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方法論記事

フローサイトメトリーによるピューロマイシンの取り込みを測定するための化学を用いたリンパ球の代謝を研究する方法

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DOI:

10.3791/67377

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2025年8月15日

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1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、細胞内のエネルギー代謝を研究するために化学を使用するフローサイトメトリーベースの方法を示しています。

要約

抗原刺激を受けると、ナイーブT細胞は急速な増殖とエフェクターT細胞への増殖を遂げます。代謝は、これらの急速に増殖する細胞に必要なバイオマスの生成と、感染症や癌における適応免疫応答の結果に影響を与えるエフェクターT細胞の分化と機能に必要な分子の生成に重要な役割を果たします。ナイーブT細胞は、抗原刺激によって代謝を再プログラムし、成長、生合成、エフェクター機能をサポートするために必要なATPの生成を増加させます。ATPは、ミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)経路または解糖経路のいずれかによって細胞内で生成できます。分裂して成長する細胞で生成されたATPのほとんどはタンパク質の合成に使い果たされるため、タンパク質合成はATPレベルの代用として使用されてきました。タンパク質合成は、修飾チロシンを帯電したtRNAの3'アデノシンを模倣し、タンパク質翻訳の自発的終了につながるピューロマイシンの取り込みによって測定できます。解糖経路を遮断する2-デオキシグルコース(2DG)や、電子伝達系(ETC)の複合体5を遮断するオリゴマイシン(O)などの代謝阻害剤は、SCENITHと呼ばれる方法でのタンパク質合成の評価と併せて、これら2つの経路に対する細胞ATP生成の依存性を研究するために使用できます。ここでは、化学を用いたフローサイトメトリーによるピューロマイシンの取り込みを検出するこの方法のバリエーションについて説明します。代謝を研究するこの方法は比較的簡単で、フローサイトメトリーによる希少細胞集団や患者サンプルの評価に使用できます。

概要

近年、T細胞の調節における代謝の重要な役割に対する認識が高まっています。細胞代謝は、病原体特異的T細胞のクローン増殖や、病原体を殺すために必要な炎症性サイトカインや細胞溶解性グランザイムを含むさまざまなエフェクター分子を合成するエフェクター細胞サブセットへの分化など、リンパ球の多くの重要な機能を調節します1。したがって、T細胞代謝の研究は、正常なT細胞機能の評価と潜在的な治療法の開発の両方にとって重要です。

ナイーブT細胞は代謝的に静止しており、エネルギー需要を異化代謝と酸化的リン酸化(OXPHOS)に依存しています1,2。T細胞受容体(TCR)が活性化されると、T細胞は細胞表面の栄養トランスポーターのアップレギュレーションによって部分的に駆動される急速な代謝再プログラミングを受け、グルコースとグルタミンを含む複数のアミノ酸の環境からの取り込みを増加させます。これらの栄養素構成要素は、同化経路で使用され、細胞の成長に寄与し、細胞の成長と分裂の増加に関連するエネルギー需要の増加をサポートする高分子を作ります1,2,3。活性化T細胞における代謝再プログラミングにより、細胞はエネルギー需要を好気性解糖とグルタミノ分解により依存するようになります1,2,3。TCR刺激では、栄養素の取り込みも下流の分子経路の活性化に重要な役割を果たします3。たとえば、アミノ酸の取り込みと局所アミノ酸濃度の増加は、mTORC1シグナル伝達を活性化します4。逆に、細胞内アミノ酸の利用可能性を低下させると、mTORC1シグナル伝達経路2,3,5,6,7が減少します。したがって、代謝と細胞機能はエフェクターT細胞内で密接に結びついています。

急速に分裂するT細胞に必要なバイオマスの大幅な増加には、タンパク質合成/翻訳のアップレギュレーションが必要です8。タンパク質合成は、リボソームの翻訳から伸長するポリペプチド鎖を組み込んだり、マーキングしたり、放出したりすることによって翻訳をブロックするチロシル-tRNA模倣体であるピューロマイシン9の取り込みを研究することにより、細胞内で定量化できます9。タンパク質の翻訳は、エネルギー依存性の高いプロセスです。実際、分裂し、成長する細胞で生成されたATPのほとんどは、タンパク質の合成に使用されます。したがって、タンパク質合成は、細胞ATP10の代用測定として使用されてきました。ATPを生成するために、細胞は通常、解糖および/またはミトコンドリアのOXPHOS経路に依存しています11。解糖は、グルコース分子ごとに2つのATP分子を生成します。OXPHOS 経路はグルコースあたり36 個の ATP を生成しますが 12,13 ですが、解糖系はより速く ATP を生成することができます14。したがって、がん細胞と同様に急速に分裂する活性化T細胞は、ATP生成の解糖経路に大きく依存します。

各代謝経路に対する細胞の依存性は、特定の阻害剤を使用することによって研究できます。グルコース類似体である解糖経路阻害剤 2-デオキシグルコース (2-DG) は、解糖酵素ヘキソキナーゼ15 の競合阻害剤として作用します。2-DGは、ヘキソキナーゼによって2DG-リン酸(2DG-P)にリン酸化されます。2DG-Pは、通常グルコース-6-リン酸(G-6-P)をフルクトース-6-リン酸に変換するホスホヘキソースイソメラーゼによってさらに代謝することはできません16。したがって、2DG-Pは細胞内に閉じ込められて蓄積し、解糖の阻害と細胞ATPの枯渇を引き起こし、それによってタンパク質合成をブロックします17。同様に、ミトコンドリアOXPHOS経路に対する細胞の依存性は、電子伝達系(ETC)18のATPシンターゼのプロトンチャネルに結合し、ミトコンドリアATP合成を遮断するオリゴマイシンを使用して研究できます(図1)。タンパク質合成の評価と組み合わせてこれらの阻害剤を使用すると、細胞の代謝状態の全体像を提供でき、フローサイトメトリー10を使用してピューロマイシンの取り込みを評価するSCENITHとして知られる強力な単一細胞法で使用されています。ただし、SCENITH 試薬の入手可能性は制限される場合があります。解糖系とOXPHOSを評価するために一般的に使用される他の技術には、より大きな細胞数を必要とするタツノオトシゴの細胞外フラックス分析があり、実験的には実現できない可能性があります。この記事では、市販のClick-it化学試薬を使用してピューロマイシンの取り込みを評価するための代替方法について説明します。この方法が簡単なため、希少細胞集団や患者サンプルを含むリンパ球の代謝状態を迅速に評価できます。

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プロトコル

畜産と実験は、国立ヒトゲノム研究所の動物使用および管理委員会(NIH)によって承認されたプロトコルG98-3、および国立アレルギーおよび感染症研究所の動物管理および使用委員会(NIH)によって承認されたプロトコルLISB 22Eに従って実施されました。本研究には、特定の病原体のない(SPF)条件で飼育および飼育された、生後6〜12週齢の雄C57Bl / 6Jマウスを使用しました。雌マウスでも同様の結果が得られました。ヒト全血は、NIH 臨床センター IRB 承認プロトコル 99-CC-0168 体外研究用の健康なドナーからの血液成分の収集と配布に基づいて、NIH 血液銀行から採取されました。ヘルシンキ宣言に従って、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。

1. マウスナイーブCD4+ T細胞の単離と培養

  1. メーカーのプロトコルに従って、磁気細胞分離システムを使用して、6〜12週齢の雄マウスのマウス脾臓またはリンパ節のプールされた単一細胞懸濁液からネガティブセレクションにより、ナイーブCD4+ T細胞を精製します。
  2. L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを含むIMDM培地で細胞を培養し、10%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン、および0.05 mM 2-β-メルカプトエタノールを添加します。
  3. マイトマイシン-C処理したT-枯渇脾細胞(後述)を48ウェルプレートでAPCとして1:8の比率で共培養する(抗CD3 1 μg/mL[クローン2C11]および抗CD28 37.51]3μg/mL)、Th0条件(抗CD3 1 μg/mL、抗CD28 3 μg/mL、抗IFNg各10 μg/mL [クローンXMG1.2]、 抗IL-12[クローンC17.8]および抗IL-4[クローン11B11])を37°Cで72時間投与します。 48ウェルプレートのウェルあたり1 x 106 APCおよび0.13 x 106ナイーブCD4 T細胞を使用して培養をセットアップします( 材料表
  4. マイトマイシン-C処理したT枯渇脾細胞をAPCとして生成する:簡単に言えば、マウス脾臓の単一細胞懸濁液をFITC結合CD4およびCD8抗体で染色します。続いて、細胞を抗FITCマイクロビーズで磁気的に標識します( 材料表を参照)。次に、メーカーのプロトコルに従って磁気細胞分離システムを使用して、T細胞からAPCを負に選択します。次に、APCを50 μg/mLのマイトマイシンCで37°Cのインキュベーターで40分間処理し、続いて1x PBSで3回洗浄します。

2. ヒトPBMCの単離と培養

  1. リンパ球分離培地を使用して、製造元のプロトコルに従って全血からPBMCを単離します( 材料表を参照)。
  2. 2 mM L-グルタミン、0.01 M HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸、100 U/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、0.05 mM 2-β-メルカプトエタノール、および5%ヒト血清を添加したRPMI培地でPBMCを培養します。
  3. U底96ウェルプレートのウェルあたり1 x 106 PBMCを5 μg/mLのフィトヘマグルチニン-L(PHA-L)で37°Cで18〜24時間培養します。

3. 代謝アッセイ

注:すべての細胞、阻害剤[オリゴマイシン(O)、2-デオキシグルコース(2-DG)、DMSO(Co)]、およびO-プロパルギル-ピューロマイシン(OPP)試薬をできるだけ37°Cに近づけることが重要です。細胞、阻害剤、OPP試薬をU底の96プレートに分注し、プレートを可能な限り37°Cのインキュベーターに放置します。阻害剤2-DGとOを分注して、複数回の凍結融解を避けるために、より少ない容量にします。

  1. 2-DGの2M(20x)原液とOの40μM(40x)原液を作ります。OPPの場合、1 μLのOPPを49 μLの培地で希釈して、濃度が400 μMになるようにします-これは20倍のストック溶液になります。
  2. 実験を開始する前に、OPPタンパク質合成キットの他のすべてのコンポーネント( 材料表を参照)が室温(RT)にあることを確認してください。
  3. 成分Cボトルのアリコートを脱イオン水で1:10に希釈して、1x OPP反応バッファーを調製します。使用後、残りの1x溶液を2〜8°Cで保存します。
  4. 100 μLの完全IMDM(マウスCD4T細胞用)または完全RPMI(ヒトPBMCの場合)または任意の完全培地に、各条件(Co / DG / O / DGO)の丸底96ウェルプレートのウェルあたり0.1-2 x 106 細胞を播種します。プレートをできるだけインキュベーターに保管してください。
  5. ストック溶液(20x DG、Co 5 μL)、(40x O 2.5 μL)から1x阻害剤を加え、37°C、5%CO2で15分間インキュベートします。細胞上の最終濃度は100 mM DGおよび1 μM Oです。阻害剤をピペットで慎重に細胞と混合します。簡単にするために、96ウェルプレートで阻害剤を分注し、阻害剤に細胞を加え、数回上下にピペッティングしてよく混合します。
  6. DGOサンプルに、1xのDG(5 μL)を加え、ピペットで注意深く混合し、37°C、5%CO2で10分間インキュベートします。次に、1x O(2.5 μL)を加え、ピペットを数回入れ、37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。
  7. 阻害剤を洗い流さずに、20x(400μM)ストック溶液から5μLのOPPを各サンプルに加え、細胞内の濃度が20μMになるようにし、ピペットを上下に複数回、37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。簡単にするために、OPPを96ウェルプレートに分注し、阻害剤を含む細胞をOPP試薬に加え、よく混合します。
    注:代謝活性の低い細胞および ex vivoで直接単離された細胞については、OPP添加後のインキュベーション時間を長くします。OPPとのインキュベーション時間は、細胞タイプごとに標準化する必要があります。
  8. OPPとのインキュベーション後、100〜150 μLの氷冷FACSバッファー(1x PBS中の2%FBSおよび1 mM EDTA)を加えます。750 x g で 4°C で 2 分間遠心分離します。 上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。
  9. 適切な表面マーカー、抗マウスCD4抗体(1/200希釈で使用)または抗ヒトCD4抗体(1/50希釈で使用)、Live/Dead試薬(1/600希釈で使用)、Fcブロック(1/200希釈で使用)の存在下で細胞を染色します。暗所で4°Cで25〜30分間インキュベートします。
  10. プレートを150〜200 μLのFACSバッファーで洗浄し、750 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 プレートを軽くフリックして上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。この段階で、細胞は表面に染色されます。
  11. 細胞をPBS中の1%PFAに再懸濁し、よく混合し、4°Cで10〜15分間インキュベートします。 光から保護します。
  12. FACSバッファーで洗浄し、750 x g で4°Cで2分間遠心分離し、洗浄を繰り返します。
  13. 細胞ペレットを200 μLの冷たい1xサポニン透過処理バッファー(0.1%(wt/vol)サポニン+ 1x PBS中の3%FBS)に再懸濁します。RTでインキュベートし、光から5〜15分間保護します。このとき、細胞は固定され、透過処理されます。
  14. 10x 溶液を脱イオン水で 1:10 に希釈して、1x OPP 反応緩衝添加剤 (成分 E) を調製します。この溶液を新鮮に準備し、その日に使用してください。
  15. 表1に従ってOPP反応カクテルを調製します。準備後15分以内に反応カクテルを使用してください。
  16. ステップ3.13のサンプルを750 x g で2分間遠心分離します。上清を捨てます。200 μLの1xサポニン透過処理バッファーで細胞を2回洗浄します。上清を回転させて捨てます。
  17. 50〜100 μLのOPP反応カクテル(ステップ3.12で調製)を各ウェルに加え、よく混合します。光から保護して、RTで30分間インキュベートします。次に、プレートを750 x g または4°Cで2分間回転させます。 上清を捨てます。
  18. ペレットを200 μLの1xサポニン透過処理バッファーに再懸濁し、サンプルを750 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 上清を捨てます。
  19. ウェルあたり50 μLの反応リンスバッファー(成分F)に再懸濁し、750 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 染色した細胞を200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
  20. 同日にフローサイトメトリー( 補足図1を参照)でサンプルを分析するか、細胞を4°Cの暗所に保管し、翌日分析します。

4. 代謝アッセイの分析

  1. 以下の条件下でタンパク質合成の代用としてピューロマイシン(OPP)の取り込みを測定します:1)対照条件(Co);2)解糖経路が2-DGによって遮断されている細胞。3) ミトコンドリア OXPHOS 経路が O によってブロックされている細胞。4)解糖経路とミトコンドリア経路の両方が阻害剤(DGO)によってブロックされている細胞で、OPPの平均蛍光強度(MFI)を評価することにより(図2)。
  2. 各条件におけるOPPのMFIを調べることにより、特定の経路に対する細胞の依存性を分析します。タンパク質合成の尺度としてMFIを直接評価します。グルコース依存性、解糖能、脂肪酸酸化(FAO)およびアミノ酸酸化(AAO)能、およびミトコンドリア依存性を10に従って計算します。

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結果

ナイーブCD4+ T細胞をマウスの脾臓およびリンパ節から単離し、Th0または非分極(NP)系統に72時間分化させた。培養0時間、48時間、72時間後に細胞を回収し、OPPのMFIを調べてOPPの取り込みを測定しました。ナイーブCD4+ T細胞は、OPPのMFIに見られるように、活性化T細胞よりも合成が低かった(図3)。ナイーブ細胞は解糖系に部分的に依存していましたが、MFIとOPP取り込みの倍数変化によって評価されるOXPHOS経路にもっと依存していました。コントロール(Co)を100%に設定すると、解糖系をブロックすると、タンパク質合成がコントロールの60%に低下します。OXPHOS 経路を遮断すると、さらに 45% まで低下します。

活性化すると、CD4+ T細胞は、MFIの増加によって証明されるようにタンパク質合成を増加させ(図3)、解糖経路への依存度を高めます。解糖をブロックすると、これらの...

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ディスカッション

この論文は、SCENITH技術に基づいて、組み込まれたピューロマイシンの化学標識を使用して、フローサイトメトリーによってリンパ細胞の代謝を研究する方法を提供します。リンパ球に焦点を当ててきましたが、このプロトコルは、あらゆる細胞型の代謝を研究するように調整できます。この方法は、タツノオトシゴなどの他の技術ではより多くの細胞を必要とするまれな細胞集団や患者サンプルの代謝を研究するのにも有利です。

プロトコルの重要なステップは、特に指定がない限り、細胞、阻害剤、および使用されるすべての試薬が室温にあることを確認することです。冷蔵庫に長時間放置された細胞は、細胞が生理学的温度に達するまで37°Cでインキュベートする必要があります。理想的には、実際の実験を開始する前に、細胞、阻害剤、その他の試薬をインキュベーターにしばらく放置する必要があります。

この方法は、OPP染色と併せて細胞内タンパク質を染色するように変更することもできます。提示された例では、CD4 ...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

PBMC サンプルと貴重な実験提案を提供してくださった Qin Xu 博士と Avik Dutta 博士に感謝します。この研究は、NIH の NIAID の学内研究部門によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノールThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 抗ピューロマイシン抗体Biolegend381506使用希釈: 1/100
Alexa Fluor 647 抗ヒト CD4 抗体Biolegend357422使用希釈: 1/50
BD Horizon BUV737 ラット抗マウス CD4BD Biosciences612761使用希釈: 1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 タンパク質合成アッセイキットThermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
ヒト血清ミリポア シグマH4522
IMDM、GlutaMAX サプリメント、500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb 抗マウス CD28、クローン: 37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb 抗マウス CD3&イプシロン;、クローン: 145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb 抗マウス IFN&γ;、クローン: XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb 抗マウス IL-12 p40、クローン: C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb 抗マウス IL-4、クローン: 11B11BioXcellBE0045
L-グルタミン (200 mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD 固定可能なアクア死細胞染色キット、405 nm 励起用Thermo FisherL34966使用希釈: 1/600
LSM リンパ球分離培地MP Biomedicals50494X
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)Thermo Fisher11140050
Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
ナイーブ CD4 分離キット、マウスMiltenyi Biotec130-104-453
パラホルムアルデヒド 16% 水溶液EM グレード電子顕微鏡 Sciences15710
PBS (1X)、pH 7.4、500 mLQuality Biologicals114-058-101
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)。100mLサーモフィッシャー15140122
フィトヘマグルチニン-L (PHA-L)ミリポアシグマ11249738001
プレミアムグレードウシ胎児血清 (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 ミディアム、グルタミンなしサーモフィッシャー21870076
サポニンモフィッシャーA18820.22
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)サーモフィッシャー11360070
サー

参考文献

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