方法論記事

ポリビニルアルコール被覆医療機器への治療薬の結合の検証

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DOI:

10.3791/67358

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2024年11月29日

 ,  , 
1Department of Surgery, LSU Health Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Shreveport

この記事について

サマリー

ここでは、医療機器にキャストされたポリビニルアルコール膜にタンパク質治療薬を結合させることにより、医療機器をタンパク質治療薬と誘導体化するためのプロトコルを紹介します。タンパク質ベースの治療薬のコンジュゲーションは、局所的かつ濃縮的な送達を可能にし、オフターゲット効果を最小限に抑えながら、投与に必要な薬剤量を大幅に削減する費用対効果の高いアプローチです。

要約

タンパク質ベースの治療薬は、投与経路や作用部位に閉じ込めることができないことによって制限されることがよくあります。私たちが開発した革新的なアプローチの1つは、タンパク質治療薬を医療機器に共有結合させることで、これらの薬剤を意図した作用部位により局所的かつ高濃度に送達できるようにすることです。この研究は、グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2) が膣拡張スリーブ (VES) および腸拡張スリーブ (IES) デバイスに共有結合できるかどうかを評価することを目的としています 臨床的に関連性があり、測定可能な量で。

拡張スリーブはポリビニルアルコール(PVA)でコーティングされ、グルタルアルデヒド/硫酸蒸気と架橋されて、GLP-2などのアミン含有治療薬に結合できる化学的に活性な表面を作り出しました。250 μg、100 μg、50 μg、25 μg、および 0 μg の GLP-2 を 24 ウェルプレートの PVA コーティングウェルに結合することにより、標準曲線を作成しました。ELISA標準は、ウサギ抗GLP-2抗体、続いてヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ二次抗体、およびアルカリホスファターゼブルーマイクロウェル基質を用いて作成しました。比色分析(620 nmで黄色から青色)は、GLP-2結合抗体の濃度に比例するため、PVAコーティングスリーブ上のGLP-2の結合濃度を計算することができました。IES/VES デバイスに 50 μg の GLP-2 を添加すると、GLP-2 の 9.32 μg/cm 2 ± 9.32 μg/cm2 が平均 22.69 個結合し、添加された GLP-2 の 44% が PVA コーティングされた IES/VES スリーブに固定化されたことを示しています。

現在のヒトGLP-2投与は50μg/Kgです。各スリーブには22μgが充填されるため、これは1つのデバイスでの全身用量の約44%です。この方法論により、GLP-2薬の全身投与と同じ効果を得るために、劇的に低用量の治療薬を追加することが可能になると同時に、全身的な影響も回避することができます。

概要

酵素、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子などのタンパク質ベースの治療薬は、いくつかの疾患の治療に非常に効果的であることが示されています1。これらの治療薬の提供方法についての理解が深まれば、これらの物質を医薬品/治療として適用するためのバイオテクノロジーを大きく進歩させることができる1。タンパク質治療薬の有効性は、その生体内分布、コスト、およびオフターゲット効果によって制限されます。タンパク質治療薬の薬物動態および薬力学を改善するために、PEG化、グリコシル化、脂質化、および他のタンパク質の融合など、いくつかのアプローチが試みられてきた2。「標的性」は、現在のタンパク質治療薬のほとんどが複数の作用部位を持ち、その結果、オフターゲット効果をもたらすため、別の懸念事項です。具体的には、これらの薬剤を目的の部位に標的とすることで、必要な治療用量を減らし、副作用を減らすことができます2。薬物送達を意図した作用部位に制限することができれば、治療を根本的に改善すると同時に、これらの薬物の望ましくない「オフターゲット」副作用を制限することができるかもしれません。

現在、クロピドグレル、ビンクリスチン、ビンブラスチンを含む抗増殖薬コーティングを施した薬剤溶出ステントなど、治療薬を含む複数の医療機器が使用されています。これにより、再狭窄や心臓カテーテル治療後の血行再建術の繰り返しの必要性を防ぐことができます3。さらに、パクリタキセル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、およびその他の抗増殖剤を含有する生分解性薬剤溶出尿管ステントが作成され、上部尿路上皮癌の治療に役立てられています4。これらのステントが劣化すると、抗腫瘍薬は制御された方法で局所的に放出され、追加の投与を必要とせずに薬物送達を延長する4。この方法論は、意図した作用部位での抗腫瘍薬の長期的な効果を可能にすると同時に、全身曝露の必要性を防ぎ、非腫瘍細胞に対する薬物作用を制限し、薬物毒性を低減します。また、ステントの生分解性の性質も、ステント除去手順の必要性を防ぐことができます4。

短腸症候群(SBS)は、タンパク質ベースの治療薬の使用が患者に有意な改善を示した別の状態です5。SBSはさまざまなメカニズムで発生する可能性がありますが、腸の長さが不十分になり、吸収不良や栄養失調を引き起こします。グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)類似体などの治療法は、この状態の外科的管理に移行する前に使用することができます5。ヒトGLP-2は、L型内分泌細胞によって遠位小腸と大腸で産生される全身性栄養ペプチドホルモンです。GLP-2は、腸管陰窩細胞の増殖を誘導し、損傷した粘膜の修復を促進し、腸上皮細胞のアポトーシスを阻害し、腸血の供給を改善します5。テデュグルチドなどのGLP-2類似体は、自然な腸の適応を増強するために、SBSの治療のために1歳以上の患者に承認されています6。当然のことながら、腸の適応には何年もかかることがあり、吸収時間を増加させるために胃内容排出が遅れ、吸収のための表面積を増やすために腸の拡張によって直径が増加します7。GLP-2類似体は、天然のGLP-2と同じ薬理活性を持ちながら、より安定した構造を有しているため、半減期が長く、標的との親和性が強くなります5。現在、テドゥグルチドの年間費用は 295,000 ドルで、患者の投与は 1 日あたり 0.05 mg/kg です5。テドゥグルチドの副作用には、吐き気、嘔吐、下痢、腹痛、体重減少、胃腸ポリープ、既存の腫瘍の成長の増加などがあります5。

以前、私たちの研究室では、腸拡張スリーブ(IES)(図1)の展開により、in vivoでの1か月の展開後に、ex vivoで小腸が36.2%、小腸が30.2%の伸びを即座に生成できることを示しました6,8。このデバイスは、非経口栄養依存症を短縮できるSBS患者の治療法になる可能性があります。IESデバイスに治療薬を生体結合する能力は、腸管粘膜成長アゴニストGLP-2をデバイスに追加することにより、気晴らし腸内形成能力をさらに改善する可能性があります。ポリビニルアルコール(PVA)メンブレンは、PVAを水に溶解し、それを構造支持体にキャストし、次いで硫酸を触媒として使用してグルタルアルデヒドと架橋することによって調製できる親水性ポリマーである9。これらのハイドロゲルナノ粒子は、薬物拡散、ハイドロゲルマトリックス膨潤、および薬物/マトリックス10の化学反応性を通じて、薬物送達システムとしての可能性を有することが示されている。PVAは、その優れた生体適合性と安全性により、ヒトでの臨床使用がFDAに承認されています11。PVA重合は、バイオコンジュゲーションを可能にする末端基をもたらします12。

IES/VESデバイスの長さは3cmで、外部表面積は9.425cm2で、PVAメンブレンで鋳造できます。これらのPVAメンブレンは、GLP-2と生体結合して、治療薬の局所的かつ濃縮的な送達を可能にすることができます。薬物の必要用量を下げ、全身投与の必要性を回避し、治療の局所外悪影響を回避します。これにより、必要な投与量が少なくて済むため、これらの高価な医薬品のコストを軽減することができ、薬物の放出が遅れると投与頻度が減少し、コストがさらに削減されます。IESデバイスをGLP-2でコーティングすると、必要な投与量を減らし、患者の費用を節約し、全身投与を回避し、治療の悪影響を防ぎ、標的部位への薬物の継続的な送達を維持できます。このレポートでは、GLP-2のような治療用タンパク質が、生理学的に意味のある量でIES/VESデバイスなどの医療機器に共有結合し、オフターゲット効果を回避しながらこれらの薬物の局所的な利点を提供できる程度を評価します。

プロトコル

注: セクション 1 とセクション 2 は同時に完了します。PVAによるコーティングとPVAメンブレンの架橋は、拡張スリーブと24ウェルプレートの両方で同時に行う必要があります。これにより、24ウェルプレートで標準曲線を作成すると同時に、吸光度を使用して各スリーブのGLP-2濃度を計算する準備が整います。

1. GLP-2コーティングされたIESおよびVESデバイスの作成

  1. 5 mLの脱イオン水に5 gのPVAを加えて、5%PVA溶液を作ります。溶かすために、ホットプレートで攪拌することを検討してください。次に、1 mLの脱イオン水に1 mgのGLP-2を加えて、1 mg / mLのGLP-2溶液を作ります。
  2. ガラスピペットの上に契約前の腸拡張スリーブと膣拡張スリーブを取り付け、プラスチックピペットで端を安定させます。
  3. 小さな絵筆を使用して、事前に契約したスリーブを既製の5%PVAでペイントします。PVAのコートを塗装した後、スリーブを室温(RT)で10分間乾燥させてから、別のコートを塗装して、各スリーブに合計5枚のPVAコートを塗布します。
  4. 5回目の コートが乾いたら、事前に収縮したスリーブを化学安全フードの下のデシケーターに入れて、RTで架橋できるようにします。架橋を開始します。3mLの25%グルタルアルデヒドと3mLの94%-98%硫酸を加えて、デシケーター内のオープンビーカーを分離し、蒸気が反応してPVA膜をスリーブに架橋します。
  5. チャンバー内のスリーブを48時間架橋した後、スリーブをチャンバーから取り出し、グルタルアルデヒドをスリーブから15分間蒸発させます。
  6. 次に、各スリーブに慎重にピペッティングして、1 mg/mL GLP-2溶液50 μLを加えます。これをRTで30分間乾燥させてから、事前に収縮したスリーブをガラスピペットから取り外し、各スリーブを24ウェルプレートのそれぞれのウェルに追加します。

2. GLP-2コーティング24ウェルプレートの作成

  1. GLP-2の標準曲線をPVAに結合させるには、50 μLの5% PVAを24ウェルプレートの使用予定ウェル18の底にピペットで移します。IES デバイスと VES デバイスを保持するために 6 つのウェルを空白のままにします (デバイスのタイプごとに 3 つ)。
  2. PVAの層を24ウェルプレート上で120°Cのオーブンで一晩乾燥させます。
  3. 24ウェルプレートを化学安全フードの下のデシケーターに入れ、PVAがRTで48時間架橋できるようにします。3mLの25%グルタルアルデヒドと3mLの94%-98%硫酸を分離して架橋を開始し、蒸気がチャンバー内で反応してPVAを24ウェルプレートに架橋できるようにします。
  4. 48時間架橋した後、24ウェルプレートをチャンバーから取り出し、グルタルアルデヒドをプレートから15分間蒸発させます。
  5. 次に、250 μL、100 μL、50 μL、25 μL、0 μL の 1 mg/mL GLP-2 溶液を標識ウェルに添加して濃度勾配を作成し、GLP-2 の各濃度(250 μg、100 μg、50 μg、25 μg、0 μg)ごとに 3 ウェル、スリーブのタイプ(IES および VES)ごとに 3 ウェルの 24 ウェルプレートを作成します。

3. 標準曲線の作成とスリーブGLP-2濃度のこだわり

  1. それぞれのGLP-2希釈液をウェルに加え、薬剤コーティングスリーブをウェルに添加した後、プレートを4°Cで一晩冷蔵して、薬物が結合するのを待ちます。
  2. 翌日、脱イオン水ブロッキング溶液中の粉乳2 mLを各ウェルに1時間加えます。ブロッキング後、各ウェルをPBSで3回、各洗浄で5分間洗浄します。
  3. 50 mLの脱イオン水に40 μLのウサギ抗GLP-2抗体を加えて、ウサギ抗GLP-2抗体溶液を作製します。次に、24ウェルプレート上の各ウェルに2 mLのウサギGLP-2抗体溶液を加え、4°Cで一晩冷蔵します。
  4. 一次抗体のインキュベーション後、各ウェルをPBSでさらに3回、5分間洗浄します。ヤギ二次抗体溶液で産生した抗ウサギIgGアルカリホスファターゼを作製するには、40 mLの脱イオン水に20 mLの二次抗体を添加します。次に、各ウェルに2 mLの二次抗体溶液を加え、室温で2時間放置します。
  5. 二次抗体溶液を吸引し、各ウェルを別の3x PBS洗浄液で各5分間洗浄します。次に、アルカリホスファターゼブルーマイクロウェル基質を各ウェルに加えます。
  6. 二次抗体に結合したアルカリホスファターゼをRTで20分間基質と反応させます。反応が進行するにつれて、溶液の色が黄色から青に変わるのを観察します。
  7. 各ウェルから200 μLの溶液をピペッティングして反応を停止し、24ウェルプレートと同じラベルの付いた96ウェルプレートに入れます。PVAメンブレンをアルカリホスファターゼ酵素に結合させた状態で24ウェルプレートから試薬を取り外すと、反応は停止し、色は変化しません。
  8. 波長 620 nm の吸光度マイクロプレートリーダーを使用して 96 ウェルプレートを読み取り、標準曲線を生成し、PVA コーティングされたスリーブ上の GLP-2 の濃度を計算します。

結果

このプロトコルでは、GLP-2の結合を可能にするために、IESおよびVESデバイスをPVAでコーティングおよび架橋する手順を説明しています。図2は、各デバイスのGLP-2濃度を決定するために生成された標準曲線を示しています。図3は、各IESおよびVESデバイスのGLP-2濃度と、標準曲線に使用したウェルの濃度を示しています。スリーブの平均GLP-2濃度は22.69±9.32μg/cm2であり、これは24ウェルプレートの50μgウェルのGLP-2濃度が23.7μg/cm2であったことに対応する。これは、50μgのGLP-2を添加すると、添加された薬物の45%がPVAコーティングされた医療機器に結合したままになることを示しています。

figure-results-1
図 1: IES の展開。 この図は、ラットモデルにおける腸拡張スリーブの in vivo 展開を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:標準曲線。この画像は、Y = mx + b、Y = 620 nm での吸光度、x = 濃度、m = 0.0118、B = 0.0734、R2 = 0.966 の値で折れ線グラフを使用して生成された標準曲線を示しています。24ウェルプレートの表面積は1.93 cm2で、250 μg、100 μg、50 μg、25 μg、0 μgのウェルで、GLP-2濃度はそれぞれ125.95 μg/cm2、66.38 μg/cm2、23.77 μg/cm2、14.58 μg/cm2、0.00 μg/cm2でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:デバイスと各ウェルのGLP-2濃度。このグラフは、各 IES および VES デバイスについて決定された濃度と、標準曲線の作成に使用された 24 ウェルプレートのウェルを示しています。各スリーブに50μgのGLP-2を添加した後(外部表面積9.425cm2)、デバイスに結合したGLP-2の量は22.69±9.32μg/cm2でした。これは、標準曲線の50μgウェルの23.7μg/cm2に相当します。これらのスリーブに50μgのGLP-2を添加することにより、複数回洗浄した後、添加された薬剤の45%がデバイスに結合しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、GLP-2などのタンパク質ベースの治療薬をPVAコーティングおよび架橋医療機器に結合する方法論を紹介します。結合したGLP-2の濃度は、ウサギ抗GLP-2抗体、ヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ、およびアルカリホスファターゼブルーマイクロウェル基質を添加することにより、PVAコーティングされた24ウェルプレート上に標準GLP-2濃度曲線を作成することによって決定されました。アルカリホスファターゼ酵素に結合した二次抗体は、黄色で始まるアルカリホスファターゼ青色のマイクロウェル基質の添加を可能にし、GLP-2抗体結合アルカリホスファターゼが基質と反応すると青色に変わります。この色の変化を620nmの吸光度で読み取って図 2 の標準曲線を作成し、それらの吸収を使用してGLP-2結合IESおよびVESデバイスの協調を計算します。これらのPVAコーティングデバイスに50μgのGLP-2を添加した後、添加された薬物の45%がデバイスに結合しました。

このプロトコルでは、重要なステップは架橋ステップです。PVAコーティングされた医療機器は、25%のグルタルアルデヒドと94%-98%の硫酸蒸気がPVAをデバイスに架橋するために、気密チャンバー内で48時間以上必要です。この架橋により、反応性基を持つPVAメンブレンは、標的薬物送達のためのタンパク質ベースの治療薬に結合するための安定した生体反応性表面となることができます。5コートの使用は、1〜2コートが1時間、3コートが24時間で再拡張したため、経験的に決定され、腸と膣の拡張に時間をかけて気を散らす力を提供するために、デバイスを再拡張するのに数日かかることを望んでいました。表面積が9.425 cm2のIESおよびVESデバイスは、その小さなサイズと比較して、大量の治療薬をバイオコンジュゲートできる可能性があります。架橋ステップが失敗すると、 図3のIES 2に見られるように、PVAメンブレンの安定性が低下し、生体結合治療薬を保持する能力が低下します。

タンパク質ベースの治療薬をPVAコーティングされた医療機器に共有結合させることで、これらの薬剤を目的の部位に局所的かつ集中的に送達することが可能になると同時に、全身投与やそれに伴うコスト、オフターゲット効果を回避できます。現在、すべての患者の典型的なテドゥグルチド用量は 13 日あたり 50 μg/kg です。各スリーブには22 μg/cm2が搭載されているため、これは1つのデバイスでの全身投与量の約44%に相当します。9.425 cm2の外的な表面積によって、これらの袖はGLP-2の213.85 μgのローカライズされた送達を可能にする。これは全身薬の4.3倍の用量であり、関心のある領域に限局しています。ターゲティング機能により、全身投与の必要性を回避することで、使用する薬剤の量を減らすことができます。現在、テドゥグルチドの年間治療費は、1日あたり50μg/kgの投与量で295,000ドルです5。テドゥグルチドをスリーブに結合させることにより、必要な薬物投与量を減らし、全身性の副作用を最小限に抑える必要があります。.テドゥグルチドの一般的な副作用には、腹痛(28%)、注射部位での反応(26%)、吐き気(26%)、腹部膨満(17%)、頭痛(16%)、嘔吐(14%)などがあります13。

この研究の制限は、バイオコンジュゲート PVA コーティング医療機器からの GLP-2 の時間放出の薬力学と薬物動態です。現在の試験では、GLP-2が架橋PVAデバイスに結合できることが実証されていますが、薬物がPVA膜から放出されるまでにどのくらいの期間結合したままであるか、および移植部位からのGLP-2の総放出の程度についての情報はまだありません。いくつかの洗浄ステップの後、GLP-2はデバイスに付着したままであることがわかっていますが、デバイスへの結合の程度とそれが放出にどのように影響するかは不明です。将来の研究では、生体液に保存されたIESおよびVESからの上清中の放出を測定して in vivo 放出をモデル化するか、 in vivo 移植後の異なる時期にこれらのデバイスを回収して残りのGLP-2を測定することができます。また、pH、温度、湿度などの要因が、本剤の安定性や本剤からの放出速度に影響を与えているかどうかも測定する予定です。今後の実験では、バイオコンジュゲートPVAスリーブを埋め込み、展開後のさまざまな時間やさまざまな設定条件下でスリーブの周囲の薬物濃度を測定することで、これを決定することになります。PVAコーティングされたスリーブの薬力学を知らなければ、局所的なGLP-2投与が一般的な全身投与とどのように比較されるかを判断することはできません。また、PVAコーティングされたスリーブの最大結合容量はまだ不明です。50μgを添加した後、添加した薬剤の45%がスリーブに結合したままであると判断されました。これは、すでに最大結合容量を超えていることを意味する可能性があります。これらのデバイスの真の最大結合容量と、さまざまな用量での放出速度を決定するために、各スリーブに異なる濃度のGLP-2を添加する将来の研究が必要です。

ここでは、PVAコーティングされた医療機器への治療的結合の能力を検証します。その結果、添加されたGLP-2の44%がIESおよびVESデバイスに共有結合しており、GLP-2などのタンパク質ベースの治療薬の高濃度で局所的な送達が可能になったことが示されています。局所的な薬物送達は、治療コストの削減、アクセシビリティの向上、副作用の低減に役立つと期待されています。この方法論は、現在の何百ものタンパク質ベースの治療薬に使用でき、局所的な薬物送達を強化し、治療結果を改善することができます。

開示事項

Jonathan Steven AlexanderとChristen J. Boyerは、3Dプリントされたポリビニルアルコール医療機器および活性化方法の特許US10537659B2を保有しています(2017年)。残りの著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、R. Keith White, MD から Department of Surgery John C. McDonald Chair Fund を通じて、W. Reid Grimes, MD から Department of Surgery Whitney Boggs Endowed Professorship Fund を通じて資金提供を受け、LSU LIFT2 助成金 HSCS-2022-LIFT-002 から資金提供を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗ウサギIgG(全分子)–ヤギで産生されたペルオキシダーゼ抗体Sigma-AldrichA0545-1ML
BluePhos Microwell Substrate KitSera Care5120-0059
GenClone 25-107, 24-well Cell Culture Plates Flat Bottom Wells, TC Treated, 100 Plates/UnitGenesee Scientific 25-107
GLP-2 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (3K3P5)Invitrogen MA5-42869
グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2) (1-33), ratEchelon Biosciences195262-56-7
グルタルアルデヒド、25%水溶液Sigma-Aldrich111-30-8
Nalgene ポリプロピレンデシケーター、ストップコック付きThermoFisher Scientific5310-0250
ポリ(ビニルアルコール)Sigma-Aldrich9002-89-5
硫酸(TraceMetal Grade)、フィッシャーケミカルッシャーサイエンティフィックA510-P212
フィ

参考文献

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