フローサイトメトリーによるピューロマイシンの取り込みを測定するための化学を用いたリンパ球の代謝を研究する方法

サマリー

このプロトコルは、細胞内のエネルギー代謝を研究するために化学を使用するフローサイトメトリーベースの方法を示しています。

要約

抗原刺激を受けると、ナイーブT細胞は急速な増殖とエフェクターT細胞への増殖を遂げます。代謝は、これらの急速に増殖する細胞に必要なバイオマスの生成と、感染症や癌における適応免疫応答の結果に影響を与えるエフェクターT細胞の分化と機能に必要な分子の生成に重要な役割を果たします。ナイーブT細胞は、抗原刺激によって代謝を再プログラムし、成長、生合成、エフェクター機能をサポートするために必要なATPの生成を増加させます。ATPは、ミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)経路または解糖経路のいずれかによって細胞内で生成できます。分裂して成長する細胞で生成されたATPのほとんどはタンパク質の合成に使い果たされるため、タンパク質合成はATPレベルの代用として使用されてきました。タンパク質合成は、修飾チロシンを帯電したtRNAの3'アデノシンを模倣し、タンパク質翻訳の自発的終了につながるピューロマイシンの取り込みによって測定できます。解糖経路を遮断する2-デオキシグルコース(2DG)や、電子伝達系(ETC)の複合体5を遮断するオリゴマイシン(O)などの代謝阻害剤は、SCENITHと呼ばれる方法でのタンパク質合成の評価と併せて、これら2つの経路に対する細胞ATP生成の依存性を研究するために使用できます。ここでは、化学を用いたフローサイトメトリーによるピューロマイシンの取り込みを検出するこの方法のバリエーションについて説明します。代謝を研究するこの方法は比較的簡単で、フローサイトメトリーによる希少細胞集団や患者サンプルの評価に使用できます。

概要

近年、T細胞の調節における代謝の重要な役割に対する認識が高まっています。細胞代謝は、病原体特異的T細胞のクローン増殖や、病原体を殺すために必要な炎症性サイトカインや細胞溶解性グランザイムを含むさまざまなエフェクター分子を合成するエフェクター細胞サブセットへの分化など、リンパ球の多くの重要な機能を調節^{します1。}したがって、T細胞代謝の研究は、正常なT細胞機能の評価と潜在的な治療法の開発の両方にとって重要です。

ナイーブT細胞は代謝的に静止しており、エネルギー需要を異化代謝と酸化的リン酸化(OXPHOS)に依存しています^1,2。T細胞受容体(TCR)が活性化されると、T細胞は細胞表面の栄養トランスポーターのアップレギュレーションによって部分的に駆動される急速な代謝再プログラミングを受け、グルコースとグルタミンを含む複数のアミノ酸の環境からの取り込みを増加させます。これらの栄養素構成要素は、同化経路で使用され、細胞の成長に寄与し、細胞の成長と分裂の増加に関連するエネルギー需要の増加をサポートする高分子を作ります^1,2,3

プロトコル

畜産と実験は、国立ヒトゲノム研究所の動物使用および管理委員会(NIH)によって承認されたプロトコルG98-3、および国立アレルギーおよび感染症研究所の動物管理および使用委員会(NIH)によって承認されたプロトコルLISB 22Eに従って実施されました。本研究には、特定の病原体のない(SPF)条件で飼育および飼育された、生後6〜12週齢の雄C57Bl / 6Jマウスを使用しました。雌マウスでも同様の結果が得られました。ヒト全血は、NIH 臨床センター IRB 承認プロトコル 99-CC-0168 体外研究用の健康なドナーからの血液成分の収集と配布に基づいて、NIH 血液銀行から採取されました。ヘルシンキ宣言に従って、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。

1. マウスナイーブCD4⁺ T細胞の単離と培養

1. メーカーのプロトコルに従って、磁気細胞分離システムを使用して、6〜12週齢の雄マウスのマウス脾臓またはリンパ節のプールされた単一細胞懸濁液からネガティブセレクションにより、ナイーブCD4⁺ T細胞を精製します。
2. L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを含むIMDM培地で細胞を培養し、10%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100....

結果

ナイーブCD4⁺ T細胞をマウスの脾臓およびリンパ節から単離し、Th0または非分極(NP)系統に72時間分化させた。培養0時間、48時間、72時間後に細胞を回収し、OPPのMFIを調べてOPPの取り込みを測定しました。ナイーブCD4⁺ T細胞は、OPPのMFIに見られるように、活性化T細胞よりも合成が低かった(図3)。ナイーブ細胞は解糖系に部分的に依存していましたが、MFIとOPP取り込みの倍数変化によって評価されるOXPHOS経路にもっと依存していました。コントロール(Co)を100%に設定すると、解糖系をブロックすると、タンパク質合成がコントロールの60%に低下します。OXPHOS 経路を遮断すると、さらに 45% まで低下します。

活性化すると、CD4⁺ T細胞は、MFIの増加によって証明されるようにタンパク質合成を増加させ(図3)、解糖経路への依存度を高めます。解糖をブロックすると、これらの.......

ディスカッション

この論文は、SCENITH技術に基づいて、組み込まれたピューロマイシンの化学標識を使用して、フローサイトメトリーによってリンパ細胞の代謝を研究する方法を提供します。リンパ球に焦点を当ててきましたが、このプロトコルは、あらゆる細胞型の代謝を研究するように調整できます。この方法は、タツノオトシゴなどの他の技術ではより多くの細胞を必要とするまれな細胞集団や患者サンプルの代謝を研究するのにも有利です。

プロトコルの重要なステップは、特に指定がない限り、細胞、阻害剤、および使用されるすべての試薬が室温にあることを確認することです。冷蔵庫に長時間放置された細胞は、細胞が生理学的温度に達するまで37°Cでインキュベートする必要があります。理想的には、実際の実験を開始する前に、細胞、阻害剤、その他の試薬をインキュベーターにしばらく放置する必要があります。

この方法は、OPP染色と併せて細胞内タンパク質を染色するように変更することもできます。提示された例では、CD4 ^.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 抗ピューロマイシン抗体	Biolegend	381506	使用希釈: 1/100
Alexa Fluor 647 抗ヒト CD4 抗体	Biolegend	357422	使用希釈: 1/50
BD Horizon BUV737 ラット抗マウス CD4	BD Biosciences	612761	使用希釈: 1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 タンパク質合成アッセイキット	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
ヒト血清	ミリポア シグマ	H4522
IMDM、GlutaMAX サプリメント、500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb 抗マウス CD28、クローン: 37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb 抗マウス CD3&イプシロン;、クローン: 145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb 抗マウス IFN&γ;、クローン: XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb 抗マウス IL-12 p40、クローン: C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb 抗マウス IL-4、クローン: 11B11	BioXcell	BE0045
L-グルタミン (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
LIVE/DEAD 固定可能なアクア死細胞染色キット、405 nm 励起用	Thermo Fisher	L34966	使用希釈: 1/600
LSM リンパ球分離培地	MP Biomedicals	50494X
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)	Thermo Fisher	11140050
Streptomyces caespitosus	Sigma	M0503-10X2MG
ナイーブ CD4 分離キット、マウス	Miltenyi Biotec	130-104-453
パラホルムアルデヒド 16% 水溶液EM グレード	電子顕微鏡 Sciences	15710
PBS (1X)、pH 7.4、500 mL	Quality Biologicals	114-058-101
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)。100mL	サーモフィッシャー	15140122
フィトヘマグルチニン-L (PHA-L)	ミリポアシグマ	11249738001
プレミアムグレードウシ胎児血清 (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 ミディアム、グルタミンなし	サーモフィッシャー	21870076
サポニン	モフィッシャー	A18820.22
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)	サーモフィッシャー	11360070

サー