方法論記事

キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

DOI：

10.3791/67338

⸱

2025年1月31日

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、健康なドナーキメラ抗原受容体T細胞におけるゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するための消耗に対する in vitro モデルの適用に関するプロトコルについて説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がんの治療に革命をもたらした革新的な標的免疫療法です。ただし、耐久性のある応答は依然として制限されています。最近の研究では、注入前のCART細胞製品のエピジェネティックな状況が治療への反応に影響を与える可能性があることが示されており、その解決策として遺伝子編集が提案されています。しかし、最適な遺伝子編集戦略を決定するためには、さらに多くの作業を行う必要があります。ゲノムワイドなCRISPRスクリーニングは、耐性のメカニズムを調査し、遺伝子編集戦略を最適化するための一般的なツールとなっています。しかし、初代細胞への応用には多くの課題があります。ここでは、健康なドナーのCART細胞でゲノムワイドなCRISPRノックアウトスクリーニングを完成させる方法について説明します。概念実証モデルとして、CD19抗原を標的とするCART細胞の枯渇の進行を調べるために、この手法を設計しました。しかし、このアプローチは、さまざまなCARコンストラクトや腫瘍モデルにおける治療に対する耐性のさまざまなメカニズムに対処するために使用できると考えています。

概要

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キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、B細胞悪性腫瘍の治療において目覚ましい成功を収めています。ただし、耐久性のある応答は30〜40%に制限されています1,2,3,4,5。研究者は、CAR設計の最適化、遺伝子編集、併用療法など、CART細胞療法に対する耐性のメカニズムに対処するためのいくつかのアプローチを開発およびテストしてきましたが、耐性の発生はほとんどわかっていません。最近、注入前CART細胞製品のベースライン遺伝子発現プロファイルが、CART療法の毒性と有効性の両方の重要な決定要因であるという証拠が増えています6,7,8,9。そのため、CART細胞産生中の遺伝子編集は、CART細胞治療の成功を向上させるための一般的なアプローチとなっています。

例えば、私たちの研究室では、遺伝子顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をノックアウトするために、クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)Cas9技術を使用すると、CART細胞の活性が向上し、CART関連毒性の兆候が減少することを示しました10,11,12。さらに、CRISPR改変細胞療法は臨床試験で検証されており、有効性と安全性が示されています13。これらを総合すると、CRISPR技術を用いた遺伝子編集は、CART細胞生物学の理解を深めるだけでなく、翻訳可能なCART細胞産物を作製できることを示しています。

ゲノムワイドなCRISPRノックアウトスクリーニングは、治療薬に対する耐性のメカニズムを理解するためのがん生物学研究において、ますます人気のあるツールとなっています。この手法では、数万のガイドRNA(gRNA)が細胞のプールに送達され、細胞1個につき1個のgRNAの侵入が促進される14。その後、細胞は圧力誘導状態に置かれ、必須遺伝子を標的とするgRNAを形質導入した細胞は死滅し、阻害遺伝子を標的とするgRNAを形質導入した細胞は生存して増殖します。次世代シーケンシングを用いることで、CRISPRスクリーニング全体でgRNAの表現がどのように変化するかを決定することができる14。

しかし、ゲノムワイドな遺伝子摂動に必要なスケールと選択時間は、CART細胞のような初代細胞で達成するのが難しい場合があります。そのため、グループは標的CRISPRスクリーニングを利用して、治療耐性のメカニズムをさらに理解しています15,16。ターゲットスクリーニングは、多くの場合、一次細胞では、適切なライブラリー表現を達成するために必要な細胞が少なくて済む小さなライブラリーを持っているため、簡単に完了できます。これらの研究により、CART細胞療法に対する耐性のメカニズムについての理解が深まりましたが、標的スクリーニングでは、遺伝子標的を手動で選択するため、バイアスが生じます。この記事では、健康なドナーのCART細胞でin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了する方法について説明しようとしています。そのため、このハイスループットアプローチにより、治療反応を改善するために編集できる主要な経路と遺伝子を効率的かつ偏りなく同定することができます17,18,19。

特に、この記事で説明するプロトコルは、消耗のin vitroモデルを使用してゲノムワイドなCRISPRノックアウトスクリーニングを完了することにより、CART細胞の消耗に関する分野の理解を深めるように設計されています。疲労は、CART細胞療法に対する無反応に関与している機能不全のCART細胞運命である20,21,22。この細胞運命はエピジェネティックに制御されていることが知られており、CART細胞の増殖の減少、エフェクターサイトカイン産生の減少、および抑制性受容体の発現の増加を特徴としています23。先行文献では、遺伝子編集は、主要な遺伝子をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることによって、疲労の発生を防ぐことができた24,25,26。CART細胞が疲弊するにつれて増殖能力が低下することと、遺伝子編集がその発生を防ぐことができるという証拠の両方を考慮して、この細胞運命に基づいてin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングをモデル化しました。ただし、このプロトコルは、CART細胞療法に対する耐性の他のメカニズムを調査するために、将来修正される可能性があります。

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プロトコル

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重要なことに、以下に概説するプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB 18-005745)および施設バイオセーフティ委員会(IBC HIP00000252.43)のガイドラインに従い、承認を受けています。レンチウイルスの産生を含むすべての細胞培養作業は、適切な個人用保護具を備えた細胞培養フードで実施する必要があります。特に、レンチウイルスの作業は、廃棄前に10%漂白剤を使用してアイテムを消毒するなど、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の予防措置の下で実施する必要があります。

1. CRISPRライブラリーの増幅

  1. メーカーの推奨に従ってCRISPRライブラリを増幅します。簡単に説明すると、以下を完了することにより、CRISPRライブラリをエレクトロポレートしてエレクトロコンピテントセルの4つのアリコートにします。
    1. 1.0 mmキュベット中の25 μLのエレクトロコンピテントセルに、2 μLの50 ng/μL CRISPRライブラリープラスミドを添加します。
    2. 10 μF、600 Ω、1,800 V、3.5 ms〜4.5 msの時定数の設定を使用して、サンプルをエレクトロポレートします。
    3. 975 μLのリカバリー培地で回収し、1 mLのリカバリー培地を追加したチューブに移します。
    4. すべてのアリコートを250 RPMで37°Cで1時間回転させます。
  2. 変換をプレートします。
    1. エレクトロポレーションセルのすべてのアリコートをプールし、よく混合します。
    2. 予熱した10 cmのLuriaブロス(LB)プレートに400 μLの形質転換ミックスを100 μg/mLのカルベニシリンで広げて、すべてのエレクトロポレーション細胞をプレート化します。プレートを32°Cのインキュベーターに14時間置きます。
  3. コロニーを収穫します。
    1. 各プレートに1 mLのLB培地+ 100 μg / mLのカルベニシリンをピペットで移します。コロニーを各プレートからこすり落とし、50mLのコニカルチューブに集めます。
    2. さらに1 mLのLB培地+100 μg/mLのカルベニシリンを各プレートに加え、洗浄して完全に回復させます。
    3. マキシプレップキットの指示に従って、マキシプレップを実行します。
    4. 得られたプラスミドDNAをプールします。

2. CRISPRライブラリーにおけるベースラインgRNAの発現を検証するための次世代シーケンシング

注:このCRISPRライブラリーのNGSプライマーは、以前の論文27で設計されています。サンプルごとに異なるリバースプライマーを使用すると、各サンプルがバーコード化され、シーケンシング中にサンプルをプールできます。

  1. 次の反応混合物(総容量= 50 μL)を使用してPCR用のサンプルを調製します:ハイフィデリティPCRマスターミックス、2x:25 μL;プールされたテンプレートDNA、0.5 μg:1 μL;NGSライブラリフォワードプライマー、10 μM:1.25 μL;NGSライブラリリバースプライマー、10 μM:1.25 μL;DNaseフリー水:21.5μL。
  2. 次のサイクリング条件でPCRを実行します:サイクル1:98°Cで3分間変性します。サイクル2-23:98°Cで10秒間変性、63°Cで10秒間アニール、72°Cで25秒間延長。サイクル24:72°Cで2分間延長します。
  3. 各サンプルのPCR反応をプールし、製造元の指示に従ってPCR精製キットでPCR産物を精製することにより、PCR反応を精製します。
  4. 各サンプルについて3 μgのPCR産物を2%(w/v)アガロースゲルで泳ぎます。
  5. PCR産物(~260-270 bp)をゲルから取り出し、製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルからDNAを抽出します。少なくとも500 ngのDNAを目指してください。
  6. 抽出したサンプルは-20°Cで保存します。
  7. サンプルを用いて次世代シーケンシング(NGS)を行い、gRNA27あたり100リードを目指します。
  8. MAGeCK-VISPRパイプラインでシーケンシング結果を解析し、ライブラリ内のgRNAの99.5%以上が表されていることを確認28。

3. CRISPRライブラリーとCAR発現レンチウイルスの作製

  1. 前述のようにレンチウイルスを調製します10,29。
    1. 1日目:10%ウシ胎児血清(FBS)(v / v)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(PSG)(v / v)、およびダルベッコの修飾ワシ培地で構成されるD10培地で増殖している80〜90%のコンフルエント293T細胞のT175フラスコから始めます。開始する前に、トランスフェクション試薬とDNAを室温まで温め、DNAを定量します。
    2. 293Tフラスコごとに、2本の50 mLコニカルチューブ A と Bを標識します。4.5 mLの還元血清培地をチューブ A とチューブ Bに加えます。.
    3. 滅菌済みの1.5 mL微量遠心チューブで、18 μgのpCMVR8.74(gag、pol、tat、およびrev)、7 μgのpMD2.G(VSV-G)、および15 μgのレンチウイルス発現ベクター(CRISPRライブラリーAまたはCAR19-28ζベクター)を1分間静置します。
    4. チューブ Aに129 μLのトランスフェクション試薬を添加します。チューブ A をフィンガーボルテックスでよくミックスします。
    5. DNA混合物をチューブ Bに加えます。チューブ B をフィンガーボルテックスでよく混ぜます。
    6. 111 μLの中性共脂質試薬をチューブ Bに加えます。チューブ B をフィンガーボルテックスでよく混ぜます。
    7. チューブ A の内容物をチューブ B に加え、フィンガーボルテックスでよく混ぜます。チューブ B を室温で30分間インキュベートします。
    8. 30分間のインキュベーション期間の終わりに向けて、既存の培地を吸引して293T細胞を調製します。10% FBS(v/v)、1% PSG(v/v)、およびロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640で構成されるR10培地16 mLを16 mL加えます。
    9. 30分間のインキュベーション期間後、チューブ B の内容物(約9mL)を293T細胞のフラスコに滴下します。フラスコを下に置き、静かに回転させてから、37°C、5%CO2でインキュベートします。
    10. 2日目(トランスフェクションの約24時間後)に、次のようにレンチウイルスを収集します。
      注意: すべての機器と材料を事前に冷やし、氷の上で以下を実行してウイルス上清を冷たく保ちます。
      1. トランスフェクションした293Tフラスコから上清を予冷した50mLコニカルチューブに移します。
      2. 予熱したR10培地30 mLを293Tフラスコに加えます。
      3. 50 mLのコニカルチューブを900 × g で4°C、10分間遠心分離することにより、細胞の破片をペレット化します。
      4. 遠心分離後、0.45 μmフィルターで上清をろ過します。濾液を超遠心分離機で112,700 × g 、4°C、2時間回転させます。
      5. 2時間回転後、約5 mLが残るまで上清を吸引します。.ウイルス粒子を10倍に静かにピペッティングして再懸濁します。ウイルス懸濁液を4°Cで一晩保存してください。
    11. 3日目に、次のようにレンチウイルスを収集して保管します。
      1. トランスフェクションした293Tフラスコから上清を予冷した50mLコニカルチューブに移します。
      2. 293Tフラスコに10%漂白剤30mLを加えます。
      3. 50 mLのコニカルチューブを900 gで900 × g 、4°Cで10分間遠心分離することにより、上清中の細胞破片をペレット化します。
      4. 遠心分離後、0.45 μmフィルターで上清をろ過します。濾液を超遠心分離機で112,700 × g 、4°C、2時間回転させます。
      5. 2時間の遠心分離後、約2 mLが残るまで上清を吸引し、10回静かにピペッティングして再懸濁します。ウイルス上清を300〜500μLのアリコートに保存し、-80°Cに保ちます。

4. CAR発現レンチウイルスのウイルス力価の計算

注:CARレンチウイルスは、前述の10,12と同様に力価が測定されました。

  1. 1日目に、T細胞を活性化してプレートします。
    1. ネガティブセレクションキットを使用して、健康なドナーPBMCから1×106 T細胞を単離します。
    2. T細胞を数えます。
    3. T細胞を刺激するのに十分なCD3+/CD28+ ビーズを3:1のビーズ:セル比で洗浄してください。例えば、1 × 106 T細胞を刺激するには、3 × 106 ビーズを洗浄します。これを行うには、次の3回を完了してビーズを洗います。
      1. 磁気分離を使用して、懸濁液からビーズを取り除きます。
      2. 上清を取り除きます。
      3. 10%ヒト血清(v/v)、1%PSG(v/v)、造血細胞培地からなるT細胞培地(TCM)1000 μLを添加します。
        注:TCMは、使用前に0.45μmの滅菌真空フィルターでろ過し、次に0.22μmの滅菌真空フィルターでろ過して滅菌する必要があります。
      4. T細胞懸濁液にビーズを3:1のビーズ:セル比で添加します。
      5. T細胞をTCMで1 × 106 細胞/mLに再懸濁します。
      6. 100 μLの活性化T細胞を96ウェルプレートの10ウェルに添加します。プレートを37°C、5%CO2でインキュベートします。
  2. 2日目に、次のように希釈プレートを作成して、CARレンチウイルスの希釈を追加します。
    1. 100 μLのTCMを96ウェルプレートの7ウェルに添加します。
    2. 最初のウェルに、目的のウイルス50μLを加えます。よく混ぜます。
    3. ウェル1からウェル2に50μLを添加して、ウイルスをさらに連続希釈します。よく混ぜます。
    4. ウェル2からウェル3に50μLを加え、このパターンをウェル7まで続けます。
    5. ウェル7を混合した後、50 μLを取り出し、すべてのウェルの総容量が100 μLであることを確認します。
    6. 希釈プレートの各ウェルから50μLを1日目のT細胞プレートの最初の7つのウェルに加えます。よく混ぜます。
    7. T細胞プレートの最後の3つのウェルに、50μLのTCMを加えます。よく混ぜます。プレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに保管します。
  3. 3日目に、T細胞プレートのすべてのウェルに100μLのTCMを加えて細胞を給餌します。よく混ぜます。
  4. 4日目に、以下を完了することにより、CAR発現の代替マーカーである抗カッパ鎖抗体でCARを発現する細胞の割合を検出するためにフローサイトメトリーを実施します。
    1. T細胞プレートを1,000 × g で3分間スピンダウンし、デカントします。
    2. 200 μLの抗κ鎖抗体バッファーを加え、プレートを1,000 × g で3分間スピンダウンし、デカンテーションして、抗κ鎖抗体バッファー(PBS中の4%ウシ血清アルブミン(w / v)で構成)でプレートを3回洗浄します。
    3. ビオチン抗κ鎖抗体を各ウェルに添加します。ロッカー上で45分間インキュベートし、4°Cで保存します。
    4. ステップ4.4.2と同様に、プレートを抗κ鎖抗体バッファーで3回洗浄します。
    5. フローサイトメトリー用の細胞を、蛍光色素標識ストレプトアビジン抗体と生/死抗体で染色します。サンプルを暗所で室温で15分間インキュベートします。
    6. 200 μLのフローバッファーを加え、プレートを1,000 ×gで3分間スピンダウンし、デカンテーションして、フローバッファー(2% FBS(v / v)とPBS中の1%アジ化ナトリウム(v / v)で構成)でサンプルを一度洗浄します。
    7. 100 μLのフローバッファーに再懸濁し、サイトメーターで実行します。
    8. 3つの未形質導入ウェルでネガティブゲーティングを行います。

5. CRISPRライブラリーレンチウイルスのウイルス力価の計算

注:このプロトコルは、CRISPRライブラリーレンチウイルスを滴定するための最小数のT細胞を説明していますが、より多くのT細胞、したがって大量のウイルスに対応するためにスケールアップすることができます。

  1. 0日目に、18 × 106 CD3+/CD28+ ビーズ (ビーズ:細胞比 3:1) を 6 × 106 T細胞に添加し、TCM で最終容量を 6 mL にすることで T 細胞を活性化します。0.5 mLのT細胞懸濁液を48ウェルプレートの12ウェルに分注します。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。
  2. 24時間後の 1日目に、感染の多重度(MOI)が3のCARウイルスをすべてのウェルに追加します。ピペッティングを数回上下させてよく混ぜます。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。
  3. 48時間後の 2日目に、次のボリュームのCRISPRウイルスのいずれかを各ウェルに追加することにより、活性化CART細胞に一連のCRISPRライブラリウイルスボリュームを追加します(0 μL、0 μL、6.25 μL、6.25 μL、12.5 μL、12.5 μL、25 μL、25 μL、50 μL、50 μL、100 μL、または100 μL)。ピペッティングを数回上下させてよく混ぜます。インキュベーターに37°C、5%CO2で保存します。
  4. 3日目に、次のCRISPRウイルス容量(0 μL、6.25 μL、12.5 μL、25 μL、50 μL、100 μL)をそれぞれ投与したウェルを含む、培地1 mLあたり1 μgのピューロマイシンをウェルの半分に加えます。他のウェルはピューロマイシンで処理されません。
  5. 4 日目から 8 日目まで、毎日 T 細胞をカウントし、最終的な細胞密度を 1 × 106 細胞/mL に調整し、ピューロマイシン処理ウェルの場合は TCM に 1 μg/mL ピューロマイシンを使用し、未処理ウェルには TCM を使用します。
  6. 8日目に、ウェルあたりの生細胞の数をカウントし、次の式を使用してウイルス上清の形質導入単位/ mLを計算します。
    figure-protocol-1
    ここで、A:ウイルスに形質導入された生細胞数。B:抗生物質選択なしのコントロールウェルでの生細胞数。V:各ウェルの感染に使用されたウイルスの量。D:希釈倍率。
  7. 約 20% の形質導入効率を示すウェルから計算した TU/mL ウェルを使用して、次の式を使用して MOI 0.3 で 1 個× 10個の 6 個の細胞を形質導入するために必要なウイルスの量を計算します。
    figure-protocol-2

6. CRISPRスクリーニングのCART細胞産生段階(0日目から8日目)

注:以下のプロトコルは、1回の生物学的複製におけるCRISPRスクリーニングの完了を説明しています。しかし、このプロトコルは以前に3つの生物学的複製で検証されており、このプロトコル30を完了する他のものに対しては、少なくとも3つの生物学的複製を使用することを推奨する。

  1. 0日目:前述のように、健康なドナーの血液からT細胞を分離して刺激します10。
    1. 匿名化された健康なドナー血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
      1. 15 mLの密度グラジエント培地を密度グラジエント分離チューブに加えます。
      2. 1:2 に希釈した血液を密度勾配分離チューブの上部に加えます。1,200 × g で室温で10分間遠心分離します。





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結果

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CART細胞の活性を偏りなく改善するために編集可能な遺伝子と経路を調べるために、in vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーンを設計しました(図1)。このスクリーニングには、CART細胞産生期と選択圧期の2つのフェーズがあります。CART細胞の産生段階では、少なくとも110×106 T細胞が最初に健康なドナーPBMCから単離され、CD3+/CD28+ビーズで活性化されます。翌日の1日目に、MOI3.0でCARレンチウイルスを添加し、CD19抗原を標的とするCART細胞(CART19細胞)を作製します。2日目に、CRISPRライブラリーレンチウイルスをMOI0.3でCART細胞に加えます。3日目から8日目まで、CART細胞をTCMの1×106細胞/ mLの濃度に維持し、ピューロマイシンを1μg...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子編集は、治療に対する耐性のメカニズムを理解するだけでなく、CART細胞の寿命と活性を改善するための新しいCART細胞療法を設計する上でも強力なツールとなっている16,17,26。一部の遺伝子編集戦略では、前臨床モデルと臨床試験の両方でCART細胞活性の改善が示されていますが、遺伝子編集戦略を最適化するためにはまだやるべきことがあります。このニーズに対処するために、研究者はCART細胞15,16における標的CRISPRスクリーニングを完了し始めています。ただし、このアプローチでは、以前に公開された戦略に基づくバイアスが導入されます。ここでは、CART細胞におけるin vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するためのプロト...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSKは、ノバルティス社(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティス社との契約)、ヒューマニゲン社(メイヨークリニック社)、メタフォージ社(メイヨークリニック社)、マスタングバイオ社(メイヨークリニック社)、カイマールセラピューティクス社(メイヨークリニック社)にライセンス供与されたCAR免疫療法分野の特許の発明者です。CS、CMR、およびSSKは、Immix Biopharmaにライセンス供与された特許の発明者です。SSKは、Kite、Gilead、Juno、BMS、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc.、Lentigenから研究資金を受けています。SSKは、Kite/Gilead、Calibr、Luminary Therapeutics、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio、Novartisとのアドバイザリーミーティングに参加しています。SSKは、HumanigenおよびCarismaとともに、データの安全性および監視委員会の委員を務めてきました。SSKは、Torque、Calibr、Novartis、Capstan Bio、BMS、Carisma、Humanigenのコンサルタントを解雇しました。CMSとSSKは、このプロトコルから生まれた知的財産の発明者です。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Mayo Clinic Center for Individualized Medicine(SSK)、Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center(SSK)、Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics(SSK)、National Institutes of Health K12CA090628(SSK)およびR37CA266344-01(SSK)、Department of Defense grant CA201127(SSK)、Predolin Foundation(SSK)、およびMinnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics(SSK)から一部資金提供を受けました。CMSは、メイヨークリニック生物医科学研究科の支援を受けています。CRISPRの画面図(図1)は、BioRender.com(Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054)を用いて作成しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
293T 細胞ATCCCRL-3216レンチウイルス産生に使用される細胞
ビオチン プロテイン L 抗体GenScriptM00097CAR 検出用抗カッパ鎖抗体
シ血清アルブミンミリポア シグマA7906
カルベニシリン二ナトリウム塩ミリポア シグマC1389-1Gカルベニシリン抗生物質
CD4 分離ビーズMiltenyi Biotec130-045-101 
CD8 分離ビーズMiltenyi Biotec130-045-201
CTS (細胞治療システム) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
DNase-Free WaterInvitrogenAM9937
ダルベッコ修飾鷲培地 (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩水Gibco14190-144
EasySep ヒト T 細胞分離キットSTEMCELL Technologies17951RF陰性分離キット
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1回収培地付きエレクトロコンピテント細胞
エタノールミリポア シグマE7023
ウシ胎児血清 (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR ノックアウト プール ライブラリ AAddGene1000000048CRISPR ライブラリ プラスミド
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105エレクトロポレーター
グリコーゲンミリポア シグマ10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ 標的細胞 
Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬ThermoFisher ScientificL3000075薬キット(Lipofectamine 3000試薬)と中性共脂質試薬(p3000)
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851密度勾配培地
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi キットThermoFisher Scientific 12748412Maxi-prep kit
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SHigh Fidelity PCR mastermix
Opti-MEM I 還元血清培地Gibco31985-070還元血清培地
pCMVR8.74AddGene22036レンチウイルス包装プラスミド
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G エンベロープ発現プラスミド
プールされたヒト AB 血清 革新的な研究ISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick ゲル抽出キットQiagen28704Gek 抽出キット
Qucik-DNA Midiprep Plus KitZymo ResearchD4075キットは gDNA の分離に使用されます
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000自動細胞分離器
Roswell Park Memorial Institute 1640 培地 (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450密度勾配分離チューブ
酢酸ナトリウムInvitrogenAM9740
アジ化ナトリウムFisher Scientific71448-16
ストレプトアビジン抗体 (PE)BioLegend405203二次抗体CAR検出に使用
T100サーマルサイクラーBio-Rad1861096
超遠心分離機(Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
フィルターシステム、0.22&マイクロ。mThermoFisher Scientific567-0020
真空フィルターシステム、0.45 & micro;mサーモフィッシャーサイエンティフィック165-0045
X-VIVO 15 無血清造血細胞培地Lonza04-418Q造血細胞培地
ウトランスフェクション試真空

参考文献

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