-070還元血清培地
pCMVR8.74AddGene22036レンチウイルス包装プラスミド
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G エンベロープ発現プラスミド
プールされたヒト AB 血清 革新的な研究ISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick ゲル抽出キットQiagen28704Gek 抽出キット
Qucik-DNA Midiprep Plus KitZymo ResearchD4075キットは gDNA の分離に使用されます
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000自動細胞分離器
Roswell Park Memorial Institute 1640 培地 (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450密度勾配分離チューブ
酢酸ナトリウムInvitrogenAM9740
アジ化ナトリウムFisher Scientific71448-16
ストレプトアビジン抗体 (PE)BioLegend405203二次抗体CAR検出に使用
T100サーマルサイクラーBio-Rad1861096
超遠心分離機(Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
フィルターシステム、0.22&マイクロ。mThermoFisher Scientific567-0020
真空フィルターシステム、0.45 & micro;mサーモフィッシャーサイエンティフィック165-0045
X-VIVO 15 無血清造血細胞培地Lonza04-418Q造血細胞培地
ウトランスフェクション試真空

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtag....

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