方法論記事

インビトロ ヒト人工多能性幹細胞を用いたダウン症の神経新生のモデリング

DOI：

10.3791/67382

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2025年3月7日

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Neurobiology Lab, National Centre for Cell Science, S.P. Pune University Complex, 2Regional Centre for Biotechnology

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、DSヒトiPS細胞を使用してダウン症(DS)の神経新生障害を再現するための方法論を概説しています。プロトコルは、ダウン症候群の神経新生障害の原因として二相性細胞周期の欠陥を特定しました。これは、DSに関連する異常なニューロン新生の根底にある細胞および分子メカニズムを理解するための堅牢なプラットフォームを提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ダウン症(DS)は、21番染色体のコピーが余分にあることによって引き起こされ、知的障害の主な原因です。この知的障害の主な要因の1つは、胎児期以降に観察される神経新生の障害です。これらの神経発達異常を研究するために、DS患者から得られた細胞を使用して生成されたヒト誘発多能性幹細胞(hiPSC)は、貴重で関連性のあるモデルを提供します。ここでは、DS胎児期に観察されるDS障害ニューロン新生を再現するための包括的なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、21 番染色体の 3 つのコピーを持つ DS-iPSC のペアと、2 つの染色体 21 つのコピーを持つその同質正倍数体 iPSC を利用します。重要なことに、ここに記載されているプロトコルは、DS障害のあるニューロン新生を再現し、二相性細胞周期の欠陥、すなわち、神経原性段階の初期段階でのDS神経前駆細胞(NPC)の増殖の減少、続いて神経原性段階の後期段階でのDS NPCの増殖の増加がDS障害ニューロン新生の原因であることを発見しました。神経原性期の後期にDS NPCの増殖が増加すると、細胞周期からの退出が遅れ、DS NPCからの有糸分裂後ニューロンの生成が減少します。このプロトコルには、ヒトiPS細胞の維持、神経原性段階での二相性細胞周期欠損を示す神経系統への分化、およびその後のDS細胞における神経分化の減少の検証のための詳細な手順が含まれています。この方法論に従うことで、研究者はDSの神経発達状態を模倣した堅牢な実験システムを作成することができ、21トリソミーによって引き起こされる脳の発達の特定の変化を探求することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ダウン症(DS)または21トリソミーは、最も一般的な染色体異常であり、知的障害(ID)の主な原因です1。DS胎児発育中の神経新生障害は、DS2の知的障害の原因の1つです。ヒトDS胎児研究では、脳の重量と体積の減少、ニューロンの減少、アストロサイトの増加3,4、および第II層とIV層のニューロンの異常な分布が示されています5,6。さらに、皮質発達の第2段階、すなわちラミネーションの出現は、DS7では遅延し、無秩序である。

DSの神経発達障害は、主にTs65Dn、Ts1Rhr、Ts1cjeなどのDSのマウスモデルを使用して研究されています8。しかし、これらのマウスモデルは、マウスとヒトとの間の生理学的および発達的な違い9のために、DS研究で観察されたさまざまな表現型を完全に再現することができず、臨床試験の失敗につながった10。人工多能性幹細胞11,12の発明は、DS患者に直接由来する細胞を用いてダウン症の神経学的障害をモデル化する機会を提供した。しかし、ヒトiPS細胞を用いてDSの神経発達障害をモデル化する以前の試みでは、一貫性のない結果が得られ、DS胎児の脳切片13,14,15,16で観察された神経発達障害を完全に説明することはできませんでした。例えば、Shiらが発表した報告では、DS関連のアルツハイマー病の表現型が見つかりましたが、正倍数体対照と比較してDSの神経新生に差はなかったと報告されています15。同様に、Weickらは、正倍数体対照と比較して、DSのシナプス活性の低下が正常な神経新生を報告した16。しかし、これらの論文で報告されたDSの正常な神経新生は、DS胎児の脳切片からの観察と一致しませんでした。その後、Hibaouiらによる報告により、DSの神経新生の減少が報告されましたが、これはDSの胎児脳セクション14からの観察と一致していました。しかし、この報告と別の最近の報告では、DS NPCの増殖の減少がDSの神経新生の減少の原因として説明されています17。しかし、DS NPCの増殖の減少だけでは、DS胎児の脳の発達中にアストログリア細胞の増加とラミネーションの出現の遅延を説明できませんでした。

最近発表された研究では、ヒトiPS細胞を用いたDS欠損型ニューロン新生モデルが開発され、ニューロン新生の減少が示されました。このモデルでは、DSの神経新生障害は、神経原性(多能性幹細胞から神経前駆細胞が生成される段階)の二相性細胞周期の欠陥によるものであることがわかりました。神経原性段階の最初の段階では、DS NPCは同質正倍数体神経細胞と比較して増殖が減少し、続いて神経原性病期18の後期に同質正倍数体細胞と比較してDS NPCの増殖が増加します。

この原稿では、ダウン症の iPSC とその同質正倍数体 iPSC を皮質ニューロンに分化するための段階的な詳細なプロトコルについて説明しました。この方法の全体的な目標は、DS に関連するニューロン新生欠損のモデル化に焦点を当てて、DS hiPSC のペアとその同質正倍数体 iPSC を皮質ニューロンに区別するための詳細な段階的なプロトコルを提供することです。このプロトコルは、DS 障害の神経新生を引き起こす異常の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するための堅牢で再現性の高いシステムを提供するように設計されています。

このプロトコルの開発の背後にある理論的根拠は、発生神経生物学の原則を利用して多能性幹細胞の皮質ニューロンへの分化を可能にし、それによって疾患/障害によって生じる表現型の同定を可能にすることです。これは、cAMPやDAPTのような化合物を避けることにより、iPS細胞の神経分化に最小限のアプローチを取ることを目指しました。これは、それぞれCa++ チャネルまたはNOTCH経路の欠陥によって生じる疾患の表現型を隠す可能性があります。同様に、アスコルビン酸、BDNF、およびGDNFの使用も避けられ、神経新生を増強することにより他の神経疾患関連の表現型を隠す可能性があります。

この手法が他の方法よりも優れているのは、DS胎児の脳切片で観察された神経学的表現型の堅牢な再現を提供することにあります。注目すべきは、マウスモデルと比較して、ヒトiPS細胞ベースのシステムは異種間の違いを排除し、ヒト特異的な神経発達過程を研究する ためのより適切なモデルを提供している9が、これまでDS胎児期以降に観察されるDS障害のニューロン新生を再現することができなかった。さらに、iPS細胞の同遺伝子ペアの使用により、観察された表現型の違いのばらつきが減少し、信頼性が向上します。このプロトコルは、神経発達障害とヒトの神経新生を研究する研究者にとって特に興味深いものとなるでしょう。これは、DSのヒト特異的な側面をモデル化しようとしている人や、21トリソミーに関連する神経新生欠損を標的とする治療的介入の開発に関心のある人に特に関連します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

次のプロトコルに続いて、2組のダウン症候群とその同質正倍数体ヒトiPS細胞を使用しました。1組は、レトロウイルス媒介送達法であるリプログラミング19を用いて作製し、もう一組(NSi003-AおよびNSi003-B)は、非統合型仙台ウイルス送達法を用いて作製した20。プロトコルは、大きく分けて 2 つの段階で構成されています: 神経原性段階 (ステージ 1) と神経分化段階 (ステージ 2)。さらに、ダウン症候群と同質正倍数系細胞株の増殖の違いに基づく2つの段階、すなわち、初期期と後期期が神経原性段階で観察されます。この研究で使用した試薬、培地、および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. ダウン症のヒトiPS細胞と同質正倍数系ヒトヒトPS細胞の培養と維持

  1. hiPSC用フィーダーめっき
    注:フィーダーの品質と密度は、ヒトiPS細胞の培養を高品質にするために非常に重要です。
    1. フィーダーセルを播種する前に、2 mLの0.1%ゼラチンを加えて、6ウェルプレートを37°Cで少なくとも1〜2時間コーティングします。
    2. ゼラチンでコーティングしたプレートを細胞培養フード内で室温で少なくとも30分間保持してから、細胞をプレーティングします。
    3. ビーズ浴/水浴での蘇生に使用される温熱マウス胚性線維芽細胞(MEF)培地。
    4. 5 mLのMEF培地を15 mLの遠心チューブに分注します。
    5. 液体窒素タンク(LN2タンク)からフィーダーセルのバイアルを取り出します。
      注:フィーダー細胞は、E13.5マウス胚性線維芽細胞を10μg / mLマイトマイシンCで3時間処理した後、DPBS18で2〜3回洗浄することによって得られました。フィーダーセルは、直接使用することも、将来の使用のためにLN2タンクで凍結することもできます。すべてのマウスは、動物倫理委員会の承認後に使用されました。
    6. バイアルをフローティングラックを使用してウォーターバスで37°Cに保ち、氷の小片が残るまで待ちます。
    7. バイアルをバイオセーフティキャビネットに入れ、アルコールで滅菌してからバイオセーフティキャビネットに入れます。
    8. 1 mLの温かいMEF培地( 材料の表を参照)を一滴ずつ加えます。
    9. バイアルから培地を静かに取り出し、MEF培地が入った15mLの遠心チューブに一滴ずつ注ぎます。
    10. 室温で200 x gで5分間遠心分離します。
    11. 真空吸引システム(VAS)を使用して上清を吸引します。
    12. MEF培地1mLを加え、3〜4回ピペットで静かに上下させます。
    13. 血球計算盤を使用して細胞数を取ります。死細胞はTrypan Blueを使用して除外しました。
    14. プレート 3.1-3.3 x 10 MEF 培地中の 6 ウェルプレートのウェルあたり5 個の生フィーダー細胞、または 6 ウェルプレートあたり 2 x 106 細胞。
    15. プレートをCO2 インキュベーター内に37°C、湿度85%で一晩保管します。CO2 インキュベーター内のプレートを前後および横に2〜3回振って、フィーダー細胞の均一な分布を実現します。
  2. ダウン症のhiPSCと同質正倍数性hiPSCの復活
    注:必要な量のhiPSC培地を37°Cビーズ浴で温めます。
    ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)リバイバル培地:25 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)と10 μMの岩石阻害剤(RI)(Y-27632 2HCl)をhiPSC培地に新たに加えます。
    1. フィーダーウェルからMEF培地を取り出し、ウェルの側面から温かいDMEM/F12を1 mL/ウェルで穏やかに加えて、フィーダーに1回洗浄します。培地を吸引し、2 mL/ウェルウォームの hiPSC リバイバル培地を加えます。プレートをインキュベーター内に少なくとも2時間放置してから、hiPSCをプレーティングします。
    2. hiPSCのバイアルを取り出します。
    3. バイアルを37°Cのウォーターバスのフローティングラックに置き、小さな氷片が残るまで保管します。
    4. バイアルをバイオセーフティキャビネット内に取り込む前に、70%アルコールで滅菌してください。
    5. 温かいhiPSCリバイバル培地1mLを加えます。
    6. バイアルから培地を静かに取り出し、5 mLのhiPSCsリバイバル培地が入った15 mLの遠心チューブに一滴ずつ注ぎます。
    7. 100 x gで室温で2分間遠心分離します。
    8. VASを使用して上清を吸引し、チューブを軽くたたいてペレットを取り除きます。
    9. 500 μL の hiPSC 培地と 10 μM の RI を注ぎ、hiPSC リバイバル培地が入ったフィーダープレートに注ぎます。プレートにセル名、継代番号、研究者名、日付をラベル付けします。
    10. 倒立顕微鏡でhiPSCコロニーを4倍の倍率で観察します。細胞の塊があるはずです。
    11. プレートをCO2 インキュベーター内に保持しながら、プレートを前後および横に2〜3回振って、細胞の均一な分布を実現します。プレートを24時間邪魔しないでください。
    12. 翌日、一部のコロニーはフィーダーに付着しているように見えるかもしれませんし、一部のコロニーは浮いているかもしれません。培地を吸引せずに、25 ng/mL bFGFと10 μMのRIを添加した新鮮なhiPSC培地を添加します。
    13. 復活後2日目には、ほとんどのコロニーが地表にくっついてしまう。完全培地を 25 ng/mL bFGF の hiPSC 培地に交換します。数日後には、hiPSCコロニーが見えるようになります。
      注:hiPSCが蘇生し、滑らかで明確な境界、均一な細胞形態、密集したコロニー中心を持つコロニーを作るには、少なくとも1週間かかります。
  3. フィーダー上のダウン症候群の継代性hiPSCおよび同質性正倍数体hiPSCの作製
    注:開始する前に、すべての試薬を温めておく必要があります。細胞の過剰ピペッティングを避けてください。細胞を非常に優しく扱います。
    1. ほとんどのコロニーが互いに融合し始めたとき、または分化したコロニーが多すぎるときに、通過性iPSCs。一般的に、分割は最初の通過後5〜7日以内に行う必要があります。
    2. 分割の1日前にフィーダーのバイアルを復活させます。
    3. 1 mL/ウェルの温かいDMEM/F12をフィーダーに1回洗浄し、25 ng/mLのbFGFを添加した2 mL/ウェルの温かいiPS細胞培地を加えます。プレートをCO2 インキュベーター内に37°Cで少なくとも2時間放置してから、hiPSCをプレーティングします。
    4. 分化したコロニーについてhiPSCを含むプレートを観察し、実体顕微鏡下で200μLのピペットを使用してスクラップすることにより、分化したコロニーを除去します。
    5. hiPSCを1 mL/well warm DMEM/F12で1回洗浄します。
    6. 1 mL/ウェルに1 mg/mlのコラゲナーゼ溶液を注ぎます。プレートをインキュベーター内に8〜10分間保持し、倒立顕微鏡でコロニーの緩いエッジを観察します。
    7. コラゲナーゼを吸引し、DMEM/F12を2回洗浄します。次に、1 mL/well hiPSC Mediumを添加します。
    8. 2mLシリンジの先端を使用して、ウェル内でコロニーを水平および垂直に8〜10回穏やかに切断します。倒立顕微鏡でコロニーを観察し、ほとんどのコロニーが適切なサイズにカットされているかどうかを確認します。
    9. コロニーが十分に切断されている場合は、セルリフターを使用してコロニーを静かに持ち上げます。
    10. コロニーのサイズに応じて、1mLチップを使用してウェル内のコロニーを5〜8回静かにピペットで動かします。
    11. すべての細胞を15 mLの遠心チューブに集め、100 x gで室温で2分間遠心分離します。
    12. ピペットで上清を静かに吸引し、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを取り除き、200 μL の hiPSC 培地に 25 ng/mL の bFGF と 10 μM の RI を加えます。200 μLのピペットで2〜3回ピペットを動かし、さらに300 μLのhiPSC培地に25 ng/mL bFGFと10 μMのRIを加えます。
    13. 次に、これらの細胞をhiPSC培地+ 25 ng/mL bFGFを含むフィーダーに優しく播種します。1つのウェルは、差別化されたコロニーを除去した後に存在するコロニーの数に応じて、1:2または1:3に分割できます。プレートにセル名、継代番号、研究者名、日付をラベル付けします。
    14. プレートをCO2 インキュベーター内に保持しながら、プレートを前後および横に2〜3回振って、細胞の均一な分布を実現します。
    15. 翌日、温かいDMEM/F12で1回優しく洗い、2.5 mLのhiPSC培地と25 ng/mLのbFGFを加えます。
  4. フィーダーからの凍結ダウン症候群 hiPSC および同遺伝子ユーロイド iPSC
    注:凍結手順では、ヒトiPS細胞の過剰ピペッティングは避けてください。
    1. iPSCは、まだ対数期にあるとき、つまり継代後4〜5日後に分割します。
    2. ヒトiPS細胞を含むプレートで分化したコロニーを観察し、実体顕微鏡で200μLのピペットを使用して分化したコロニーを除去します。
    3. hiPSCを1 mL/well warm DMEM/F12で1回洗浄します。
    4. 1 mL/ウェルの1 mg/mLコラゲナーゼ溶液を加えます。プレートをインキュベーター内に8〜10分間保持し、倒立顕微鏡でコロニーの端を持ち上げて観察します。
    5. コラゲナーゼを吸引し、DMEM/F12を2回洗浄します。次に、1 mL/well hiPSC Mediumを添加します。
    6. セルリフターを使用してコロニーを静かに持ち上げます。
    7. コロニーのサイズに応じて、1mLチップを使用してウェル内のコロニーを5〜8回静かにピペットで動かします。
    8. すべての細胞を15 mLの遠心チューブに集め、100 x gで室温で2分間遠心分離します。
    9. ピペットで上清を静かに吸引し、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを取り除き、ウェル数に応じて25 ng/mL bFGFを添加した抗生物質を含まないhiPSC培地1 mLを加えます。細胞をクライオバイアルに分注します。
    10. 25 ng/mL bFGF と 20% DMSO を添加した抗生物質を含まない hiPSC 培地をクライオバイアルに添加すると、DMSO の最終濃度が 10% になります。
    11. クライオバイアルをイソプロパノール浴のある冷ややかな場所に入れて、ゆっくりと凍結します。
    12. 霜が降りるような状態を-80°Cで一晩保ちます。翌日、バイアルをLN2タンクに移します。

2. 神経細胞の分化

注:フィーダーコンディショニング培地(FCM)の調製:T-75フラスコを使用し、フラスコごとに4 x 106 フィーダーセルをプレートします。翌日、40 mLのhiPSC培地と4 ng/mLのbFGFを加えます。7日間集めます。各デイチューブは-20°Cで最大1か月間保管してください。15 cmのディッシュに10 mLの0.1%ゼラチンを37°Cで少なくとも2時間コーティングしてから、細胞を解離します。細胞を解離する1日前に、hESC修飾基底膜マトリックス(以下「適格マトリックス」という)で6ウェルプレートをコーティングします。プロトコール全体で細胞を解離する場合は、細胞剥離溶液( 材料表を参照)、DPBS、およびプレーティング培地(FCMに25 ng/mL bFGFを添加)に10 μMのRIを添加します。あらゆる差別化に対応するフレッシュフィーダーコンディショニング培地(FCM)を調製します。hiPSCの過剰ピペッティングは避けてください。

  1. Day In vitro (DIV) 2:神経分化のための単一細胞の作製とhiPSCの播種
    1. 25 ng/mL bFGFを添加したhiPSC培地、DPBS、細胞剥離溶液、および25 ng/mL bFGFを添加したフィーダーコンディショニング培地に10 μMのRIを添加します。これらすべての試薬を37°Cで温めます。
    2. フィーダー上にiPS細胞の6ウェルプレートを載せ、分化したコロニーを除去し、25ng/mLのbFGFと10μMのRIを添加した新鮮なhiPSC培地を加えます。プレートをインキュベーターに2時間保管します。
    3. 2時間後にiPS細胞プレートを取り出し、Ca++ およびMg++を含まないDPBSで1回洗浄します。
    4. 1 mL/ウェル細胞剥離溶液(+10 μMのRI)を加え、プレートをCO2 インキュベーター内に12〜14分間保持します。
    5. 12〜14分後、倒立顕微鏡で細胞を観察します。ほとんどの細胞はプレートから剥離し始めます。まだ一部の細胞が付着している場合は、プレートを側面から軽くたたいてください。
    6. 3 mL/well DPBSをCa++ およびMg++ (+10 μMのRI)を加えて細胞剥離溶液を希釈します。5mLのピペットを使用して、2〜3回穏やかにピペッティングを行い、泡が塊を壊さないようにします。
    7. 細胞を40 μMのストレーナに通します。
    8. 細胞を50 mLの遠心チューブに集めます。
    9. 室温で200 x g で5分間遠心分離し、VASを使用して培地を穏やかに吸引します。
    10. 細胞を10 mLのhiPSC培地(+25 ng/mL bFGF + 10 μMのRI)に再懸濁します。0.1%ゼラチンでコーティングした15cmディッシュに細胞を1.5時間加えると、フィーダーはhiPSCに比べてゼラチンコーティング表面に優先的に接着するため、フィーダーを取り出します。
    11. 1.5時間後、培地を細胞とともに静かに回収し、室温で200 x gで5分間遠心分離します。VASを使用して培地を吸引します。
    12. 細胞を1 mLのFCM(+25 ng/mL bFGF + 10 μMのRI)に再懸濁し、細胞数を測定します。
    13. FCM(+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM of RI)を使用して、30,000-50,000細胞/mLの細胞懸濁液を作製し、5 mLの細胞懸濁液/60 mmプレートまたは2 mL/ウェルの6ウェルプレートまたは500 μL/ウェルの24ウェルプレートを播種します。プレートは、適格なマトリックスでコーティングする必要があります( 材料の表を参照)。
  2. DIV 0: (~48 時間後): フィーダーコンディショニング培地を NPC 培地 (ビタミン A + N2 を含まない DDM + B27) に変更します ( 材料の表を参照)。
  3. DIV 2: DIV 18 まで隔日で 0.125 μM のドルソモルフィンを含む NPC 培地を追加します。
  4. DIV 18: ドルソモルフィンを含まないNPC培地を追加し、DIV 28まで隔日で補充します。
  5. DIV 28-30: ステージ2の単一細胞の作成とNPCの播種
    1. DIV 28で、プレート(NPCを含む)を取り出し、メディアをNPCメディア(+10μMのRI)と交換します。プレートをCO2 インキュベーターに2時間入れます。
    2. 2時間後、培地を吸引し、DPBS(Ca++ およびMg++なし)で1回洗浄します。
    3. 1 mL/ウェル細胞剥離溶液(+10 μMのRI)を加え、プレートをインキュベーター内に14分間保持します。
    4. 14分後、倒立顕微鏡で細胞を4倍で観察します。ほとんどの細胞がプレートから剥離し始めます。まだ一部の細胞が付着している場合は、プレートを側面から軽くたたいてください。
    5. 3 mL/well DPBSをCa++ およびMg++ (+10 μMのRI)で添加して、細胞剥離溶液を希釈します。5mLのピペットを使用して、2〜3回穏やかにピペッティングを行い、泡が塊を壊さないようにします。
    6. 50 mLの遠心分離チューブに40 μMのストレーナを通します。
    7. 室温で200 x gで5分間遠心分離します。VASを使用してメディアをやさしく吸引します。
    8. DDM + B27中の細胞をビタミンA(+10μMのRI)で再懸濁します。
    9. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。
    10. 50,000細胞/ウェルを、48ウェルプレートの適格なマトリックスコーティングプレート(1x)に播種します。
  6. DIV 33:培地を神経分化培地に変更します( 材料の表を参照)。媒体は5日ごとに交換します。DIV 85/90までメディアの補充を続けます。

3. 免疫細胞化学(ICC)

注:細胞を覆い、洗浄段階での吸引中にウェルが乾燥するのを防ぐのに十分なバッファーをすべての段階で追加します。

  1. 分化した細胞プレートを細胞培養領域の外側に取り出します。
  2. メディアを吸引し、DPBS洗浄を行います。
  3. 固定するには、4%パラホルムアルデヒド(PFA)1 mLを細胞に加えます。プレートをアルミホイルで覆い、ロッカーシェーカーに37°Cで30分間置きます。
  4. PFAを吸引し、DPBS(Ca++ およびMg++なし)で15分間ごとに3回洗浄します。
  5. ブロッキングバッファー(3% BSA + 5% Donkey Serum(または二次抗体の宿主動物由来の血清)+ 0.2% Triton-X in DPBS)を室温で1時間添加します。
  6. 一次抗体[Ki67(1:100希釈)、TUBB3(1:500希釈)、PAX6(1:100)]を250 μL/ウェル添加し、ロッカーシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。希釈はブロッキング溶液中で行いました。
  7. 一次抗体のインキュベーション後、DPBSで3回洗浄します。
  8. 二次抗体(1:250を3% BSA + 0.2% Triton-X溶液DPBSで希釈)を250 μL/ウェルで室温で1時間加えます。
  9. 二次抗体インキュベーション後、DPBSで3回洗浄します。
  10. DAPI(DPBS中の5 mg/mLストックの1:1000希釈)を室温で15分間加えます。DPBSで3回洗浄します。最後の洗浄を培養プレートに残し、顕微鏡で観察します。

4. 画像の取得と解析

  1. 蛍光顕微鏡を使用して20倍の解像度で画像をキャプチャします。
  2. Ki67の画像、540 nmの励起フィルターを使用したTUBB3染色画像、488 nmの励起フィルターを使用したPAX6、358 nmの励起フィルターを使用したDAPI画像の撮影が可能です。
  3. 分析のために10の異なるランダムフィールドから画像をキャプチャします。
  4. ImageJソフトウェアを使用してICC画像を解析します。
  5. TUBB3 解析と PAX6 解析では、赤信号と緑の信号、および DAPI の青信号強度について、すべてのイメージのしきい値処理を実行します。TUBB3 の赤ピクセルと PAX6 の緑ピクセルの平均強度は、DAPI の青ピクセルの平均強度で正規化されました。
  6. Ki67解析では、ImageJソフトウェアの自動セルカウンター機能を使用して細胞をカウントします。Ki67陽性セルの数をDAPI陽性セルの数で正規化します。
  7. 統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して、対応のない t検定を使用して2つのグループを比較することにより、統計分析を実行します。データは、3つの独立した実験からの平均±SEMとして表されるべきです。0.05未満の p値は、統計的に有意であると見なされます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特異化したヒトiPS細胞を、シングルセル懸濁液として適格なマトリックスコーティング皿に播種し、bFGFを除去することで分化を開始しました。非外胚葉分化を阻害するために、BMPシグナル伝達阻害剤であるドルソモルフィンをDIV 2-1821から添加した。神経原性段階から前駆細胞をさらに分化させるために、単一細胞懸濁液を適格なマトリックス(図1)上に低密度で再播種し、さらに6〜10週間、早期の神経分化を観察しました。神経分化段階(ステージ2)の後、85日目の分析では、DS培養におけるTUBB3+ニューロンの有意な減少が、同質正倍数体細胞を持つニューロンと比較して明らかになりました(図2A)。定量では、DS培養におけるTUBB3+ニューロンの約2倍の減少が示されました(図2B)。このことは、DS細胞が神経細胞の分化が減少していることを示しており、これはDS胎児の脳切片からの観察と一致しており、この研究で使用された

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、Euploid hiPSCsとDS hiPSCsの同遺伝子ペアに対する効率的な非指向性単層皮質神経分化プロトコルについて説明します。細胞は単層として増殖するため、培養条件によりさらされやすく、これは、他のプロトコル14,16で一般的に使用されるiPS細胞の分化に胚様体を使用するのと同じ程度には不可能です。オルガノイドシステムの有用性が増大する一方で、単層ベースの神経分化システムは、細胞に均質な分化環境を提供するという利点を持っています。オルガノイドベースのシステムでは、その3次元的な性質により、局所的なパターニング中心のような活性が形成される可能性があります。さらに、オルガノイド内のすべての細胞は、外因的に添加された成長因子に平等にアクセスできるわけではなく、オルガノイドの中心での細胞死から明らかなように、制御不能なモルフォゲン勾配につながります。オルガノイド法にはいくつかの改良が提案されていますが、ヒトサンプルで観察された表現型を再現する...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

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著者らは、ダウン症と同質正倍数系のiPSCを提供してくださったStuart H. Orkin教授に感謝します。また、著者らは、この研究を実施するための資金を提供してくれたプネーの国立細胞科学センター(BRIC-NCCS)にも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MEF 培地:
DMEM 高グルコースGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% 最終濃度
非必須アミノ酸ハイクロンSH30238.01最終濃度 1X 最終濃度
ペニシリン/ストレプトマイシンハイクロンSV300101X 最終濃度
β-メルカプトエタノールGibco21985-0231X 最終濃度
<強>hiPSC 培地:
ノックアウト DMEM/F12Gibco 12660-012
ノックアウト血清交換 (KOSR)Gibco10828-02820% 最終濃度
非必須アミノ酸HycloneSH30238.011X 最終濃度
GlutamaxGibco 350500611X 最終濃度
ペニシリン/ストレプトマイシンHycloneSV300101X 最終濃度
&β;-メルカプトエタノール (1000X)Gibco21985-0231X 最終濃度
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
非必須アミノ酸HycloneSH30238.011X 最終濃度
GlutamaxGibco 35050061最終濃度 1X
ペニシリン/ストレプトマイシンHycloneSV300101X 最終濃度
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 17502048最終濃度
B-27 サプリメント (50X) の 1X からビタミン A を差し引いたGibco 125870101X 最終濃度
神経分化培地 (ND):
DDM 培地1/2 体積の
Neurobasal 培地Gibco 21103-049ボリューム
N2サプリメントGibcoの1/2 175020480.5 X 最終濃度
B-27 サプリメント (50X)Gibco 175040440.5 X 最終濃度
GlutamaxGibco 350500611X ニューロ基礎培地
ペニシリン/ストレプトマイシンハイクロンSV300101X ニューロ基礎培地
<ストロング>抗体および免疫染色用試薬:>
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなしSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
精製抗チューブリン &β;-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 希釈
Donkey 抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Alexa fluor 594 コンジュゲートLife Tech Invitrogen A212031:250 希釈
精製マウス-抗ヒト Ki67BD Pharmingen5506091:100 希釈
精製抗 PAX6BioLegends9013021:100 希釈
Alexa fluor 488 ロバ (抗ウサギ)Life Tech Invitrogen A212061:250
DAPI溶液(5 mg/mL)SigmaD95421:1000
<強>その他>
細胞剥離液(アキュターゼ) ギブコ A11105-01すぐに使用できる作業溶液
Rock inhibitor (RI) セレチケム Y2763210 mM/ml 最終濃度
ドルソモルフィン セレチケム S73060.125 nM/ml 最終濃度
DPBS with カルシウムおよびマグニジウム (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133
カルシウムとマグニジウムを含まないDPBSGibco 14190136すぐに使える作業溶液
ゼラチンA型シグマ G2500-100G0.10%
hESC認証基底膜マトリックス(マトリゲルGFR) コーニング 3562301 mg ストックバイアル 希釈 1:240
トリプシン 0.05%Gibco25300054
トリパンブルーGibco15250-0610.40%
塩基性フィブラブラスト成長因子 (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml 最終濃度
コラゲナーゼ ギブコ 17104-0191mg/mL 最終濃度
希釈希釈をすぐに使用できる作業溶液

参考文献

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