方法論記事

CUT&RUNシーケンシングデータの入門解析と検証

DOI：

10.3791/67359

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2024年12月13日

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1Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、バイオインフォマティクスの初心者に、CUT&RUNシーケンシングデータの初期解析とバリデーションを完了するための入門的なCUT&RUN解析パイプラインをガイドします。ここで説明する分析ステップを完了し、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーはクロマチン制御に関するメカニズムの洞察を引き出すことができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN技術は、ゲノム全体にわたるタンパク質-DNA相互作用の検出を容易にします。CUT&RUNの代表的なアプリケーションには、ヒストンテール修飾のプロファイリング変更や、転写因子のクロマチン占有率のマッピングなどがあります。CUT&RUNが広く採用されるようになったのは、従来のChIP-seqに比べて、細胞投入量やシーケンシング深度の要件が低いこと、抗体エピトープをマスクする架橋剤がないためにバックグラウンドシグナルが減少することで感度が向上することなど、技術的な利点が一因となっています。また、ヘニコフ研究室による試薬の寛大な共有や、初心者への普及を加速するための市販キットの開発により、CUT&RUNの普及が進んでいます。CUT&RUNの技術的な採用が進むにつれ、CUT&RUNのシーケンシング解析とバリデーションは、主にウェットラボチームによる完全な採用を可能にするために克服しなければならない重大なボトルネックとなっています。CUT&RUN解析は、通常、生のシーケンシングリードの品質管理チェックから始まり、シーケンシングの深さ、リード品質、潜在的なバイアスを評価します。次に、リードをリファレンスゲノム配列アセンブリにアラインメントし、その後、いくつかのバイオインフォマティクスツールを使用して、タンパク質濃縮のゲノム領域にアノテーションを付け、データの解釈可能性を確認し、生物学的結論を導き出します。CUT&RUNデータ解析をサポートするために、複数の in silico 解析パイプラインが開発されていますが、その複雑なマルチモジュール構造や複数のプログラミング言語の使用により、複数のプログラミング言語に精通していないバイオインフォマティクスの初心者にとっては、CUT&RUNの解析手順を理解し、解析パイプラインをカスタマイズしたいと考えている人にとっては、このプラットフォームは困難です。ここでは、バイオインフォマティクスの経験が豊富なユーザー向けに、単一言語のステップバイステップのCUT&RUN解析パイプラインプロトコルを提供します。このプロトコルには、シーケンシングデータが生物学的解釈に適していることを確認するための重要な品質チェックを完了することが含まれます。本稿で紹介した導入プロトコルに従い、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーは自身のCUT&RUNデータセットから生物学的な知見を引き出すことができると期待しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質とゲノムDNAとの間の相互作用を測定する能力は、クロマチン制御の生物学を理解するための基本です。特定のタンパク質のクロマチン占有率を測定する効果的なアッセイは、少なくとも2つの重要な情報を提供します:i)ゲノム局在とii)特定のゲノム領域におけるタンパク質の存在量。クロマチンに関心のあるタンパク質の動員と局在の変化を追跡することで、タンパク質の直接的な標的遺伝子座を明らかにし、転写の調節、DNA修復、DNA複製などのクロマチンベースの生物学的プロセスにおけるそのタンパク質の機構的役割を明らかにすることができます。現在、タンパク質とDNAの相互作用をプロファイリングする技術が利用可能なため、研究者はこれまでにない解像度で制御を探求することができます。このような技術的進歩は、Henikoff研究室によるCleavage Under Targets and Release Using Nuclease(CUT&RUN)の開発を含む新しいクロマチンプロファイリング技術の導入によって可能になりました。CUT&RUNは、従来のクロマチン免疫沈降法 (ChIP) に比べて、細胞投入量が少なく、シーケンシング深度が不十分で、抗体エピトープを隠す架橋剤がないためバックグラウンドシグナルが減少し感度が向上するなど、いくつかの技術的利点があります。この手法をクロマチン制御の研究に採用するには、この手法の根底にある原理を十分に理解し、CUT&RUNデータの解析、検証、解釈の方法を理解する必要があります。

CUT&RUNの手技は、磁気ビーズに結合したコンカナバリンAに細胞を結合させることから始まり、手技全体を通して低い細胞数を操作できるようになります。単離された細胞は、目的のタンパク質を標的とする抗体の導入を容易にするために、中性界面活性剤を使用して透過処理されます。次に、ミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)は、酵素につながれたプロテインAまたはプロテインA/Gタグを使用して、結合した抗体にリクルートされます。カルシウムは酵素活性を開始するために導入されます。MNase消化は、モノヌクレオソームDNA-タンパク質複合体をもたらします。その後、カルシウムをキレート化して消化反応を終了させ、MNase消化から得られた短いDNA断片を核から放出した後、DNA精製、ライブラリー調製、ハイスループットシーケンシングを行います1 (図1)。

ゲノム全体のタンパク質占有率をマッピングおよび定量化するインシリコアプローチは、DNAとタンパク質の相互作用を濃縮するために使用されるウェットラボアプローチと並行して開発されました。濃縮されたシグナル(ピーク)の領域の同定は、バイオインフォマティクス解析における最も重要なステップの1つです。初期のChIP-seq解析法では、MACS2やSICER3などのアルゴリズムを使用し、統計モデルを用いて真正なタンパク質-DNA結合部位をバックグラウンドノイズから区別しました。しかし、CUT&RUNデータのバックグラウンドノイズが少なく、解像度が高いため、ChIP-seq解析で使用される一部のピークコールプログラムはCUT&RUN解析には適していません4。この課題は、CUT&RUNデータの解析により適した新しいツールの必要性を浮き彫りにしています。SEACR4は、ChIP-seq解析に通常使用されるツールに関連する制限を克服しながら、CUT&RUNデータからのピークコールを可能にするために最近開発されたツールの1つです。

CUT&RUNシーケンシングデータからの生物学的解釈は、解析パイプラインのピークコールの下流の出力から引き出されます。CUT&RUNデータから呼び出されたピークの生物学的関連性を予測するために、いくつかの機能アノテーションプログラムを実装することができます。例えば、Gene Ontology(GO)プロジェクトは、関心のある遺伝子の確立された機能的同定を提供します5,6,7。さまざまなソフトウェアツールやリソースにより、GO解析が容易になり、CUT&RUNピーク8、9、10、11、12、13、14に濃縮された遺伝子や遺伝子セットが明らかになります。さらに、Deeptools15、Integrative genomics viewer(IGV)16、UCSC Genome Browser17などの可視化ソフトウェアにより、ゲノム全体の関心領域におけるシグナル分布とパターンの可視化が可能になります。

CUT&RUNのデータから生物学的な解釈を引き出すことができるかどうかは、データ品質の検証に大きく依存します。バリデーションを行う重要なコンポーネントには、i) CUT&RUNライブラリのシーケンシング品質、ii) 複製類似性、iii) ピークセンターでのシグナル分布の評価が含まれます。3つのコンポーネントすべてのバリデーションを完了することは、CUT&RUNライブラリのサンプルとダウンストリーム解析結果の信頼性を確保するために重要です。そのため、バイオインフォマティクスの初心者やウェットラボの研究者が、標準的なCUT&RUN解析パイプラインの一部としてこのような検証ステップを実施できるように、CUT&RUN解析の入門ガイドを作成することが不可欠です。

ウェットラボでのCUT&RUN実験の開発と並行して、CUT&RUNTools 2.018,19、nf-core/cutandrun20、CnRAP21など、さまざまなin silico CUT&RUN解析パイプラインが開発され、CUT&RUNデータ解析を支援してきました。これらのツールは、シングルセルおよびバルクのCUT&RUNおよびCUT&Tagデータセットを解析するための強力なアプローチを提供します。しかし、比較的複雑なモジュール化されたプログラム構造や、これらの解析パイプラインを実行するために複数のプログラミング言語に精通している必要があるため、CUT&RUNの解析ステップを徹底的に理解し、独自のパイプラインをカスタマイズしようとするバイオインフォマティクスの初心者には採用が妨げられる可能性があります。この障壁を回避するには、シンプルな単一のプログラミング言語を使用してエンコードされたシンプルなステップバイステップのスクリプトで提供される新しい入門的なCUT&RUN解析パイプラインが必要です。

この記事では、新規ユーザーや初心者ユーザーがCUT&RUNシーケンシング解析を実施できるように、ステップバイステップのスクリプトと詳細な説明を提供する、シンプルな単一言語のCUT&RUN解析パイプラインプロトコルについて説明します。このパイプラインで使用されるプログラムは、元の開発者グループによって公開されています。このプロトコルに記載されている主なステップには、リードアライメント、ピークコール、機能解析、そして最も重要なのは、生物学的解釈に対するデータの適合性と信頼性を判断するためのサンプル品質を評価するためのバリデーションステップです(図2)。さらに、このパイプラインにより、ユーザーは公開されているCUT&RUNデータセットに対して解析結果を相互参照することができます。最終的に、このCUT&RUN解析パイプラインプロトコルは、バイオインフォマティクス解析の初心者やウェットラボの研究者にとって、入門ガイドおよびリファレンスとして機能します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意: GSE126612のCUT&RUN高速qファイルに関する情報は 、表1に記載されています。この調査で使用したソフトウェアアプリケーションに関連する情報は、 資料の表に記載されています。

1. GithubページからEasy-Shells_CUTnRUNパイプラインをダウンロードする

  1. オペレーティングシステムからターミナルを開きます。
    注意: ユーザーがmacOSおよびWindowsでターミナルを開く方法がわからない場合は、このWebページ(https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/)を確認してください。Linux の場合は、この Web ページ (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/) を確認してください。
  2. ターミナルで 「wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip」と入力して、圧縮された分析パイプラインを Github からダウンロードします。
  3. zipファイルをダウンロードしたら、ターミナルに unzip ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip -d ~/Desktop/と入力して、ダウンロードしたzipファイルを解凍します。
  4. 解凍後、ターミナルに rm ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip と入力してzipファイルを削除し、 mv ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN-master ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUNと入力してフォルダ名を変更します。
  5. zipファイルを削除した後、ターミナルで chmod +x ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/script/*.sh と入力して、作業ディレクトリ内のすべてのシェルスクリプトの実行可能権限を設定します。これからは、これらのシェルスクリプトのパスと名前をターミナルに入力するか、スクリプトをターミナルにドラッグしてEnterキーを入力し、ターミナルでこれらのシェルスクリプトを実行します。
    注: Bash シェルは通常、ほとんどの Linux ディストリビューションにプリインストールされています。ただし、最近のmacOSバージョンでは、Bashシェルがプリインストールされなくなりました。システムにBashがない場合は、最初にBashシェルをインストールします。Linux OS(https://ioflood.com/blog/install-bash-shell-linux/)およびmacOS(https://www.cs.cornell.edu/courses/cs2043/2024sp/styled-3/#:~:text=The first thing you will,you will see the following:)にBashシェルをインストールする方法については、以下のリンクを参照してください。これらのステップバイステップのシェルスクリプトは、このディレクトリ内でこのCUT&RUN解析のほとんどを変更せずに実行するためのフォルダ~/Desktop/GSE126612 を作成するように書かれています。これらのシェルスクリプトの使用方法を理解している場合、ユーザーはこれらのシェルスクリプトを修正およびカスタマイズして、他のCUT&RUNデータセットを分析し、プロジェクト固有のニーズに応じてオプションを変更することができます。これらのシェル スクリプトを読み取って編集するには、主要なオペレーティング システムで使用できる使いやすいプログラムの 1 つのオプションとして Visual Studio Code (https://code.visualstudio.com/) を使用することを検討してください。

2. Easy Shells CUTnRUNに必要なプログラムのインストール

  1. Script_01_installation_***.shという名前のシェルスクリプトの中から、ユーザーのシステムのオペレーティングシステムタイプを含む名前のシェルスクリプトを見つけてください。現在、Easy Shells CUTnRUNは、macOS、Debian/Ubuntu、およびCentOS/RPMベースのシステムのインストールスクリプトをサポートしています。
  2. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  3. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  4. ターミナルで、 ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_01_installation_***と入力し てインストールシェルスクリプトを操作するか.shシェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
  5. /path/to/SEACR-1.3/Testfilesフォルダ内の Test_README.md ファイルを読み込みます。READMEファイルの指示に従って、ユーザーのシステムのSEACRが正しく動作しているかどうかを確認してください。
    注意: SEACR Githubページが提供するテストファイルを使用してSEACR機能を検証することは、CUT&RUNデータから適切なピーク呼び出し結果を取得することが重要です。したがって、SEACRのインストール直後に、/path/to/SEACR-1.3/TestfilesのTest_README.md の指示に従ってください。Easy Shells CUTnRUNは、一部のオペレーティング・システム用のインストール・シェル・スクリプトを提供しますが、これらのスクリプトは、一部のユーザーのシステムでは、Easy Shells CUTnRUNに必要なすべてのプログラムをインストールするために機能しない場合があります。インストールに問題がある場合は、アンインストールしたプログラムの元のWebサイトを確認するか、Easy Shells CUTnRUNのgithub問題Webページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。

3. Sequence Read Archive (SRA) から公開されているCUT&RUNデータセットのダウンロード

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_02_download-fastq.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i) 1つのフォルダ(~/Desktop/GSE126612/fastq)を作成し、fastqフォルダ内にテキストファイル(~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/sample_info/SRR_list.txt)に書かれたSRAファイルのリストをダウンロードします。たとえば、SRR_list.txtには、GSE126612 CUT&RUNサンプルのサブセットのfastqファイルが含まれています。(ii)fastqフォルダ内の生のfastqファイルをダウンロードします。(iii) フォルダ(~/Desktop/GSE126612/log/fastq)を1つ作成し、このログフォルダ内にログファイル(download-fastq_log.txt)とダウンロードしたサンプル情報ファイル(SRR_list_info.txt)を書き留めます。
  4. スクリプトを実行した後、ログファイルを確認します。ログファイル内にエラーメッセージがある場合は、エラーを修正し、手順3.3を再試行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)で助けを求めてください。
    注: このCUT&RUN解析パイプラインの実践を容易にするため、SRAから公開されているサンプルは、模擬対照 (IgG) から1サンプル、クロマチンアーキテクチャおよび転写因子タンパク質 (CTCF) から3サンプル、活性ヒストンマークに対応する4サンプル (H3K27Ac)、RNAポリメラーゼIIでマークされた転写開始領域に対応する3サンプル (RNAPII-S5P) です。シーケンシングはペアエンドとして実行したため、サンプルごとに2つのファイルがペアになります。

4. 生のシーケンシングファイルの初期品質チェック

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_03_fastQC.sh と入力するか、シェルスクリプトをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このシェルスクリプトは、(i) ~/Desktop/GSE126612/fastq フォルダ内のすべての生のfastqファイルに対してFastQCプログラムを実行し、品質チェックレポートファイルを ~/Desktop/GSE126612/fastqc.1st フォルダに保存します。(ii) FastQC実行ごとにログファイル(fastqc.1st.log.SRR-number.txt)をログフォルダ(~/Desktop/GSE126612/log/fastqc.1st)に書き留めます。
  4. シェル・スクリプトの実行が完了したら、ログ・ファイルを確認して、実行が成功したことを確認します。ログファイル内にエラーメッセージがある場合は、エラーを修正し、手順4.3を繰り返します。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:出力ファイルの中には、fastqc.htmlファイルにはユーザーフレンドリーな品質チェック結果が含まれています。深刻な品質問題がある場合は、バイオインフォマティクスの同僚と話し合って、ダウンストリーム分析へのデータの適合性を判断してください。同様の品質管理レポートは、アダプターのトリミング後のデータ品質の向上を確認するために使用されます。このスクリプトを他のデータセットに使用するには、ユーザーのニーズに合わせて作業ディレクトリと出力ディレクトリのパスを編集します。CUT&RUNのQCをChIP-seqリードと比較して解釈する場合の顕著な違いは、CUT&RUNの重複リードが必ずしもPCRの重複を示すわけではないことです。これは、募集されたMNaseが実験グループ内の同じまたは類似の場所で消化されるためです。

5. 生のシーケンシングファイルの品質とアダプターのトリミング

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_04_trimming.sh と入力するか、 Script_04_trimming.sh スクリプトをターミナルにドラッグして入力します。
    注: このシェルスクリプトは、(i) ~/Desktop/GSE126612/fastq にあるすべての生の fastq ファイルに対して Trim-Galore プログラムを実行し、アダプタと品質のトリミングを実行します。(ii) フォルダ (~/Desktop/GSE126612/trimmed) を 1 つ作成し、トリミングしたフォルダ内に Trim-Galore 出力ファイルを保存します。(iii) ログフォルダ (~/Desktop/GSE126612/log/trim_galore) を 1 つ作成し、Trim-Galore の実行ごとにログファイル を 1 trim_galore_log_RSS-number.txt 書き留めます。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを慎重に確認してください。ログファイル内にエラーメッセージがある場合は、エラーを修正し、手順5.3を繰り返します。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
  5. このプロセスが完了したら、.html出力ファイルと 4.3 で作成されたfastqc.htmlファイルを比較します。入力ディレクトリと出力ディレクトリのパスを修正して、他の場所にある fastq ファイルのトリミング手順を実行します。

6. 実サンプルおよびスパイクインコントロールサンプルの参照ゲノムのbowtie2インデックスのダウンロード

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_05_bowtie2-index.sh と入力するか、シェルスクリプトをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)実際のサンプル参照ゲノム(ヒト;hg19;元の出版物22で使用)およびSpike-in制御参照ゲノム(出芽酵母;R64-1-1)をbowtie2-indexフォルダ(~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/bowtie2-index)に格納します。(iii) ログファイル (bowtie2-index-log.txt) をログディレクトリ (~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-index) に書き留めます。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを確認します。エラーメッセージが表示された場合は、エラーを修正し、手順6.3を繰り返します。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:現在、Bowtie2のウェブサイト(https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)では、さまざまな参照ゲノムのBowtie2インデックスを提供しています。ユーザーは、 Script_05_bowtie2-index.sh を編集して、ユーザーの要件を満たす任意のBowtie2インデックスをダウンロードできます。ユーザーが目的の参照ゲノムのBowtie2インデックスを見つけることができない場合は、以下から参照ゲノム配列fastaファイルを見つけてください。
    1. Ensembl ftp (https://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/)
    2. UCSC の Web ページ (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/downloads.html)
    3. または他の種固有のデータベース。
      参照ゲノム配列のfastaファイルを見つけたら、Bowtie2 Webサイトの「The bowtie2-build indexer」セクション(https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-build-indexer)に従って、ダウンロードした参照ゲノムのBowtie2インデックスを作成します。

7. トリミングされたCUT&RUNシーケンシングリードのリファレンスゲノムへのマッピング

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_06_bowtie2-mapping.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このシェルスクリプトは、(1)bowtie2プログラムを実行して、すべてのアダプターと高品質のトリミングされたfastqファイルを実験(ヒト;hg19)とスパイクイン制御(出芽酵母;R64-1-1)は独立してゲノムを参照します。(ii) samtools ビュー 機能を実行して、マップされた読み取りペアファイルを bam 形式で圧縮します。(iii) フォルダ (~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mapped) を 1 つ作成し、圧縮された mapped 読み取りペア ファイルを bowtie2-mapped フォルダ内に保存します。(iv) 1つのフォルダ(~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-mapped)を作成し、hg19参照ゲノムにマッピングされたリードペアはテキストファイル bowtie2_log_hg19_SRR-number.txt 、R64-1-1にマッピングされたリードペアは bowtie2_log_R64-1-1_SRR-number.txt )としてマッピング処理のログをbonet2-mappingログフォルダ内に書き留めます。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを確認します。ログ・ファイル内にエラー・メッセージがある場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトを再実行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:このシェルスクリプトは、ペアエンドシーケンシングファイルをマップするオプションを使用してbowtie2を実行し、フラグメント長が10 bp〜700 bpの一致するマッピングされた読み取りペアを見つけます。ターミナルで bowtie2 --help と入力するか、bowtie2のWebサイト(https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-aligner)にアクセスしてオプションの説明を確認し、必要に応じてオプションを理解して変更します。このシェルスクリプトを使用して、fastq ファイルと Bowtie2 インデックスのパスと名前の形式を変更することにより、他の fastq ファイルをマップします。

8. マップされた読み取りペア ファイルの並べ替えとフィルタリング

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトのシェルがBashでない場合は、ターミナルで「chsh -s $(which bash)」と入力して、Bashシェルをデフォルトのシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_07_filter-sort-bam.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mappedフォルダ内のすべての圧縮されたマップされた読み取りペアファイルに対してsamtoolsビュー機能を実行し、非正規染色体領域、公開注釈付きブラックリスト、およびTAリピート領域にマップされた読み取りペアをフィルタリングします。(ii) samtools の sort 関数を実行して、フィルタリングされた bam ファイルをフラグメントの名前または同じディレクトリ内の座標でソートします。(iii) ~/Desktop/GSE126612/log/filter-sort-bam ディレクトリに入力された bam ファイルごとにログファイルを書き留めてください。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを慎重に確認してください。ログ・ファイルにエラー・メッセージがある場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトの実行を再試行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注: フラグメントの名前でソートされた結果の bam ファイル (出力) は、フラグメント BED および生の readcounts bedGraph ファイルを作成するための入力ファイルとして機能します。座標でソートされた bam ファイルは、フラグメント BEDPE ファイルを生成するための入力ファイルとして機能します。すべての BED、bedGraph、および BEDPE は、ダウンストリーム解析でのピーク呼び出しと視覚化に使用されます。標準染色体領域 (chr1~22, chrX, chrY, chrM)、公開アノテーション付きブラックリスト領域23 、TA リピート領域18 のすべてのアノテーションベッドファイルは、 ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/blacklist ディレクトリにあります。必要に応じて、このディレクトリを使用してブラックリストファイルを追加します。このシェル・スクリプトを使用して、bam ファイルのパスと名前を変更することにより、他のマップされた読み取りペア bam ファイルに対して同じ機能を実行します。ターミナルで samtools view --help と samtools sort --help と入力して、これらの機能についてさらに説明してください。

9. マッピングされた読み取りペアをフラグメント BEDPE、BED、および生の readcounts bedGraph ファイルに変換します

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注: このスクリプトは、(i) macs3 filterdup と awk 関数を実行して、座標でソートされた bam ファイルをフラグメント長が 1kb 未満のフラグメント BEDPE ファイルに変換し、BEDPE ファイルを ~/Desktop/GSE126612/BEDPE に保存します。(ii) ログディレクトリ (~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-BEDPE) を作成し、マッピングされた読み取りフラグメントファイルごとにログファイルを書き留めます。(iii) bedtools bamtobed と awk, cut, sort 関数を実行して、フラグメントの名前でソートされた bam ファイルをフラグメント長が 1 kb 未満のフラグメント BED ファイルに変換します。(iv) フォルダ (~/Desktop/GSE126612/bam-to-bed) を 1 つ作成し、bam-to-bed フォルダ内にフラグメント BED ファイルを保存します。(v) マッピングされた読み取りフラグメントBEDファイルごとにログファイルをログディレクトリ(~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-bed)に書き留めます。(vi) bedtools genomecov 関数を実行し、1つのフォルダ(~/Desktop/GSE126612/bedGraph)内のフラグメントBEDファイルを使用して、生のreadcounts bedGraphファイルを生成します。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを注意深く確認してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注: 出力された未処理の readcounts bedGraph ファイルは、セクション 12 の正規化オプションとセクション 10 のスケーリングされたフラクショナル readcount (SFRC) 正規化22 を備えた SEACR ピーク呼び出し元プログラムの入力ファイルとして使用されます。フラグメントBEDファイルは、セクション 10.To のネガティブコントロール（SRPMC)正規化24,25でマッピングされたSpike-in正規化リード数100万当たりリードの入力ファイルとして機能します。クロマチン関連因子のCUT&RUNデータのみの短いフラグメント（>100bp)をキャプチャしたり、このスクリプトのフラグメントフィルタリングステップを変更して、正規化ステップを続行します。同じサンプル内の短いサイズのフラグメントと通常のサイズのフラグメント間でCUT&RUN信号を比較するには、SFRCノーマライゼーションが短いフラグメントのみのキャプチャによる潜在的なダウンサンプリング効果を減らすのに役立つ場合があります。このシェル・スクリプトを使用して、bam ファイルと bed ファイルのパスと名前の形式を変更することにより、他のペア・エンド・シーケンス・ソート bam ファイルに対して同じプロセスを実行します。

10. 未加工の readcounts bedGraph ファイルを正規化された bedGraph および bigWig ファイルに変換する

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SFRC.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは次のように書かれています:(i)awk関数でforループを実行し、 ~/Desktop/GSE126612/bedGraph内の生のreadcounts bedGraphファイルを使用してSFRC正規化されたbedGraphファイルを作成します。(ii) bedGraphToBigWig 関数を実行して、 ~/Desktop/GSE126612/bigWig に SFRC 正規化された bedGraph ファイルの圧縮形式 (.bw) を作成します。(iii) SFRC計算に使用した正規化係数を1回の実行ごとに記録するログファイルを1つ書き留め、 ~/Desktop/GSE126612/log/SFRC内にログファイルを保存します。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを確認します。エラーメッセージが表示された場合は、エラーを修正し、シェルスクリプトを再度実行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注: スケーリングされた小数 readcount の正規化は、CUT&RUN データセットの元の出版物22 で使用GSE126612。 bin i での正規化の公式は、以下と同じです。
    figure-protocol-1
    このノーマライゼーション法には、ネガティブコントロール(IgGサンプルなど)によるノーマライゼーションやスパイクインコントロールが含まれていないため、サンプル間のゲノムワイドなシグナルの違いを観察するには、このアプローチは理想的ではない可能性があります。ただし、この方法は理論的には他の合計読み取りカウントベースの正規化 (Count Per Million など) と類似しているため、サンプル間のローカル信号の違いを観察するのに十分です。
  5. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SRPMC.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)bedtools genomecov関数でforループを実行し、~/Desktop/GSE126612 GSE126612/bam-to-bedのフラグメントBEDファイルを使用して、~/Desktop//bedGraphにSRPMC正規化されたベッドグラフファイルを作成します。(ii) SRPMC の正規化に使用された正規化係数を ~/Desktop/GSE126612/log/SRPMC に記録するログファイルを書き留めます。(iii) bedGraphToBigWig 関数を実行して、正規化された bedGraph ファイルの圧縮形式 (.bw) を作成し、正規化された bigWig ファイルを ~/Desktop/GSE126612/bigWig フォルダに保存します。
  6. 実行が完了したら、ログファイルを慎重に確認してください。ログ・ファイル内にエラー・メッセージがある場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトを再実行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:SRPMC正規化の式は、RPM(Reads Per Million mapped reads)正規化係数、RPS(Rep-per Spike-in reads比率)、および制御24,25への相対信号比を組み合わせることにより、ネガティブコントロール(IgGサンプルなど)とスパイクイン制御の両方で実際のサンプルリードカウントを正規化するために開発されました。RPSの定義は以下と同じです。
    figure-protocol-2
    実サンプルとネガティブコントロールサンプルの両方にRPSを適用すると、実サンプルの制御に対する相対信号比(RS)は次のように計算できます。
    figure-protocol-3
    また、RPM正規化係数(RPM:NF)の定義は以下と同じです。
    figure-protocol-4
    ここから、RS と RPM:NF を組み合わせることにより、SRPMC 正規化係数 (SRPMC:NF) が出力されます。
    figure-protocol-5
    そして、この式は次のように簡略化できます。
    figure-protocol-6
    したがって、SRPMC法では、(1)コントロールとサンプル間のスパイクインリードの比率、および(2)RPM正規化コントロールリードの比率でリードを正規化します。この正規化係数はスパイクインリードを考慮し、サンプル間でコントロールリードを比較可能にするため、この方法は、サンプル間のゲノムワイドな違いを観察し、異なるバッチ実験における実際のサンプルとコントロールの合計リードのバッチ効果を減らすのに適しています。これらの正規化されたbedGraphファイルは、セクション11でSEACRを使用してピークを呼び出すための入力ファイルになります。また、これらの正規化されたbigWigファイルは、IGVによる遺伝子座の視覚化や、Deeptoolsによるヒートマップと平均プロットの作成に使用されます。データ品質を評価するためには、ゲノムブラウザを使用して、代表的なゲノム領域で正規化されたbigWigファイルを使用してCUT&RUNデータセットのランドスケープパターンを視覚化することを強くお勧めします。IgGコントロールに似たノイズの多いバックグラウンドシグナルパターンを示すCUT&RUNサンプルは、ダウンストリーム解析では省略するのが適切です。これらのシェル・スクリプトを使用して、入力と出力の両方のベッド・ファイルとベッドグラフ・ファイルのパスとファイル名を変更することにより、他の読み取りベッド・ファイルと未加工の readcounts bedGraph ファイルを正規化します。これらのスクリプトを編集して、このスクリプト内の係数と式を変更することにより、他の正規化計算を適用します。

11. フラグメントサイズ分布の検証

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_10_insert-size-analysis.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注: このスクリプトは、(i) ~/Desktop/GSE126612/filtered-bam フォルダ内のマップされた読み取りペア bam ファイルを使用して picard.jar CollectInsertSizeMetrics 関数を実行し、挿入サイズの分布を特定するために記述されています。(ii) フォルダ(~/Desktop/GSE126612/insert-size-distribution)を1つ作成し、作成したフォルダに挿入サイズ分布の解析結果を保存します。(iii) ~/Desktop/GSE126612/log/insert-size-distribution フォルダ内の入力 bam ファイルごとにログファイルを書き留めてください。
  4. 実行が完了したら、ログファイルを注意深く確認してください。ログ・ファイル内にエラー・メッセージがある場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトの実行を再試行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:一般に、CUT&RUNサンプルのインサートサイズ解析 (出力) では、モノ (100-300 bp) およびジ (300-500 bp) のヌクレオソームサイズ範囲に主要なピークが見られます。技術的なエラーや制限 (CUT&RUNサンプル調製中のMNaseの過剰消化/消化不足や、ライブラリー調製中の不適切なサイズ選択など) により、トリヌクレオソームフラグメント以上 (500-700 bp) およびサブヌクレオソームフラグメントより同等またはそれより短いフラグメント (<100 bp) が濃縮される可能性があります。長鎖フラグメント(>500 bp)と短分子フラグメント(<100 bp)の濃縮にモノヌクレオソームサイズのピークが存在しないのは、ウェットラボステージで選択したライブラリーサイズの選択範囲、またはシーケンシング深度が低いことが原因である場合があります。シーケンシングの深さ ('total sequencingd bases' / 'total reference genome size')、セクション10の正規化されたreadcounts bigWigファイルを使用したゲノムランドスケープの概要、およびインサートサイズの分布パターンを一緒に比較して、処理されたCUT&RUNサンプルの品質を明らかにします。ヒストグラムの破線は、挿入サイズが X 軸の値以上の読み取りの「累積割合」を表しています。この破線により、入力マップ読み取りファイル内の挿入サイズの分布を識別できます。X軸に沿った進行は、チップサイズの増加と関連しています。破線は、入力 bam ファイル内のマップされた読み取りペアのうち、交差する x 軸の位置に示されている以上の挿入サイズを持つものの割合を示します。したがって、解釈は左側の 1 から始まり、すべての読み取りの挿入サイズが最小サイズ以上であることを示し、挿入サイズが大きくなるにつれて 0 に向かって減少します。

12. MACS2、MACS3、SEACRを使用したピークの呼び出し

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_MACS.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)フラグメントBEDPEファイルを使用してIgG制御の有無にかかわらず macs2 callpeak および macs3 callpeak 関数を実行し、ピークを呼び出し、ピーク呼び出し結果を出力ディレクトリ(~/Desktop/GSE126612/MACS2 および ~/Desktop/GSE126612/MACS3)に保存します。(ii) これらのピークコールのログをテキストファイルとしてログディレクトリ(~/Desktop/GSE126612/log/MACS2 および ~/Desktop/GSE126612/log/MACS3)に書き留めます。
  4. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_SEACR.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)IgG制御の有無にかかわらず、 SEACR_1.3.sh生の readcounts bedGraphおよび正規化されたbedGraphファイルを使用してピークを呼び出すための厳密で緩和されたオプションを使用して、スクリプトを実行します。(ii) 出力ディレクトリ (~/Desktop/GSE126612/SEACR-peaks) を作成し、ピーク呼び出し結果を SEACR で保存します。(iii) これらのピークコールのログをテキストファイルとしてログディレクトリ(~/Desktop/GSE126612/log/SEACR)に書き留めます。
  5. シェルスクリプトの実行が完了したら、ログファイルを注意深く確認してください。ログ・ファイルにエラー・メッセージがある場合は、まずエラーを修正してください。プログラムによっては、IgG制御オプション付きIgG制御サンプルのピークを一緒に呼び出さない場合があるため、IgG制御オプション付きIgG制御サンプルに関するエラーメッセージを省略しています。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注意: これら 2 つのシェルスクリプトは、3 つのピークコーラー (MACS2、MACS3、SEACR) を使用して CUT&RUN サンプルのピークコーリングを行います。IgG 制御オプションの有無にかかわらず、raw readcounts bedGraph ファイルを使用してピークコーラーの正規化オプションを使用するか、ピークコーラーの正規化オプションなしで正規化された readcounts bedGraph ファイルを使用し、厳密で緩和された SEACR ピークコーリングオプションを使用します。ピーク呼び出し出力ファイルはダウンストリーム解析で直接使用するには十分ではないため、Easy Shells CUTnRUNには、これらのピーク出力ファイルを処理して、染色体、開始、終了、ピークの名前を含む新しいピークファイルを作成するスクリプトが1つ含まれています。Easy Shells CUTnRUNは、集中的なピークコールアプローチを通じて、3つのピークコール間でコールされたピークを比較することにより、ユーザーのCUT&RUNプロジェクトに最適なピークコールプログラムを選択する機会を提供します。さらに、このCUT&RUN解析パイプラインは、ユーザーのCUT&RUNプロジェクトに最適なピークコールオプションを選択する機会も提供します。これらの比較は、ベン図によって行われ、ヒートマップと平均プロットとして視覚化されます。

13. ピークベッドファイルの作成

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_12_make-peak-bed.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)~/Desktop/GSE126612/SEACRフォルダ内のベッドファイルを使用してawk機能を実行し、2種類のSEACRピークベッドファイル~/Desktop/GSE126612/peak-bed_SEACRフォルダを作成します。ピークベッドファイル全体には各ピークの開始と終了が含まれ、フォーカスされたピークベッドファイルには、各ピーク内の最も高い信号ビンの開始とベッドが含まれます。(ii) ~/Desktop/GSE126612/MACS2 フォルダと ~/Desktop/GSE126612/MACS3 フォルダの _peaks.xls ファイルを使用して awk 機能を実行し、~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS2 フォルダと ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS3 フォルダに MACS2 と MACS3 が呼び出した各ピークの開始と終了を含むピークベッドファイル全体を作成します。(iii) ~/Desktop/GSE126612/MACS2 フォルダと ~/Desktop/GSE126612/MACS3 フォルダの _summits.bed ファイルを使用して awk 機能を実行し、各ピーク内の最上位ビンの開始と終了を含むフォーカスされたピーク ベッド ファイルを作成します。(iv) ログファイルは、~/Desktop/GSE126612/log/peak-bedフォルダにテキストファイル形式で書き込まれます。
  4. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_13_filter-peaks.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)IgG制御ピークと重複するピークを削除するためにIgG制御オプションなしで呼び出されるピークベッドファイルを使用して 、bedtools交差 関数を実行するために書かれています。(ii) フィルタリングされたピークベッドのファイルは 、~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS2、~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS3、 ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_SEACR フォルダに保存されます。(iii) ログファイル log_filter-peaks.txt が ~/Desktop/GSE126612/log/filter-peaks フォルダに作成されます。
  5. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/s Script_14_cat-merge-peak-bed_MACS.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i) cat および sort 関数を実行して、複製のMACS2およびMACS3全体のピークベッドファイルを1つのピークベッドファイルとして連結し、連結されたピークベッドファイルを ~/Desktop/GSE126612/bed-for-comparison フォルダにソートします。(ii)連結された全ピークベッドファイルを使用して bedtoolsマージ 機能を実行し、互いに重なるピークをマージします。(iii) ログファイル log_cat-merged-peak-bed_MACS.txt がログフォルダ ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bedに書き込まれます。
  6. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_14_cat-merge-peak-bed_SEACR.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i) cat 関数と sort 関数を実行して、replicatesのSEACR全ピークベッドファイルを1つのピークベッドファイルとして連結し、連結されたピークベッドファイルを ~/Desktop/GSE126612/bed-for-compare フォルダにソートします。(ii)連結された全ピークベッドファイルを使用して bedtoolsマージ 機能を実行し、互いに重なるピークをマージします。(iii) ログファイル log_cat-merged-peak-bed_SEACR.txt がログフォルダ ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bed に書き込まれます。
  7. シェル・スクリプトの実行が完了したら、ログ・ファイルを慎重に検討します。ログファイルにエラーメッセージがある場合は、エラーを修正してスクリプトを再度実行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:ピーク領域全体のピークベッドファイルは、ベン図解析の入力ファイルとして使用され、ピークコールオプション、ピークコール方法、反復、およびピーク領域近くのゲノムランドスケープ観測間の類似性を比較します。マージされた全ピーク領域のピークベッドファイルは、主成分(PC)分析およびdeeptoolsを使用したピアソン係数相関分析に使用されます。フォーカスされたピークベッドファイルは、Deeptoolsを使用したヒートマップおよび平均プロット分析に使用されます。

14. ピアソン相関と主成分(PC)分析を使用した反復間の類似性の検証。

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルト シェルである場合、ターミナルに /path/to/bash (または /bin/bash などの同様のメッセージ) が表示される場合があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトでBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップします。
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotCorrelation.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)座標でソートされた反復のbamファイルを使用してmultiBamSummary BEDファイル機能を実行し、CTCF、H3K27Ac、およびRNAPII-S5Pのマージされた全ピークベッドファイルを使用して、Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummaryフォルダにPearson相関分析用のマトリックスファイルを生成します。(ii) 行列ファイルを使用してplotCorrelation関数を実行し、Pearson相関係数の計算とヒートマップクラスタリングを行い、結果を~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotCorrelationフォルダに保存します。(iii) ログファイルを ~/Desktop/GSE126612/log/correlation フォルダにlog_plotCorrelation.txt書き留めます。
  4. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotPCA.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)座標でソートされたbamファイルを使用し、すべてのCTCF、H3K27ac、およびRNAPII-S5Pピークを含むマージされた全ピークベッドファイルを使用してmultiBamSummary BEDファイル機能を実行し、Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummaryフォルダに主成分分析(PCA)用のマトリックスファイルを生成するために書かれています。(ii) 行列ファイルを使用してplotPCA関数を実行し、結果を~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotPCAフォルダに保存します。(iii) ログファイルを ~/Desktop/GSE126612/log/correlation フォルダにlog_plotPCA.txt書き留めます。
  5. シェル・スクリプトの実行が完了したら、ログ・ファイルを確認します。エラー・メッセージが表示された場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトを再実行してください。解決すべき問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)を使用してサポートを依頼してください。
    注:原則として、適切に準備および処理された反復は、同じクラスタリンググループ内でより高いピアソン相関係数値を示し、主成分分析での位置が近いことを示します。主成分プロットでピアソン相関係数が低く、他の反復からの距離が長い反復は、反復間で潜在的な外れ値を示している可能性があります。このシェルスクリプトは、マップされた読み取りデータ任意の bam 形式に適用できます。bigwig ファイルのパスとファイル名を変更して、プロジェクト固有の要件を満たします。

15. ベン図を使用した反復、ピーク呼び出し方法、およびオプション間の類似性の検証

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルトシェルである場合、ターミナルには /path/to/bash (/ bin/bash など) のようなものが存在する可能性があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトのシェルとしてBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップすることを検討してください
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_methods.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)ピーク領域全体のピークベッドファイルを使用して介入ベン関数を実行し、さまざまなオプション(IgG制御オプションの有無、正規化の有無、SEACRのストリンジェント/リラックスピークコールオプション)によって呼び出されたピーク間のオーバーラップを見つけるために書かれています。(ii) フォルダ (~/Desktop/GSE126612/intervene_methods) を 1 つ作成し、このフォルダにベン図解析結果を保存します。(iii) ログファイルを 1 つ ~/Desktop/GSE126612/log/intervene フォルダにlog_intervene_methods.txt書き留めます。
  4. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_replicates.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注:このスクリプトは、(i)全ピーク領域ピークベッドファイルを使用して介入ベン関数を実行し、レプリケートのピーク間のオーバーラップを見つけるために記述されています。(ii) フォルダ(~/Desktop/GSE126612/intervene_replicates)を1つ作成し、このフォルダにベン図の解析結果を保存します。(iii) ログファイルを 1 つ ~/Desktop/GSE126612/log/intervene フォルダにlog_intervene_replicates.txt書き留めます。
  5. シェル・スクリプトの実行が終了したら、ログ・ファイルを確認します。エラー・メッセージが表示された場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトを再実行してください。Easy Shells CUTnRUN解析パイプラインの使用に問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)でヘルプを求めてください。
    注:これらのベン図解析の結果は、ダウンストリーム解析に最も適したピークコールオプション、メソッド、および再現性の高い反復を選択するための洞察を提供します。ピーク呼び出しオプションと、他のピーク呼び出し方法およびオプションと適切に重複して、最も高い呼び出しピーク番号を示す方法を選択することが好ましい場合があります。

16.ヒートマップと平均プロットを分析して、ピークを視覚化します。

  1. ターミナルを開き、「 echo $SHELL 」と入力して、アクティブなターミナルのデフォルトシェルを確認します。Bash シェルが現在のターミナルのデフォルトシェルである場合、ターミナルには /path/to/bash (/ bin/bash など) のようなものが存在する可能性があります。
  2. デフォルトシェルがBashでない場合は、ターミナルで chsh -s $(which bash) と入力して、Bashシェルをデフォルトシェルとして設定します。ターミナルがデフォルトのシェルとしてBashシェルを使用している場合は、この手順をスキップすることを検討してください
  3. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_focused.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    注: このスクリプトは、(i) 正規化された bigWig ファイルとフォーカスされたピーク ベッド ファイルを使用して computeMatrix 参照ポイント関数を実行し、~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix フォルダー内のフォーカスされたピークの中心に正規化された readcounts マトリックスを作成するために記述されています。(ii) 正規化された readcounts 行列を使用して plotHeatmap 関数を実行し、フォーカスされたピーク位置での正規化された readcounts 分布パターンを視覚化するヒートマップと平均プロットを生成します。(iii) フォルダ(~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap)を1つ作成し、このフォルダ内にplotHeatmapの出力ファイルを保存します。(iv) ログファイルを 1 つ log_plotHeatmap_focused.txt ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap フォルダに書き留めます。
  4. ターミナルに 「~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_whole.sh と入力するか、シェルスクリプトファイルをターミナルにドラッグして入力します。
    このスクリプトは、(i) 正規化された bigWig ファイルとピーク ベッド全体のファイルを使用して computeMatrix 参照点 関数を実行し、 ~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix フォルダー内のピーク全体の中心に正規化された読み取りカウント行列を作成するために書かれています。(ii) 正規化された readcounts 行列を使用して plotHeatmap 関数を実行し、ピーク位置全体で正規化された readcounts 分布パターンを視覚化するヒートマップと平均プロットを生成します。(iii) フォルダ (~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap) を 1 つ作成し、このフォルダ内に plotHeatmap 出力ファイルを保存します。(iv) ログファイル log_plotHeatmap_whole.txt を ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap フォルダに 1 つ書き留めます。
  5. シェル・スクリプトの実行が終了したら、ログ・ファイルを確認します。エラー・メッセージが表示された場合は、エラーを修正し、シェル・スクリプトを再実行してください。Easy Shells CUTnRUN解析パイプラインの使用に問題がある場合は、Easy Shells CUTnRUN github issuesのWebページ(https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues)でヘルプを求めてください。
    注:理想的には、MACS2/3 ピークのピーク山頂位置と SEACR ピークの焦点が合ったピーク位置は、プロットの中心でシャープで焦点が合った信号分布を示します。ただし、ピーク呼び出しアルゴリズムがCUT&RUNデータに対して適切に機能しない場合、プロットにあまり焦点の合っていない「ノイズの多い」信号分布が表示されることがあります。したがって、呼び出されたピークの数と出力プロットのピーク信号分布パターンを使用することで、ダウンストリームのピークアノテーションを含むさらなるCUT&RUN解析のピーク妥当性を判断することができます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

品質とアダプタートリミングにより、高いシーケンシング品質で読み取りを保持
ハイスループットシーケンシング技術は、リードの配列「変異」などのシーケンシングエラーを生成する傾向があります。さらに、シーケンシングアダプターダイマーは、ライブラリ調製中のアダプター除去が不十分なため、シーケンシングデータセットで濃縮できます。リードミューテーション、適切なマッピングに必要な時間よりも短いリードの生成、アダプターダイマーの濃縮など、過剰なシーケンシングエラーは、リードマッピング時間を増加させ、ダウンストリームのバイオインフォマティクス解析結果を歪める偽陽性のマッピングリードを生成する可能性があります。したがって、ダウンストリームの分析と解釈のために高品質の読み取りを保持するには、高品質のフィルタリングとアダプタートリミングが必要です。

解析のための高品質なリードを保持するために、このCUT&RUN解析パイプライン (図2) はFastQC26 とTrim Galore27を採用しています。"Script_03_fastQC.sh" シェルスクリプトは、作業ディレクトリ内のすべての fastq ファイルに対して FastQC を実行します。GSE126612(SRR8581589)から公開されているCTCF CUT&RUNデータセットを使用したこのステップの結果(図3)は、スコアベースが低品質のリード(図3A、C)と、理論的な推定と実際のリードとの間のシーケンスごとのGCコンテンツ分布の不一致(図3E)を特定します。

「Script_04_trimming.sh」スクリプトを実行して Trim Galore を実行すると、スコア ベースが低品質 (図 3A の 20 未満) と平均シーケンス品質が低い読み取りが事前に明らかに削除されました (図 3B-D)。さらに、「Script_04_trimming.sh」は、シーケンスプロット上の「トリミング前」GC分布に表示される平均GC含有量濃縮の55~60%も成功裏に除去します(図3E、F)。これらの結果は、このCUT&RUN解析パイプラインが高品質のリードをフィルタリングし、リファレンスゲノムへの迅速かつ正確なリードマッピングを促進することを示しています。

インサート サイズ分布により、ピーク コール結果の推定値が得られます
CUT&RUN (図 1) では MNase を使用しているため、マッピングされた CUT&RUN リードは、インサートサイズ分布プロット (図 4) 内でモノヌクレオソーム (~200 bp) およびジヌクレオソーム (~350 bp) の DNA フラグメントサイズのピークを示すことが予想されます。一部のターゲットでは、検出に問題があるため、挿入が短くなる可能性があります (< 100 bp) (図 4C)。ハイレベルなショートリードは、信頼性の高いピークコールに使用できるリードの数を減らし、ピーク数を減らし、ダウンストリーム解析に影響を与えます。このCUT&RUN解析パイプラインでは、Script_10_insert-size-analysis.shが「picard.jar CollectInsertSizeMetrics」関数を操作して、インサートサイズ分布解析を行い、ヒストグラムを可視化出力としてエクスポートします(図2)。出力プロット(図4A-C)では、x軸はインサートサイズの範囲を示し、y軸の左側と塗りつぶされたヒストグラムはx軸の値を持つインサートの数を表し、y軸の右側はx軸の値以上のインサートサイズの累積割合を示しています。したがって、ヒストグラムの高レベルと交差する破線の傾きが最も劇的に変化したX軸上の位置は、サンプルの主要なインサートサイズを特定します。目的の参照ゲノム (ヒト、hg19) にマッピングされたリードのうち、H3K27Ac (活性ヒストンマーク) サンプルフラグメントは、モノヌクレオソームサイズが最大で、検出可能なジヌクレオソームサイズのピークが最も高い、期待通りのCUT&RUNインサートサイズ分布を示しています (図 4B)。CTCFサンプルフラグメントは、フラグメント長100~200bpの領域に追加のグループを示しました(図4A)。CUT&RUNの解析パイプラインには、リファレンスゲノムのマッピングリード後にインサートサイズ分布解析を実行するための使いやすいシェルスクリプトが用意されています。これらの分析は、ダウンストリーム分析の前にピーク呼び出しの効率を見積もるときに重要になります。

Easy Shells CUTnRUN分析パイプラインは、信頼できるリードカウントを作成するためのフィルタリングと正規化のオプションを提供します
CUT&RUN解析の重要なポイントの1つは、初期マッピング出力から問題のあるリードペアをフィルタリングし、フィルタリングされたマッピングリードカウントを特定の正規化計算方法で正規化することにより、適切なマッピングリードペアを取得することです。これは、ユーザーの解析の目的/ニーズを満たすことができます。本研究で取り上げたCUT&RUN解析パイプラインには、非標準染色体、公開注釈付きブラックリスト領域23、TAリピート領域18,22のいずれかにマッピングされたリードペアを、"Script_06_bowtie2-mapping.sh"を使用してボウタイ2でマッピングしたリードペアから除去する"Script_07_filter-sort-bam.sh"スクリプトが含まれています。これらのフィルタリングは、ダウンストリーム分析で偽陽性の外れ値スパイク信号とピークと呼ばれる可能性のある読み取りペアを削除するために必要です(図5、黄色のボックス領域)。

ろ過に加えて、正しい正規化方法を適用することは、サンプル間の信号差を正確に視覚化するための重要な要素です。したがって、CUT&RUN解析パイプラインには、公開されている2つの正規化方法、すなわちSFRC (Scaled Fractional Readcout)22とSpike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC)24,25 (図5A-D) の2つの正規化方法を提供する「Script_09_normalization_SFRC.sh」スクリプトと「Script_09_normalization_SRPMC.sh」スクリプトが含まれています).SFRCにはコントロールサンプル(IgGなど)やスパイクインサンプルが含まれていないため、コントロールサンプルを含まないサンプルや、ゲノムワイドスケールの違いがなく局所領域でのみシグナルの違いを示すと予想されるサンプルには、SFRCの正規化を使用できます。CUT&RUN解析パイプラインで処理したSFRC正規化サンプル(図5A-D、赤のトラック)は、GEOから一般に公開されているマッピングリード(図5A-D、黒のトラック)と同じ信号分布パターンを生成しており、このパイプラインがパブリケーション結果を再現できることを示唆しています。

SRPMC法は、コントロールサンプルとスパイクインサンプルの両方を含み、サンプル間の全体的な信号差を示すことが予想されるサンプルを正規化するのに役立ちます(図5A-D、緑のトラック)。1つのH3K27Acサンプル(SRR8581599)は、他の反復(237、175、161)よりもはるかに高い「(実際のCUT&RUNリード)/(スパイクインリード)」比(サンプルRPS;997)を示すため、SFRC正規化サンプルとSRPMC正規化サンプルの反復間で相対的なH3K27Acシグナルは異なって見えます(図5A-D;H3K27Acを全トラックで比較)。RNAPII-S5Pサンプルは、IgGコントロール(259)よりも比較的低いサンプルRPS(1.7、0.8、2.1)を示すため、SRPMC標準化後のRNAPII-S5PサンプルはIgGコントロールよりも低いシグナルを示します(図5A-D;RNAPII-S5Pを全トラックで比較)。したがって、ここで説明するCUT&RUN解析パイプラインでは、IgGコントロールとスパイクインコントロールの両方のリードと比較して、実験サンプルに十分なリードがあるサンプルに対してのみSRPMC法を使用することを推奨しています。

ベン図の比較は、より良いピーク呼び出し方法とオプションを選択するためのアイデアを与えることができます
マルチプルピークコールプログラムにより、ゲノム全体で大幅に濃縮されたタンパク質占有率の同定が可能になります。CUT&RUN解析に採用されたプログラムには、これまでの主な方法として、MACSファミリーのプログラム2とSEACR4があります。しかし、特にバイオインフォマティクスの初心者にとっては、特定のCUT&RUNプロジェクトに最適なピークコール方法とオプションを特定することは困難な場合があります。そのため、CUT&RUN解析パイプラインにはベン図解析ステップが含まれており、さまざまなピークコールオプション (Script_17_intervene-オプション) とピークコールプログラム (Script_19_intervene_methods.sh) のピークコール結果の類似性と相違性を比較することができます (図6A-H)。

ピーク呼び出しステップでIgG制御オプションの有無にかかわらず呼び出されるマージされたCTCF、H3K27ac、およびRNAPII-S5Pピークの比較によると、MACS2とMACS3はIgG制御オプションでより多くのピークを呼び出しましたが(図6A)、SEACRは厳密なオプションと緩和されたオプションの両方でIgG制御オプションなしでより多くのピークを呼び出しました(図6B-D)).したがって、CUT&RUN解析パイプラインでは、(1)MACS2とMACS3にIgG制御オプションを適用すること、(2)実験的なCUT&RUNサンプルとIgG制御サンプルのピークを別々に呼び出し、後でSEACRピーク呼び出しに対してIgGピークをフィルタリングすることを提案しています。MACS2とMACS3の間では、MACS3はわずかに多くのピークをコールしました(図6A)。

さらに、MACS2とMACS3でIgG制御オプションを設定したピーク、およびIgG制御オプションを伴わないSEACRでコールしたピークを比較すると、ストロングオプションでコールされたSEACRピークは、緩和オプションでコールされたSEACRピークよりもMACS 2およびMACS3のピークと重なることが分かりました(図6E、F)。したがって、CUT&RUN解析パイプラインの出力は、strictlyオプションがMACSピークコールとのSEACRの一貫性を最大化することを示唆しています。最後に、SEACRによって呼び出されたピークのオーバーラップを、生のreadcounts CUT&RUN bedGraphファイルの正規化と正規化されたreadcounts CUT&RUN bedGraphファイルの正規化なしと比較したベン図では、strictオプションを使用したSEACRのSFRC法とSRPMC法の間に違いはないことがわかります。SFRC ピークは、緩和オプションを持つ SEACR の SRPMC ピーク(図 6G、H)よりも、正規化されたオプションのピーク(図 6 の「標準」)よりもはるかに高いピーク数とオーバーラップを示します。

反復とサンプル間の統計的比較
複数の反復にわたって正確な結論を導き出すには、反復の類似性を評価する必要があります。ここで使用したCUT&RUN解析パイプラインは、Deeptools215ベースの統計的相関係数計算、ヒートマップクラスタリング、主成分分析 (PCA) を採用しており、有効なダウンストリーム解析に適したサンプルと反復の同定を容易にします。Pearson 相関係数に基づくヒートマップクラスタリングでは、CTCF、H3K27Ac、および RNAPII-S5P の反復間で、それぞれのピーク領域で統計的に有意な相関が示されました(図 7A-C)。しかし、PCA では、CTCF の 1 つのサンプル(SRR8581590)と H3K27Ac(SRR8581608)が、ピーク領域と呼ばれるすべての CTCF、H3K27Ac、および RNAPII-S5P で他のレプリケート(図 7D)から比較的離れていることが示されました。

レプリケート間のピーク間を比較するためのベン図によると、CTCF(SRR8581590)ピークは 3 つのピークコーラー結果すべてで他のリピートとのオーバーラップが最も少なく(図 7E-G)、H3K27Ac(SRR8581608)ピークは SEACR ピークコーリング結果で他のリピートとのオーバーラップが最も少なかった(図 7F)。H3K27Ac(SRR8581608)ピークは、MACS2およびMACS3ピークコール結果(図7F)で他の反復と最小オーバーラップを示さなかったため(図7F)、PCAの反復間の距離が外れ値サンプルを定義するのに十分ではないことを示唆している可能性があります。そこで、CUT&RUN解析パイプラインでは、外れ値の反復を「ヒートマップクラスタリンググループでピアソン相関係数が低く、他の反復とのPCAプロットで距離が長く、反復間でのピークオーバーラップが最も低いサンプル」と定義することを提案しています。

ピークコールにより、CUT&RUNデータの視覚化と解釈が容易
本調査で詳述したCUT&RUN解析パイプラインでは、MACSファミリーとSEACRという2種類の一般に公開されているピークコーラーを採用しています。呼び出されたピークの可視化を最適化するために、このパイプラインは、ヒートマップおよびメタプロット解析のピーク中心として最も高いシグナルビンを選択します。MACS3 および SEACR ピークコーラーによって呼び出されたすべての CTCF、H3K27Ac、および RNAPII-S5P ピークは、ピーク領域全体の中心(図 8A-F、「全体」プロット)よりも、最も高い信号ビンの中心(図 8A-F、「フォーカス」プロット)でより鋭いピーク分布パターンを示しました。Easy Shells CUTnRUN解析パイプラインで処理されたSFRC正規化されたCUT&RUNサンプル (図8 A-F、'SFRC' プロット) は、SFRC正規化されたサンプルと同様の信号分布パターンを示しており、その生のマッピングリードペアはGEOで公開されています (図8A-F, 'public' plots)、解析パイプラインによって呼び出されたピークで。これにより、CUT&RUN解析パイプラインはパブリケーション結果を正常に再現することができます。

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図1:CUT&RUNの実験手順の概略図。CUT&RUNは、ゲノム全体のタンパク質-DNA相互作用を検出する酵素ベースのアプローチです。CUT&RUNの手続きは、磁気ビーズに結合したコンカナバリンAに細胞 (または単離された核) を結合させることから始まり、手続き全体を通じて低細胞数の単離と操作を可能にします。単離された細胞は、目的のタンパク質を標的とする抗体の導入を容易にするために、中性界面活性剤を使用して透過処理されます。次に、プロテインAまたはプロテインA/Gタグにつながれたミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を透過処理した細胞に導入します。pA-MNase(またはpAG-MNase)は、プロテインAまたはプロテインA/Gタグを使用して結合抗体にリクルートされます。MNaseが標的部位に局在すると、カルシウムの導入によりヌクレアーゼが短時間活性化され、標的タンパク質の周囲のDNAが消化されます。MNase消化は、モノヌクレオソームDNA-タンパク質複合体をもたらします。その後、カルシウムをキレート化して消化反応を終了させ、MNase消化から得られた短いDNA断片を37°Cでの短時間インキュベーションにより核から放出した後、DNA精製、ライブラリー調製、ハイスループットシーケンシング1を行います。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:Easy-Shell CUT&RUN解析パイプラインの概略図。 Easy-Shell CUT&RUN解析パイプラインは、(1)生のリードファイルの品質管理とマッピング(左、紫)、(2)マップされたリードとリードカウントとピークコールの正規化(中央、緑)、(3)マップされたリードとコールされたピークの検証(右、ピンク)の3つの主要なセクションで設計されています。各ステップには、対応するシェルスクリプト番号、簡単な説明、およびそのステップで使用されたプログラムツール(括弧内)が表示されます。プレーヌ矢印は、ステップ間の直接の流れを示します。このCUT&RUN解析パイプラインは、コントロールリードの有無にかかわらずユーザーのニーズを満たすことができる2つのリード正規化方法、ダウンストリーム解析のための適切な反復を特定するためのマルチレイヤー検証プロセス、および焦点を絞ったヒートマップとメタプロット出力を作成するためのフォーカスピークの同定を提供します。この解析パイプラインは、バイオインフォマティクスの初心者がスクリプト自体を読み編集することで、基本的なCUT&RUNデータ解析を学び、実践する機会を提供するために、使いやすいシェルスクリプトでステップバイステップで記述されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:品質トリミング前と品質トリミング後の品質チェック結果の比較。 FastQCからの品質チェックレポート出力を選択すると、SRR8581589(GSM3609748、CTCF)からの読み取りを使用して品質トリミングの効果が表示されます。示されている出力には、(A)ベース全体のプレトリミングの品質スコアが含まれます。(B)A)ポストトリミングと同じ読み出し。(C)すべてのシーケンスのプレトリミングにわたる品質スコアの分布。(D)C)ポストトリミングと同じ読み出し。(E)すべての配列のプレトリミングにわたるGC分布。(F)E)ポストトリミングと同じ読み出し。シーケンシングリード内の各位置での最小品質スコア (A、 B) と最小平均シーケンス品質 (C、 D) は、品質トリミング後に増加します。さらに、このステップでは、塩基ミスマッチ率が高いリードペアを削除することにより、リード(E、 F)の理論上のGCカウント分布と実際の塩基あたりのGCカウントの差を減らすことができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:インサートサイズ分布分析。 (A)CTCF、(B)H3K27Ac、および(C)serine 5 phosphorylated RNA polymerase II(RNAPII-S5P)の挿入サイズヒストグラム。ヒストグラムは、サンプル間の挿入サイズ分布の相対的な差を示します。ヒストグラムの破線は、挿入サイズが X 軸の値以上の読み取りの累積割合を表します。n:ろ過後のサンプルごとに一致してマッピングされた一意のリードの数。FR:フラグメント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5: CUT&RUNサンプルのランドスケープオーバービュー(A) histone genes cluster region, (A) histone genes cluster region に、SFRC (Scaled Fractional Count) で正規化された CUT&RUN マッピングリード、SFRC 正規化を施した Easy Shells CUTnRUN 解析パイプラインで処理された CUT&RUN サンプル (赤トラック)、および 'Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC; green tracks)) が、 (B-D)MACS2、MACS3、SEACRピークコーラーのすべてによってCTCF、H3K27Ac、およびRNAPII-S5Pピークが呼び出される他の3つの領域。黄色のボックスは、Easy Shells CUTnRUN解析パイプラインのろ過ステップでフィルタリングされたスパイク信号の位置を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:異なるピークコーラーとピークコーリングオプションによって呼び出されたピークを比較するためのベン図(A)ピークコーリング中にIgG入力オプションがある場合とない場合のMACS2とMACS3によって呼び出されるピークの比較。(B-D)SEACR が IgG インプットオプション、「ストリンジェント」および「リラックス」オプションを使用した場合、および未処理のリードペアファイルを使用した正規化オプションあり (B)、SFRC 正規化リードカウントファイル (C) または SRPMC 正規化リードカウントファイル (D) を使用したノーマライゼーションオプションなしのピークの比較。(E,F)MACS2、IgG入力オプション付きMACS3、ストリクトリー(E)または緩和(F)オプション付きSEACRによって呼び出されたピークの比較。(G,H)SEACRがIgGインプットオプションなしでコールしたピークと、ストリクトリー(G)またはリラックス(H)オプションを使用したピークの比較。w/ IgG:IgG入力オプションで呼び出されたピーク。w/o IgG:IgG入力オプションなしで呼び出されたピーク。norm: 正規化オプションで呼び出されたピーク。non:正規化オプションなしで呼び出されたピーク。SFRC: 'scaled fractional count (SFRC)" メソッドで正規化された readcounts ファイルによって呼び出されたピーク。SRPMC: 'Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC) method' によって正規化された readcounts ファイルによって呼び出されたピーク。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:Pearson相関、主成分分析、反復間の類似性を検証するためのベン図(A-C) Pearson相関係数値を使用したヒートマップクラスタリングは、MACS2(A)、MACS3(B)、およびSEACR(C)によって呼び出されるピークでの反復間の類似度を示します。).ピアソン相関係数は、-1 から 1 の間の値にあります。ピアソン相関係数の絶対値が大きいほど、2 つの変数間の相関が強いことを示し、正のピアソン相関係数値は、2 つの変数が同じ方向に移動する正の相関を示します。したがって、類似性が高いサンプルは、ヒートマップ クラスタリングでより近い血統を示し、ピアソン係数値が高いことを示します。(D)主成分分析(PCA)は、MACS2(左)、MACS3(中央)、SEACR(右)によって呼び出されるすべてのCTCF、H3K27Ac、およびRNAPII-S5Pピーク領域における反復とサンプル間の類似度を表示します。類似性が高いサンプルは、PCAプロットで互いに近接して配置されます。(E-G)ベン図分析により、MACS2 (E)、MACS3 (F)、SEACR (G) による各反復で検出されたピークを比較します。Easy-Shell CUT&RUN解析パイプラインは、3つの方法すべてを適用して、下流の分析のために呼び出されたピークをマージするのに適した類似性の高い反復を特定することを提案しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:ピークでのシグナル分布のヒートマップとメタプロットの視覚化。 ヒートマップとメタプロットは、異なるピークコーラーを使用して呼び出されたピーク中心周辺の濃縮の分布を表示します。(A,B)1回のリピート(SRR8581589)からMACS3(A)およびSEACR(B)によって呼び出されたCTCF CUT&RUNピーク。(C,D)H3K27Ac CUT&RUNピークは、MACS3(C)およびSEACR(D)を使用して1回のリピート(SRR8581607)からコールされます。(E,F)RNAPII CUT&RUN ピークは、MACS3 (E) および SEACR (F) によって 1 回のリピート (SRR8581589) から呼び出されます。一般に公開されているマッピングされた読み取りペア( 図8の「パブリック」)とEasy Shells CUTnRUN解析パイプライン( 図8の「SFRC」)によってマッピングされたフラグメントは、「スケーリングされた分数カウント(SFRC)」の正規化後に比較されます。ピークは、IgG 入力オプションを指定した MACS3 ( 図 8 の「MACS3 w/ IgG」)と、IgG 入力および正規化オプションなしの SEACR で、ストリストリントモード ( 図 8 の「SEACR w/o IgG non SFRC stringent」) で SFRC 正規化リードカウントファイルを使用して呼び出します。呼び出されたピークの座標ファイルの 2 つのバージョンが用意されています: 呼び出されたピークの開始から終了まで ( 図 8 の「全体」) と、呼び出されたピーク内で信号が最も多いビンの位置 (MACS3 のピークと呼ばれます。 図 8 の 'focused')。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1: GSE126612のCUT&RUNのfastqファイルの情報 GSE126612に含まれ、Easy Shells CUTnRUN解析パイプラインのサンプルデータセットとして選択されたすべての生の読み出しCUT&RUN高速qファイルは、テーブルとしてリストされます。「ファイル名」の欄には、CUT&RUNが読み込んだ生のファイル名が表示され、このファイルは「Script_02_download-fastq.sh」の実行後に「~/Desktop/GSE126612/fastq」に表示されます。'md5sum' は、サンプルデータセットの MD5 (Message-Digest Algorithm 5) を共有し、'Script_02_download-fastq.sh' を実行してデータセットをダウンロードした後、ファイルの整合性を確認するために使用できます。最後の列は、各サンプルごとのCUT&RUNの目標を示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クロマチン上のタンパク質占有率をマッピングする能力は、クロマチン生物学の分野で機構研究を行うための基本です。ラボがクロマチンのプロファイリングに新しいウェットラボ技術を採用するにつれて、ウェットラボ実験からのシーケンシングデータを分析する能力は、ウェットラボの科学者にとって共通のボトルネックになります。そこで、バイオインフォマティクスの初心者が解析のボトルネックを克服し、自身のCUT&RUNシーケンシングデータの解析と品質管理のチェックを開始できるようにするための、入門的なステップバイステップのプロトコルについて説明します。

このCUT&RUN解析プロトコルでは、真正なシグナルを確実に定量するためのいくつかのステップを応用しています。生のリードデータから低品質のリードとアダプター配列を削除することは、品質管理の最初のステップの 1 つであり、正確な解析結果を得るための最も重要なステップの 1 つです。したがって、この解析パイプラインには、Trim-galoreプログラム27を使用した、適用が容易な品質とアダプタトリミングのステップが含まれています。このプロセスの重要性により、この解析パイプラインには、トリミングプロセス(ステップ5.5)の前(ステップ4.3)と後(ステップ5.3)の結果の品質を比較するステップが含まれています。この解析パイプラインは、品質とアダプターのトリミングに加えて、GCコンテンツバイアスや偽陽性のスパイク/コールピークを引き起こす可能性のある非標準染色体リード、TAリピート領域、ブラックリスト領域も除去します。これらのろ過ステップは、バイオインフォマティクスの初心者がCUT&RUNデータ解析の重要な品質管理ステップを理解するための適切な入門パイプラインを提供します。

ろ過ステップの後、このCUT&RUN解析パイプラインには、「Scaled Fractional Readcount (SFRC)22」と「Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC)24,25」の2つの正規化オプションが提供され、ダウンストリームのピークコールと可視化のための入力ファイルが作成されます。CUT&RUNデータセットが、サンプル間のゲノムワイドなシグナルの違いを伴わずに局所的な違いのみを明らかにすると予想される場合、スケーリングされたフラクショナルリードカウント(カウントの割合と参照ノームのサイズの倍)がダウンストリーム解析に十分である可能性があります。ただし、CUT&RUNサンプル間でグローバルスケールのシグナルに違いが生じる可能性がある場合は、スパイクインとサンプル(実験的なCUT&RUNサンプルとネガティブコントロールサンプルの両方)間のリードの比率と、ネガティブコントロールリードの100万個あたりのリード数 (RPM) の正規化を考慮したSRPMC法を選択することで、ネガティブコントロールリードを異なるサンプル間で比較可能にすることができます。SRPMC は正規化されたネガティブコントロールリードに対して正規化されたリードを提供するため、このアプローチではネガティブコントロールシグナルが最小限に抑えられ、異なるバッチやグループで作成されたデータセット間の比較が可能になります。

CUT&RUNサンプルのピークコールにおける重要な要素は、IgGサンプルを含めることで、 in silico 分析中のCUT&RUNの偽陽性ピークを排除することです。具体的には、この解析パイプラインは、ピークと呼ばれるCUT&RUNの誤検出を破棄するために、さまざまなピークコーラーに対してピークコールアプローチを提供します。MACS2/3 ピークコーラーの場合、当社の分析パイプラインは、ピークコーリング中に入力サンプルとして IgG モックリードを適用します。SEACRの場合、この解析パイプラインでは、まず実験サンプルとネガティブコントロールサンプルのピークを別々に呼び出し、次に実験サンプルとネガティブコントロールサンプルの間で重なるピークを削除することを推奨しています。これは、実験サンプルのピーク呼び出し中にネガティブコントロールが提供された場合、SEACRはピークの大部分を「失う」可能性があるためです。キュレーションされたピークは、異なるピークコーラーと反復間で同等の類似性を示します(図 5)。全体として、低品質の非標準染色体、ブラックリスト領域、TAリピートリードの除去、アダプター配列のトリミング、スパイクインDNAの標準化、およびピークコールステップ中のネガティブコントロールの適切な処理により、ユーザーはダウンストリーム解析に適した適切なリードカウントファイルを手に入れることができます。高品質の正規化された読み取りファイルとキュレーションされたコールピークにより、ユーザーは反復間の類似性を比較し、非常にクリーンなバックグラウンドシグナルでヒートマップとメタプロットを作成して、効果的なピークコールを検証できます。

高品質なリードによるピークコールは、CUT&RUNデータから生物学的な解釈を引き出すための始まりです。このプロトコルでは、最も高いシグナルまたは統計的に有意なシグナルの位置をピークセンターとして指定することにより、ヒートマップとメタプロットで焦点を絞ったピークシグナルを取得する方法について説明します。一部のピーク コーリング アプローチでは、中心位置で最も高い信号または統計的に有意な信号が選択されません。したがって、各ピークの中心を最も高い信号または統計的に有意な信号の位置として再定義することは、プロットの中心に焦点の合った信号を持つ視覚的なデータ出力を作成するための重要なステップとして機能します。ピークと呼ばれる元のベッドファイルは、このプロトコルに記載されているステップの完了後、次のステップとしてピークアノテーションおよび機能的関連性分析を実行するために保持されます。

このCUT&RUN解析パイプラインには、必要なプログラムのインストール手順が含まれていますが、バイオインフォマティクスの初心者は解析ツールのインストールに困難を感じるかもしれません。そのため、関連する Github 問題ページが開設され、プログラムのインストールに関するより詳細なステップバイステップの説明を提供し、ユーザーが自分のシステムでプログラムをインストールする際のサポートへのコミュニケーションが容易になりました。CUT&RUN解析パイプラインの次のステップには、この記事で説明したプロトコル以外のステップとして、ピークアノテーション、異なるタイプのコールピーク間のオーバーラップの特定、コールピークの機能アノテーションなどがあります。このプロトコールに記載されている品質管理ステップとピークコールを完了し、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーはCUT&RUNデータから生物学的な意味を引き出すことができます。

このCUT&RUN解析パイプラインは、CUT&RUNの一括解析に関する一般的な入門的なステップバイステップのガイドラインを提供するために構築されています。このパイプラインにはいくつかの制限があります。まず、この解析パイプラインは、ブラックリスト領域(「高シグナルアーティファクト領域」や「アーティファクトリピート領域」、TAリピート領域など)のリードをフィルタリングすることで、GC内容の変動による影響を処理しようとしていますが、このアプローチは、ゲノム上に特徴的なGC含量を持つ可能性のある一部の生物には十分ではない可能性があります。したがって、ユーザーが GC コンテンツ主導のバイアスを懸念している場合は、マップされた読み取りを修正するための別のステップを追加することを検討してください。バイオインフォマティクスの初心者には、Deeptoolsの「computeGCBias」と「correctGCBias」がこの目的のオプションになる可能性があります。次に、この解析パイプラインは、通常の挿入サイズ(100 bp-1 kb)と小さな挿入サイズの読み取り(< 100 bp)の両方を処理しており、これは一部のクロマチン関連タンパク質の実際の読み取りである可能性があります。この解析パイプラインはシェルスクリプトで記述されているため、ユーザーは「Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh」を変更して、マッピングされた読み取りベッドファイル生成ステップ中に、通常のフラグメントサイズの読み取りとは別に短い挿入サイズの読み取りを取得できます。その後、短い挿入サイズの読み取りベッド ファイルは、通常の挿入サイズ マップされた読み取りとは独立して正規化でき、ダウンサイジング効果を最小限に抑えることができます。第3に、解析パイプラインの複雑さを軽減するため、Easy Shells CUTnRUNには、CUT&RUNサンプルのシーケンシング深度に合わせたダウンサンプリングステップが含まれていません。ただし、ユーザーは、samtools ビュー28 または PositionBasedDownsampleSam (Picard)29 を使用して bam ファイルをフィルタリングした後、ダウンサンプル ステップを適用できます。

このプロトコルのすべての解析ステップはシェルスクリプトで記述されており、バイオインフォマティクスの初心者でもスクリプトを復習することでCUT&RUN解析の基本を学ぶことができます。ユーザーは、各シェルスクリプトをターミナル内で順次実行することで、ステップバイステップでバイオインフォマティクス解析を実践できると期待しています。さらに、このCUT&RUN解析パイプラインにはシェルスクリプトがシンプルに用意されているため、ユーザーはこれらのスクリプトを修正およびカスタマイズして、この解析パイプラインを自分のCUT&RUNデータに適用することができます。最終的には、このCUT&RUN解析パイプラインにより、CUT&RUNデータ解析プロセスにおける一般的なボトルネックが解消され、ウェットラボの研究者やバイオインフォマティクスの初心者が、自身のCUT&RUNシーケンシングデータから生物学的な結論を導き出すことができるようになると期待しています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示しないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

イラスト入りのフィギュアはすべて BioRender.com で作成しました。CAIは、Ovarian Cancer Research Alliance Early Career Investigator Award、Forbeck Foundation Accelerator Grant、Minnestoa Ovarian Cancer Alliance National Early Detection Research Awardを通じて提供された支援を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
bedGraphToBigWigENCODEhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/ソフト 圧縮して readcounts bedGraph を bigWig
bedtools-2.31.1クインラン研究所 @ ユタ大学https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.htmlbam/bed/bedGraph ファイルを処理するソフト
bowtie2 2.5.4ジョンズ・ホプキンス大学蝶ネクタイインデックスを作成し、アライメントを行う https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml ソフトウェア
CollectInsertSizeMetrics (Picard)ブロード研究所https://github.com/broadinstitute/picardインサートサイズ分布分析を行うソフトウェア
CutadaptNBIShttps://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.htmlアダプタートリミング
を行うソフトウェアDeeptoolsv3.5.1マックスプランク研究所https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.htmlピアソン係数相関分析、主成分分析、ヒートマップ/平均プロット分析を実行するソフトウェア
FastQC バージョン 0.12.0Babraham Bioinformaticshttps://github.com/s-andrews/FastQCfastqファイルの品質を確認するソフトウェア
Intervenev0.6.1計算生物学 &遺伝子制御 - マテリアグループhttps://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.htmlピークファイルを使用してベン図解析を行うソフトウェア
MACSv2.2.9.1Chan Zuckerberg initiativehttps://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2ピークを呼び出すソフトウェア
MACSv3.0.2Chan Zuckerberg initiativehttps://github.com/macs3-project/MACS/tree/masterピークを呼び出すソフトウェア
Samtools-1.21Wellcome Sanger Institutehttps://github.com/samtools/samtoolssam/bam ファイルを処理するソフトウェア
SEACRv1.3Howard Hughes Medial Institutehttps://github.com/FredHutch/SEACRピークを呼び出すソフトウェア
SRA ツールキット リリース 3.1.1NCBIhttps://github.com/ncbi/sra-toolsから SRR をダウンロードするソフトウェア
Babraham Bioinformaticshttps://github.com/FelixKrueger/TrimGalore高品質でアタプタートリミングを行うソフトウェア
GEO Trim_Galore v0.6.10

参考文献

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