方法論記事

軟組織切片における薬物分布を可視化するための相関光学分光法および質量分析イメージング法

DOI：

10.3791/67383

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2025年6月20日

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、非線形光学分光法と質量分析イメージングを使用して、軟組織中の薬物の相関イメージングの方法を提示します。高解像度の皮膚イメージングと高感度の薬物検出を組み合わせることで、優れた局所製品の開発に不可欠な、皮膚内の薬物分布を研究するための貴重なアプローチが提供されます。

要約

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サブミクロンの空間分解能と光学分光法および質量分析イメージングによる高感度薬物検出を組み合わせた新しい相関イメージング法が開発され、軟組織への薬物適用時の化学分布を視覚化しました。この例では、この方法は、市販の非ステロイド性抗炎症薬製品をin vitro 局所適用した後、切除された皮膚組織で試験されています。誘導ラマン散乱、第2高調波発生、2光子蛍光顕微鏡などの非破壊光学分光法は、皮膚の構造と形態をマッピングするために最初に採用されました。その後、同じ皮膚組織サンプルを飛行時間型二次イオン質量分析法(ToF-SIMS)で分析し、最も外側の皮膚層である表皮と真皮全体でのジクロフェナクの検出感度を向上させました。画像レジストレーション法は、光学データと質量分析データを統合するために考案されました。このアプローチは、ラベルフリーの高解像度の組織構造の視覚化と高感度の化学物質検出を組み合わせたもので、皮膚や他の軟体組織における薬物分布を調査するための貴重なツールとなります。

概要

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局所的または全身的な適用後の軟体組織内での医薬品有効成分の分布の速度、程度、およびドライバーを理解することは、組織特異的な薬物の取り込み、代謝、およびクリアランスの根底にあるメカニズムを解明するために重要です(すなわち、薬物動態のより深い理解)。ここでは、非線形光学分光法と質量分析イメージングを統合した新しい相関イメージング法を提示し、同じ組織サンプル1内の局所薬物の組織構造と分布をラベルフリーで視覚化します。

ラマン分光法(RS)は、高い空間分解能と分子特異性で細胞や組織内の薬物分布をマッピングするための貴重なツールとして浮上しています2。RSは、目的のサンプルによる光3の非弾性散乱に依存しており、外部ラベルを必要とせずに、その中の分子の特徴的な振動モードによる詳細な化学的特性評価を可能にします。しかし、高解像度の画像を生成するための取得時間が長いと、感度の高い生体サンプルの完全性が損なわれる可能性があります。さらに、より深い組織層をプローブする場合、組織による光の散乱と吸収により、ラマンシグナルが減衰し、その感度がさらに制限される可能性があります。誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、パルスレーザー励起と誘導ラマン信号の検出を活用することで、従来のRSよりも大幅に進歩しています4。SRS顕微鏡は、高い空間分解能で2Dおよび3Dの迅速な画像取得を可能にし、第2高調波発生(SHG)および2光子励起蛍光(TPEF)顕微鏡と併用すると、結合組織、コラーゲン、エラスチン1,5,6,7,8,9の包括的な画像を得ることができます。.SHG顕微鏡は、サンプル内の光と非中心対称構造との相互作用に依存し、入射光の半分の波長で信号を生成する非線形光学技術です。これは、生体組織中のコラーゲンのような秩序ある構造のイメージングに特に有用です。TPEFは、2つの低エネルギー光子が同時に蛍光色素を励起し、蛍光を発する別の非線形顕微鏡法です。TPEFは、励起光が近赤外範囲にあり、生体サンプルの奥深くまで浸透するため、光損傷を抑えた深部組織イメージングを可能にします。

質量分析イメージング(MSI)は、質量分析の能力と空間情報を組み合わせた強力な分析技術であり、広範囲の分子10,11,12のラベルフリー同定を可能にします。飛行時間型二次イオン質量分析(ToF-SIMS)は、サンプル表面に高エネルギーの一次イオンを照射することで、表面から二次イオンを放出します。次に、これらの二次イオンは飛行時間型分析装置に向けて加速され、そこで質量電荷比が決定されます。この分析により、分子フラグメントと同位体変動を高い感度と分解能で同定できます。ToF-SIMSの貴重な用途は、細胞13、組織14、15、および臓器15の化学物質および生体分子の研究のための生物学的および製薬研究において実証されています。

SRSとToF-SIMSはどちらも、異なる皮膚モデルにおける薬物の分布を研究するために独立して使用されています。ただし、これらの手法を組み合わせて使用して、その補完性を活用することが最も価値があります。本研究では、光学顕微鏡(SRS、TPEF、SHG)とToF-SIMSを組み合わせ、サブミクロンの空間分解能(光学的手法による)と、ToF-SIMSによる優れた感度で検出される薬物シグナルを重ね合わせた皮膚形態の画像を取得するワークフローについて述べる。このアプローチは、市販の局所製剤(ボルタレンゲル)で治療された切除された皮膚組織におけるジクロフェナクの分布を視覚化するという困難な例に対処するために使用されています。成功の基準には、治療濃度でジクロフェナクを検出するための高い化学的感度と、皮膚構造を分解するための十分な空間分解能が含まれていました。異なる皮膚層におけるジクロフェナク含有量は、局所治療後に、テープストリッピングとそれに続く定量化16、またはオープンフロー微量灌流17のような面倒で技術的に要求の厳しい方法を通じて定量化することができるが、これらのアプローチは、製品開発段階を支援する重要な要因である個々の皮膚層における賦形剤依存性のジクロフェナクの分配、浸透、保持、および深さ分布を解明することはできない。

以下に説明する測定方法の前に、Voltaren Forteゲル(2.32%ジクロフェナクジエチルアンモニウムを含む)または対応するプラセボゲル(Haleon CH SARLから供給)をさまざまな期間(4、12、16、または24時間)皮膚表面に塗布しました。.残留製剤を除去した後、同じ皮膚サンプルでSRSおよびToF-SIMS測定を実施しました。方法論の詳細は、元の原稿1に記載されています。

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プロトコル

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倫理的声明: ヒトの皮膚サンプルは、英国エジンバラのCharles River Laboratories(CRL)によって、英国グラスゴーのTissue Solutions Ltdから取得されました。すべての匿名のサンプルは、収集国の法的および倫理的基準に準拠して取得され、ドナーまたはその近親者からの倫理的承認とインフォームドコンセントがありました。

1.皮膚切片

クライオスタットを使用して、皮膚組織の切片を生成しました。

  1. 処理したスキンディスクを-20°Cの冷凍庫から取り出し、ディスクの中心から小さなピース(~1.0cm×1.0cm)を切り取ります。
  2. 凍結した水滴の上にクライオスタットのチャックにサンプルを取り付けます。最適な切断温度(OCT)コンパウンドやその他の埋め込みメディアは使用しないでください。
  3. ブレードとサンプルの温度をそれぞれ-20°Cと-16°Cに設定します。
  4. ガラスカバースリップ(#1.5、Fisher Scientific)に厚さ30μmの切片をセクション化。
  5. SRSおよびToF-SIMSをすぐに実行するか、またはサンプルを真空パックして-80°Cで保存することもできます。
  6. 使用前に20分間乾燥させてください。

2. SRSイメージング

SRS、SHG、およびTPEF顕微鏡は、コヒーレントラマン顕微鏡を使用して行いました。2つのピコ秒レーザーパルスは、1031.2nmのストークスビームによって生成され、調整可能なポンプビームと空間的および時間的に重なり合っています。20MHzで変調されたストークスビームは、誘導されたラマン損失信号を伝送を介して検出することを容易にしました。シリコンベースの検出器とロックインアンプを組み合わせて、信号検出に使用しました。別のチャネルを使用して、第2高調波および放出された蛍光信号を収集するために、検出に光電子増倍管を使用しました。

  1. 多光子組織イメージングに適した対物レンズとコンデンサーレンズ、この場合は水浸40倍倍率レンズ(1.1 NA)と短作動距離のエアコンデンサーレンズ(0.9 NA)を取り付けます。
  2. 取り付けられた組織切片をSRS顕微鏡サンプルステージに置き、組織がコンデンサーレンズと同じ面に顕微鏡スライド上になるようにします。対物レンズを組織切片に合わせ、コンデンサーの高さを最適化します。
  3. レーザー出力を適切な値に設定して、組織に損傷を与えることなく良好な信号対雑音比を取得します。この例では、ポンプビームに約10 mW、ストークスビームに約30 mWをサンプルに適用しました。SRS測定の実際的な考慮事項については、Tsikritsis ら を参照してください4。
  4. X1ズームで290μm×290μmに対応する解像度512×512ピクセル、撮像速度400Hz、CH2ストレッチに対応する2850cm-1での線平均1で、断面全体のモザイク画像を取得します。
  5. セクション全体のモザイク画像内で、次の考慮事項を考慮して関心領域(ROI)を選択します:(i)中央に配置され、サンプル周囲の最も外側の20%を避けて、フランツ細胞装置に固定された未投与の皮膚が存在する可能性があります。(ii)同じ光学的深さレベル内で検査できるほど十分に平らである。(iii)サンプルをToF-SIMSに移す際に視覚的に識別するのに役立つ明確な構造的特徴を有すること。
  6. SRSおよびSHG/蛍光検出器について、研究全体で一貫したゲイン設定を適用し、(i)C-H伸張領域(それぞれCH3、CH2、およびオフ共振制御に対応する2945 cm-1、2850 cm-1、および2650 cm-1)で画像を取得します。(ii)指紋領域(1666 cm-1および1723 cm-1で、それぞれAmide Iおよびオフ共振制御に対応します)。(iii)適用された薬物に関連するオンおよびオフレゾナンスに対応する波数。この例では、1586 cm-1 と 1530 cm-1 で、それぞれ C=C とオフ共振に対応しています。

SRSイメージング後、すぐにサンプルをToF-SIMSセットアップに移して解析してください。

3. ToF-SIMSイメージング

飛行時間型二次イオン質量分析イメージングは、電流0.2 pAの30 keV Bi3+ 一次イオンビームを使用して行いました。

  1. 適切な取得設定を選択します。この例では、負イオン極性を使用し、デューティサイクルタイムは100ms、質量範囲はm/z 0〜900、ビーム径は5μmです。電荷補償には、5μAの20eV電子フラッドガンを使用しました。
  2. ステージマクロラスターモードで全体像を取得し、組織の寸法に応じた視野で組織切片全体をマッピングします(この例では、2.5〜3.0mm×8.5〜9.0mmを使用しました)。この全体的な画像は、小さな画像のモザイクから形成されています。この例では、各々の視野は0.5 mm x 0.5 mm(256 x 256ピクセル)で、1ピクセルあたり1本のイオンビームが照射され、イオン線量は8.18 x 108 イオン/cm2となりました。
  3. 同じ方法を使用して、適切な視野を選択することによりROIの画像をキャプチャします。この例では、1.0 mm x 0.5 mm で、1 フレームあたり 4 ショット、1 ピクセルあたり 10 フレーム、1.31 x10 11 イオン/cm2 のイオン線量に相当します。
  4. 品質管理を確実にするために、各皮膚切片を検査する直前と直後に組織ホモジネートサンプルを分析します。0.5 mm x 0.5 mm(256 x 256ピクセル)の視野を使用し、1ピクセルあたり1ショット、スキャンごとに1フレームで、合計15回のスキャンを実行します。このセットアップは、3.27 x 1010 イオン/cm2のイオン線量密度に相当します。
  5. 取得後、得られた質量スペクトルは、H-イオン、C-イオン、C2-イオン、およびC3-イオンを使用してキャリブレーションできます。
  6. データの取得と抽出は、Surface Lab 7.1 ソフトウェアを使用して実行しました。

4. MATLABを使用した画像レジストレーションとデータ解析

  1. SIMSおよびSRS画像を、非負のマトリックス因数分解を使用してそれぞれ3次元に縮小し、赤、緑、青のカラーチャネルとして視覚化します。
  2. これら 2 つの非行列因数分解画像間で一致する特徴を選択するには、Matlab 制御点選択ツール "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b and Image Processing Toolbox) を選択します。
  3. 「cp2tform」および「imtransform」機能を使用してレジストレーションを行い、SIMSデータを固定像として、光学分光データを動画像としてアフィン変換を適用します。
  4. 対象薬物のToF-SIMSデータに複数のピークが検出された場合は、これらのピークの強度を合計して、複合薬物イオン強度を作成します。
  5. 2 つのホモジネートデータセット(前後)の対応する各皮膚組織サンプルの平均合計イオンカウントを抽出します。この対応する値を使用して、各皮膚画像の薬物イオンのToF-SIMSデータの強度を正規化します。
  6. レジストレーション後、赤(CH2のSRS画像)、緑(コラーゲンのSHG画像)、青(ジクロフェナクのSIMS画像、m/z 214.04、216.04、250.02、252.02、294.01、296.01のさまざまなイオンからの信号を含む)をRGBチャンネルに割り当てて、光学分光法とSIMSデータのオーバーレイを作成します。

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結果

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図1は、特徴ベースの画像レジストレーションの結果を示しており、2つの皮膚サンプル(1つはプラセボで処理(図1a)で処理され、もう1つはボルタレンゲルで4時間(図1b)および16時間(図1c)のSRS、SHG、およびSIMSのレジストレーションオーバーレイ画像が表示されています。この画像では、ToF-SIMS測定による薬物強度シグナルの合計を青色で、脂質に富む組織構造、特に角質層(SRSを用いて2850cm-1のCH2伸張コントラストで識別)を赤で、コラーゲンに富む組織領域(SHGシグナルで識別)を緑で表しています。関心領域の高解像度画像の典型的な取得時間は、SRS画像とSIMS画像でそれぞれ最大240秒と800秒でした。ただし、これらの時間は、選択した領域のサイズとピクセル滞留時間によって異な...

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ディスカッション

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この方法により、非線形光学分光法による相関イメージングと質量分析イメージングが可能になり、サブミクロンの空間分解能と高感度で軟部組織内の薬物分布を検出できます。重要なことは、蛍光ベースの顕微鏡検査に必要な干渉する可能性のある標識を使用せずにイメージングが達成されることです。ワークフローのさらなる検証には、皮膚構造を解明するための組織切片の従来のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色が含まれ、得られたSRSおよびSIMS画像のレジストレーションを可能にしました1。皮膚の形態は、光学分光法データにクラスタリングを適用することで容易に区別でき、このノンターゲットアプローチの力が、H&E染色による従来の組織学的イメージングよりも明確に皮膚層を区別することを実証しました。新しい相関方法論により、ボルタレンゲルによる局所治療後の皮膚ジクロフェナクリザーバーの存在を証明し、その形成と成長の動態を初めて監視することができました。

ToF-SIMSは、ヒトの皮膚や再構築された表皮の...

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開示事項

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MBBは、この研究の資金提供機関であるHaleon CH SARLの従業員です。

謝辞

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この研究は、Haleon CH SARLによって資金提供されました。NABとRHGの貢献は、米国保健社会福祉省(HHS)の食品医薬品局(FDA)から、財政支援賞(1-U01-FD006533)を通じて部分的に支援されました。この作業は、英国国家測定システムのNMS/ID74およびNMS/ST18プロジェクトを通じて、英国ビジネス・エネルギー・産業戦略省から資金提供を受けました。本記事の内容は著者のものであり、必ずしもFDA/HHSまたは米国政府の公式見解や承認を表すものではありません。NABは、Analytical Chemistry Trust Fundが資金提供する2020 CAMS Fellowship Awardについて、Community for Analytical Measurement Scienceからの支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コヒーレントラマン顕微鏡 ライカマイクロシステムズhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
ヒト皮膚サンプル Tissue Solutions Ltd、グラスゴー
ライカ CM 1850 クライオスタット ライカバイオシステムズhttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/製造中止
PicoEmerald-S レーザーシステムAPE ベルリンhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

参考文献

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