Method Article

Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

DOI:

10.3791/67378

⸱

November 1st, 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ウイルス-プラスモデスマタ相互作用またはプラスモデマーム輸送中にプラスモデスマタを標的とするタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のための最適なプラスモデスママーカーの選択を説明しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmataは、隣接する植物細胞の細胞質をつなぎ、栄養素、高分子、侵入ウイルスの細胞間輸送を可能にする膜状のナノポアです。Plasmodesmataは、細胞間コミュニケーションの調節において基本的な役割を果たし、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用に貢献します。植物やウイルスのタンパク質の体質形成部局在を発見することは、タンパク質に関する有用な機能情報を提供する可能性があり、植物とウイルスの相互作用のメカニズムを理解するために重要です。これらの研究を容易にするために、ウイルス-プラスモデスマタの相互作用またはプラスモデスマの輸送を研究するための最適なプラスモードマーカーを選択するために、さまざまなプラスモードターゲティングタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のプロトコルについて説明します。具体的には、これらの事象の解析は、 カブ静脈透明化ウイルス (TVCV)、 シロイヌナズナPlasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5)、およびPlasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)の細胞間移動タンパク質(MP)を用いて示されています。タンパク質の体質形成局在データは、サンプリングされた組織のアニリンブルー染色を使用して、体質形成体の全体的な可視化と並行して分析されます。これらのアプローチは、プランタ内の任意の細胞タンパク質または病原体タンパク質の体質形成局在を分析するために容易に適応できます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata(PD)は、細胞間コミュニケーションの制御を通じて、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用を制御する上で基本的な役割を果たします1,2。PDは、細胞質分裂中に最初に形成され、2つの娘細胞の間の新しい細胞に数百のPDが挿入され、細胞間コミュニケーションのためのチャネルが供給されます3,4。PDは膜に富む構造であり、原形質膜3,4によって裏打ちされた細孔の中央部分に小胞体(ER)由来の膜であるtrans-PDデスモチューブルが含まれています。比較プロテオミクスアプローチにより、β-1,3-グルカナーゼ(BG)、カロース合成酵素(CALS)、原形質形成タンパク質(PDLP)、カロース結合タンパク質(PDCB)、複数のC2ドメイン膜貫通領域タンパク質(MCTP)3、ロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ(RLK)5など、多数のPD機能タンパク質が同定されました。最近、Kirkらはplasmodesmata in silico proteome 1(PIP1)と呼ばれるツールを開発し、22の植物種6における新しいPDタンパク質を予測することを可能にしました。PDは、植物の発生中およびさまざまな応力に対する応答中に、透過性と構造が異なります。PDを取り巻く頸部領域でのカロース(β-1,3-グルカン)の沈着と加水分解は、PD調節の広く知られているメカニズムの1つです7。

真菌、細菌、ウイルスを含む多くの病原性微生物は、感染中にPDの拡張または構造を操作することができる2,8,9。イネいもち病の原因物質であるMagnaporthe oryzaeは、細胞内侵襲菌糸を配備してPD8を介して細胞から細胞へと移動します。細菌性病原体Pseudomonas syringae pv.トマトは、PDLP7との相互作用と不安定化を通じて宿主植物内での細胞間移動と拡散のためにエフェクタータンパク質HopO1-1を必要とし、シロイヌナズナ9の隣接細胞の分子フラックスを増加させます。しかし、植物ウイルスは、細胞間伝播中のPDの調節においてより汎用性が高く、ウイルス移動タンパク質(MP)は細胞間移動を促進します2。PDは、植物の発育と成長を調節する重要な機能、および植物病原性微生物との相互作用により、近年ますます注目を集めています。シロイヌナズナには、PDLP(1-8)とPDCB(1-5)の2つの主要なタイプのPD機能タンパク質があり、PDLP5 1,10,11、PDLP112、PDLP6 13、PDLP714、PDCB115など、多くのPD機能性タンパク質がカロース沈着の制御を通じてPD透過性を操作する役割を果たしていることがわかった。しかし、一部のPDLPは機能的な冗長性を有することがわかった、例えば、pdlp1およびpdlp1,2のノックアウト変異体は分子輸送に影響を及ぼさなかったが、pdlp1,3およびpdlp2,3のダブルノックアウト変異体は杉形質透過性の増加を示した16。興味深いことに、PDLP5単独のダウンレギュレーション/ノックアウトまたは過剰発現は、それぞれ漿質透過性の増加または減少をもたらします1,17。最近、Liらは、PDLP5とPDLP6が異なる細胞界面で機能することを発見した13。これらの結果は、PDLP5 が他の PDLP と非冗長な機能を持つ可能性があることを示しています。

細胞間コミュニケーションにおけるPDの重要な機能のために、私たちは植物PDタンパク質PDLP5およびPDCB1、および カブ静脈クリアウイルス (TVCV)のウイルス細胞間移動タンパク質(MP)を細胞生物学実験のためのシンプルで便利で信頼性の高いPDマーカーとして展開するためのプロトコルを開発しました。さらなる検証のために、サンプリングした組織のアニリンブルー染色を用いたPDの可視化を並行して進めました。PDLP5、PDCB1、およびTVCV MPのPD局在について記載されているプロトコルは、生きた植物における任意の細胞または病原体由来タンパク質の潜在的なPD局在を分析するために容易に適合させることができます。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.植物の成長

  1. Nicotiana benthamianaの種子を、光16時間、暗闇8時間、23°Cの制御された環境チャンバーの湿った土壌で育てます。
  2. 約2週間後、根の周りに泥炭ペレットを巻き付けた苗を大きな鉢に慎重に移し、農業浸透実験のために同じ条件下で4〜5週間成長を続けます。
    注:花序段階18でGFPの蓄積が減少するため、開花し始めたときに植物を使用しないでください。

2. ベクトル構造

  1. PCRを使用して、Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼで目的のコード配列を増幅し、市販のBP Clonaseキットを使用してBP反応19 によってエントリーベクターpDONR207にクローニングします。
  2. 得られたエントリープラスミド中の標的遺伝子を、市販のLR Clonaseキットを用いてLR反応19 により目的ベクターpPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1に移し、EGFPタグを標的タンパク質のC末端に融合させたプラスミドを作製する。
  3. PCRとシーケンシング19によってすべてのコンストラクトを確認します。

3.アグロインフィルトレーション

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105細胞に異なるベクターを含有し、LB寒天プレート上に28°C下で2日間インキュベートしました。
  2. 1つのコロニーを2 mLのLBブロスに移し、撹拌(250 rpm)しながら28°Cで一晩インキュベートします。
  3. 1 mLを一晩培養し、続いて4 mLの新鮮なLBブロスを加え、同じ条件下で1時間再培養します。
  4. 細菌懸濁液をOD600 = 0.1(2つのタンパク質の共発現についてはOD600 = 0.2)に調整し、浸潤バッファー(MgCl2、10 mM;MES、10 mM、pH 5.6)。
  5. 異なる細菌懸濁液を1:1(v / v)の比率で混合して、OD600 = 0.1の最終濃度にします。(オプション)。
  6. 細菌懸濁液を室温で3時間インキュベートし、柔らかく攪拌します。
  7. 1mLの針のない使い捨て注射器で、さまざまな植物から完全に拡張した葉の軸面に浸潤し、浸潤領域(周囲の浸透していない組織よりも暗い色)を防水ペンでマークします。
  8. このプロトコルの共焦点顕微鏡のセクション(ステップ5)に進みます。
    注:関心のある植物種の形質転換に適した Agrobacterium tumefaciens の他の株も使用できます。

4.アニリンブルーステイン

  1. 200 μLの1%アニリンブルー(50 mMリン酸カリウム緩衝液中、pH 8.0)のアリコートを顕微鏡スライド20に加えます。
  2. 静脈から約0.5cm×0.5cmの浸潤領域をブレードで切除し、顕微鏡スライド上のアニリンブルー溶液(ア軸面を上にして)に葉組織サンプルを移し、葉組織サンプルがアニリンブルー溶液に浸されていることを確認してから、カバーガラス(22mm×50mm)で覆います。
  3. サンプルを真空ポンプに取り付けたデシケーターに顕微鏡スライドを入れ、2分間(<0.8Pa)排気した後、圧力をゆっくりと解放し、室温で30分間暗所でインキュベートします。
  4. アニリンブルーの蛍光シグナルを、互換性のあるソフトウェアを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡で可視化します。
    注:ここでは、Huangらによるアニリンブルー染色法20 を使用しました。この技術の修正では、同じ実験を2分間の真空ステップなしで実行し、同様の結果をもたらし、真空乾燥がアニリン染色に必須ではないことを示唆しています。また、アニリンブルーステインの濃度や染色時間は、葉組織の供給源などによって異なる場合があります。

5. 共焦点顕微鏡

  1. 浸潤後、異なる時点で2つの植物から2枚の葉を収穫します。浸潤部を刃物で静脈から約0.5cm×0.5cmスライスに切ります。
    1. 顕微鏡スライドの中央部にある滅菌水(軸面を上にして)に組織サンプルをセットし、気泡を避けながらカバーガラス(22 mm x 50 mm)で覆います。
  2. CFP、GFP、RFP信号の検出のための励起波長がそれぞれ405nm、488nm、561nmであること、検出用の発光フィルタがCFPが410-602nm、EGFPとRFPが400-602nm、ピンホール1AU、マスターゲインが769Vに設定されていることを確認してください。
  3. 浸潤後1日、2日後、3日後、5日後、7日後、10日後に、レーザー走査型共焦点顕微鏡と互換性のあるソフトウェアを使用して、浸潤領域の自己蛍光タグの蛍光シグナルを視覚化します。
    1. 10倍対物レンズとGFPフィルターを使用して蛍光シグナルを持つ細胞を特定し、その後、40倍対物レンズに切り替えて細胞内局在の可視化と画像記録を行います。
  4. 各条件について、少なくとも 2 つの独立した生物学的複製を使用して 20 枚の画像を収集します。
  5. 細胞の周辺部におけるシグナルの診断的点状外観に基づいて、試験されたタンパク質のPD局在をスコアリングする21,22。
    注:未知のタンパク質の細胞内局在を検出する場合は、少なくとも3つの植物を使用することをお勧めします。

6. データ分析

  1. フィジーのソフトウェアを使用してチャンネルを分割し、画像にスケールバーを追加して視覚化します。
  2. Fijiのソフトウェアを使用してチャンネルを分割し、各画像の平均グレースケール値を測定し、異なる時点でのGFP(MP、PDCB1、PDLP5の場合)またはCFP(アニリンブルー染色の場合)の蛍光強度を評価します。
  3. フィジーのソフトウェアを使用して、GFP(MP、PDCB1、PDLP5用)またはCFP(アニリンブルー染色用)の画像を正規化する前にチャンネルを分割します。画像の面積を測定し、PD点を手動でカウントしました。100μm2あたりのPD点の数を計算しました。
  4. テューキーの多重比較検定23 で二元配置ANOVAを使用して、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアで異なるサンプルと異なる時点の間の P値を決定します。
    注:単一チャネル蛍光画像の場合、各ピクセルのグレースケール値は、その点24の蛍光強度を表す。ここでは、平均グレースケール値を使用して、異なる時点における各サンプルの蛍光強度を評価しました。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物生理学におけるPD機能および病原体との相互作用の研究を促進するために、PD局在化のための3つのシンプルで信頼性の高い参照タンパク質が開発されました。2つの細胞PDタンパク質と、植物トバモウイルスTVCVによってコードされる病原体由来のMPタンパク質が選択されました。これらのタンパク質の細胞内局在は、各タンパク質のC末端に融合した自己蛍光レポーターEGFPを使用して視覚化されました。別のアプローチでは、PD関連カロース沈着物のアニリンブルー染色を使用してPDを視覚化しました。実験は、PDLP5とMPの両方が点状PD局在を示し、MPは細胞核にも局在することを示しました(図1A)、前述のように25。対照的に、PDCB1はPDとERの間で分割されているように見えました(図1A)。GFPタグ付きタンパク質の細胞内局在を解釈する経験が浅い研究者のために、 図1A は、植物細胞で発現するEGFPの特徴的な核細胞質パターンも示しています。PDCB1の小胞体信号を確認するために、PDCB1をERマーカーで共発現させたところ、PDCB1の信号が小胞体マーカーの信号と重なっていることがわかりました(図1B)。試験したタンパク質のPD局在の効率を評価するために、蛍光シグナルを発現する細胞のうち、このシグナルのPD局在を示した細胞の割合を計算しました(表1)。

参照タンパク質を用いて細胞内局在を同定するためには、参照タンパク質の発現の時間スケールとその局在化の潜在的な変化を理解することが有用です。 図2 は、PD自体をアニリンブルー染色で可視化した場合のMP、PDLP5、PDCB1の動態を示しています。MPとPDLP5の両方が浸潤後1日(dpi)ですでにPDに蓄積し始め、この蓄積は2 dpiで見かけの最大に達し、さらに5日間安定していましたが、その後、シグナル強度は減少しました。これはおそらくタンパク質の分解によるものです。PDCB1の細胞内ソーティングの時間経過はより複雑で、最初の3 dpiでは、PDCB1は比較的強いERシグナルを示し、PD特異的なシグナル局在をほぼ完全に覆い隠していましたが、5 dpiでは、この後者のシグナルは、細胞数は少ないものの、より顕著になりました(図2)。興味深いことに、5 dpi後にPDCB1の明確なPD局在パターンが出現したのは、EGFPシグナルを示す細胞が大幅に減少したことと一致しました(補足図1)。したがって、PDLP5およびMPは、他のほとんどの細胞コンパートメントでバックグラウンドがほとんどないPD参照タンパク質として機能し、最適な可視化時間枠は2〜5 dpiです。一方、PDCB1はPDマーカーほど適していません。

次に、PDマーカーが他のPDタンパク質の存在下で細胞内局在特異性を保持することが確認されました。この目的のために、MP-EGFPまたはPDLP5-EGFPを、CFPでタグ付けされた別の植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス(TMV)のPD局在化26MPと共発現させた。 図3 は、どちらの場合も、共発現したタンパク質が明確なPD局在パターンを示したことを示しています。同様に、MP-EGFPまたはPDLP5-EGFP発現組織のPD特異的組織学的アニリンブルー染色では、EGFPおよびアニリンブルーシグナルのPD局在に干渉は検出されませんでした(図3)。

PD局在研究は、多くの場合、参照タンパク質の全体的な発現とPDシグナルのより定量的な推定から恩恵を受けます。この定量化アプローチを 図4 と 図5に示します。一般発現の定量化のために、PDLP5およびMPの信号強度を測定しました。どちらのタンパク質も、10 dpiの期間中、すべての可視化時点で強いシグナルを示し、PDLP5では3 dpi、MPでは2 dpiで最大のシグナル強度を示しました(図4)。PDLP5とMPの間のシグナル強度には、どの可視化時点においても統計的に有意な差はありませんでした。PDCB1のシグナル強度は、発現細胞が不足しているため、統計的に有意なデータの収集が困難であったものの、PDCB1のシグナル強度は7dpiで観測され、最も強いシグナルが観測されました(図4)。したがって、最初の 3 dpi は、PDCB1 発現を検出する最適なタイミングを表します。予想通り、アニリンブルー染色サンプルは、一過性に発現したタンパク質よりも安定したシグナルを示しました(図4)。

次に、PDLP5とMPによって形成されるPD点を定量化しました。PDLP5は、観察期間を通じて安定した数のPD点を示し、テストした2つの時点間で統計的に有意な差はありませんでした(図5)。MPによって形成されたPD点の数が最も多かったのは2dpiで、観測期間が終了するまで比較的安定していました。PDLP5とMPのPD点数を比較すると、ほとんどのサンプリング時間で統計的に有意な差は見られませんでした(図5)。アニリンブルーで染色されたPD点の数も安定していましたが、10dpiでわずかに減少しました。アニリンブルー、PDLP5、またはMPで装飾されたPD点の数は、統計的有意性(図5)で互いに類似しており、これらのマーカーのPD特異性と一致していました。PDCB1 の PD 点の数は、以前の時点では PD 信号が ER 信号によって不明瞭になり、後の時点では比較的少数の細胞でしか観察されなかったため、解析されませんでした ( 図 2 を参照)。

figure-results-1
図1: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPlasmodesmata(PD)局在とPDのアニリンブルー染色 (A)MP-EGFP、PDLP5-EGFP、およびPDCB1-EGFPのPD局在とアニリン染色。EGFPシグナルは緑、アニリンブルーシグナルは青、プラスチド自家蛍光は赤です。(B)MP-EGFP、PDLP5-EGFP、およびPDCB1-EGFPとmRFPでタグ付けされた小胞体(ER)マーカーとの共発現。画像は浸潤後2日(dpi)で記録され、2つの独立した実験を代表する単一の共焦点切片です(N = 2つの植物からの20枚の画像)。EGFPシグナルは緑、mRFPシグナルは紫、プラスチド自家蛍光は赤です。黄色の矢印は、PDCB1がERに局在していることを示しています。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPD局在とPDのアニリンブルー染色の経時変化。 画像は2dpiで記録され、2つの独立した実験を代表する単一の共焦点切片です(N = すべてのシステムについて2つの植物からの20枚の画像、ただし、シグナルを示す細胞が少なかったPDCB1-EGFPの7dpiと10dpiを除く)。EGFP信号は緑色で、アニリン青色の信号は青色です。スケールバー = 5 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:TVCV MPおよびPDLP5は、PD局在化TMV MPとの共発現およびアニリンブルーとの共染色後もPD局在を保持します。 画像は2dpiで記録され、4〜6の植物からのN≥10の画像を代表する単一の共焦点セクションです。EGFPシグナルは緑、CFPシグナルとアニリンブルーシグナルは青、プラスチド自家蛍光は赤です。スケールバー = 5 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4: Nicotiana benthamiana およびアニリンブルーPD染色で一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1の蛍光強度の経時変化。 定量的データは、 図2に示す実験から収集されました。エラーバーは、複数の実験からの平均の標準偏差を表します。個々のデータポイントは、各測定値の平均として示されます。二元配置分散分析とテューキーの多重比較検定によって評価された平均値との差は、P値に対して統計的に有意です。*P < 0.05、**P < 0.01、および ***P < 0.001、****P < 0.0001;ns、統計的に有意ではありません。青いバー、アニリン染色;薄緑色のバー、MP-EGFP、濃い緑色のバー、PDLP5-EGFP;黄色のバー、PDCB1-EGFP。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5: Nicotiana benthamiana で一過性に発現するTVCV MPおよびPDLP5によるPD点形成とPDのアニリンブルー染色によるPD点形成の経時変化。 定量的データは、 図2に示す実験から収集されました。エラーバーは、複数の実験からの平均の標準偏差を表します。個々のデータポイントは、各測定値の平均として示されます。二元配置分散分析とテューキーの多重比較検定によって評価された平均値との差は、P値に対して統計的に有意です。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。青いバー、アニリン染色;薄緑色のバー、MP-EGFP、濃い緑色のバー、PDLP5-EGFP。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

実験I.
合計セル数PD局在化を有する細胞シグナルが混在する細胞PD局在化細胞(%)
アニリンブルー40404100
MP-EGFPの40404100
PDCB1-EGFPの403387.5
PDLP5-EGFPシリーズ40400100
実験II.
合計セル数PD局在化を有する細胞シグナルが混在する細胞PD局在化細胞(%)
アニリンブルー40408100
MP-EGFPの4039897.5
PDCB1-EGFPの40123130
PDLP5-EGFPシリーズ4039297.5

表1:PDローカリゼーションの効率。

補足図1: Nicotiana benthamianaで一過性に発現するTVCV MP、PDLP5、およびPDCB1のPD局在。 画像は 5 dpi (A)、7 dpi (B)、および 10 dpi (C) で記録されました。EGFPシグナルは緑色で、色素体自家蛍光は赤色です。スケールバー = 20 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

正常な植物の発生と形態形成、および植物と病原体の相互作用における植物の細胞間コミュニケーションと細胞間輸送に関する細胞生物学的研究では、内因性および病原体にコードされたタンパク質と植物の細胞間接続であるプラスモデスマタ(PD)への選別の検出とモニタリングが必要です。これらの実験は、内因性か病原体由来かにかかわらず、PDに忠実かつ一貫して局在する参照タンパク質を使用し、これらの構造を装飾および視覚化することにより、大幅に促進されます。このニーズは、シロイヌナズナPDLP5とPDCB1、およびトバモウイルス病原体TVCVのMPという3つの既知のPD局在化タンパク質を選択することで対処します。これらのタンパク質は、自己蛍光レポーターEGFPでC末端でタグ付けされ、得られた融合タンパク質がPDにソートする能力は、 Nicotiana benthamiana の葉での一過性の発現と発現組織の共焦点顕微鏡分析の後に決定されました。これらの組織におけるPDの一般的な可視化には、標準的なアニリンブルー染色法を利用しました。

植物ウイルスMPは、PDの構造と完全性への影響に関して、PD透過性を可逆的に増加させ、PDの構造変化なしに増加させるMPと、その構造を変更することによってPDをゲートするMPの2つの主要なグループに分類されると考えられています。トバモウイルスのMPは、TVCVのような最初のグループであるMPグループに属し、細胞内局在研究のためのPDの魅力的なマーカーとして位置付けられている27,28。

これらの実験により、PDLP5-EGFPおよびMP-EGFPは、PDの検出効率がアニリンブルー色素と同等に、信頼性と再現性のあるPDの生物学的マーカーとして位置付けられました。PDLP5-EGFPとMP-EGFPのPD局在は、10 dpiの全観測期間を通じて検出され、2 dpiから3 dpiの間の特徴的なPD局在パターンを観察するのに最適な時間でした。35Sプロモーターからの発現は、発現遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす可能性がありますが、これはしばしば安定的に形質転換されたトランスジェニック植物での長期発現後に発生します。一方、この強力な構成的プロモーターの使用は、マーカータンパク質の検出を容易にするために重要です。参照タンパク質の発現が7-10 dpi後に低下する場合は、より短い期間、つまり2-3 dpiを使用する必要があります。PDLP5とMPとの間の全体的な細胞内局在パターンの有意差は、ここでは検出されなかったが、MPはPDに加えて細胞核に蓄積していた。逆に、PDCB1は、その細胞内局在パターンが複雑で、ERへの実質的な局在を含むため、PDマーカーとしての使用自体は推奨されない。

EGFP蛍光シグナルの検出の容易さは、植物の成長段階にも依存しました。具体的には、 N. benthamianaでは、花序段階18で最も低いEGFPシグナル蓄積が認められました。

この研究は、他の細胞内コンパートメントに最大限に排他的なPD局在マーカーを開発することを目的としていました。したがって、追加の細胞内局在化能力を持つ目的のタンパク質の局在化の参照として使用することは、ER、ミトコンドリア、原形質膜などに特異的なマーカーなどの他の細胞内マーカーの発現と組み合わせる必要があります。この場合、これらのマーカーの発現のために追加の アグロバクテリウム 細胞を含めることは、アグロイン浸潤培養物の最終濃度、すなわち液体培養物のOD600 を計算する際に考慮されるべきである。明らかに、細胞濃度と植物の成長時間は、他の植物種における最大発現とPD局在パターン検出に適合させる必要があります。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する利益を宣言しません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VC研究室での研究は、NIH(R35GM144059)、NSF(MCB 1913165およびIOS 1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からのVCへの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、または出版の決定に関与していませんでした。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC1相モータBRANDTECH&nbsp;ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
コンタミネーションコントロール CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software株式会社
画像J国立衛生研究所および光学・計算機器
レーザー走査型共焦点顕微鏡ZeissLSM 900
Nicotiana benthamiana植物種
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S
研究所

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

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