方法論記事

細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価

DOI：

10.3791/67385

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2024年10月18日

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、イムノブロッティングにより細胞外小胞(EV)中のオートファゴソームマーカーLC3-IIレベルを簡潔に評価するための方法論を紹介します。EVのLC3-IIレベル、オートリソソーム形成、オメガソーム形成の解析により、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害された場合のLC3-II陽性EVの放出におけるSTX6の新たな役割が示唆されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(マクロ)オートファジーは、基本的な細胞分解経路を表しています。このプロセスでは、オートファゴソームとして知られる二重膜小胞が細胞質内容物を飲み込み、その後リソソームと融合して分解します。オートファジー関連遺伝子は、標準的な役割を超えて、炎症性分子、組織修復因子、および細胞外小胞(EV)の放出を含む分泌経路も調節します。特に、特に脳や脊髄に影響を与える神経変性疾患において、細胞間で病理学的タンパク質を播種するプロセスは、この現象を理解することの重要性を強調しています。最近の研究では、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭葉変性症の主要なプレーヤーであるtransactive response DNA-binding protein 43 kDa(TDP-43)は、オートファゴソームマーカー微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3B-II(LC3-II)が豊富なEVを介してオートファジー依存的に放出されることが示唆されています。

LC3-II陽性EVの形成と放出のメカニズムを解明するためには、LC3-II陽性小胞の細胞内および細胞外を問わず、利用可能で再現性のある評価法を確立することが不可欠です。この研究では、示差遠心分離によって得られた細胞画分およびEV画分におけるイムノブロッティングによるLC3-IIレベルを評価するための詳細なプロトコルを示しています。バフィロマイシンA1(Baf)は、オートファゴソーム-リソソーム融合の阻害剤であり、細胞内および細胞外のLC3-II陽性小胞のレベルを高めるためのポジティブコントロールとして機能します。腫瘍感受性遺伝子101(TSG101)は、多胞体のマーカーとして使用されます。このプロトコルを適用すると、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病の遺伝的危険因子であるシンタキシン-6(STX6)のsiRNA媒介ノックダウンが、Bafで処理された細胞のEV画分のLC3-IIレベルを増強する一方で、TSG101レベルに有意な影響を示さないことが実証されています。これらの知見は、STX6が、特にオートファゴソーム-リソソーム融合が損なわれている条件下で、EVを介したLC3-IIの細胞外放出を負に制御する可能性があることを示唆しています。このプロトコールは、オートファジーを評価するための確立された方法と組み合わせることで、LC3-II陽性EVの形成と放出における特定の分子の役割に関する貴重な洞察を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

トランス活性化応答DNA結合タンパク質43(TDP-43)は、細胞の生存に不可欠なエクソンスプライシング、遺伝子転写、およびmRNAの安定性の調節に関与する、広く発現する不均一な核リボ核タンパク質です1,2。筋萎縮性側索硬化症(ALS)や前頭側頭葉変性症(FTLD)などの神経変性疾患では、核タンパク質TDP-43が細胞質に異常に蓄積します。このシフトにより、核内のTDP-43機能が失われ、細胞質内で毒性のある機能獲得が起こります。TDP-43の病理学的蓄積は、脳と脊髄の特定の領域で始まり、プリオン様でこれらの領域に広がり、疾患の進行と密接に関連するプロセスです3。しかし、TDP-43の病状が脳や脊髄に広がる正確なメカニズムは不明のままです。

TDP-43は細胞外小胞(EV)を通じて分泌され、ALSおよびFTLD-TDP患者の血漿および脳脊髄液(CSF)ではTDP-43の高レベルが検出されます4,5,6。ALSおよびFTLDと診断された患者からのCSFは、ヒト神経膠腫細胞における内因性TDP-43の細胞内局在の誤局在と凝集を誘導します7。したがって、EVを介して細胞外に放出されるTDP-43は、TDP-43の病理の細胞間拡散を媒介する可能性があります。

オートファジーは、LC3によってマークされるオートファゴソームとして知られる二重膜小胞内に不要な物質を囲い込む、保存状態の良い細胞分解メカニズムです。これらのオートファゴソームは、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)陽性リソソームと融合してオートリソソーム(LC3+/LAMP1+)を形成し、内容物の分解につながる8。組織学的解析では、封入体を飲み込むオートファゴソームが散発性ALS患者のニューロンに蓄積することが示されている9。家族性ALSおよびFTLD-TDPの原因遺伝子の中には、オートファジーの制御と関連しているものがあります10,11,12。これらの知見は、ALSおよびFTLD-TDP患者においてオートファジーが抑制されることを示唆しています。

これまでの研究では、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害されると、オートファゴソームマーカーLC3-II陽性のEVを介してTDP-43が分泌されることが示された13。オートファジー-リソソーム経路の調節不全は、TDP-43の細胞内蓄積だけでなく、EVを介したTDP-43の細胞外放出も引き起こす可能性がある14。しかし、LC3-II陽性のEVがどのように放出され、これがTDP-43の病状の広がりにどれほど重要であるかは不明のままです。

EVは、細胞表面の出芽から作製する大型EV(直径100〜1000nm)と、エンドソーム膜がエンドソーム(エクソソーム)やゴルジ体内へ出芽して作製する小型EV(直径50〜150nm)に分類されます。大型EVと小型EVを別々に回収するために、逐次遠心分離を行い、それぞれ20,000 × g と110,000 × gで遠心分離によりペレットを回収します。大型EVを回収するためにP1 EV画分(20,000 × g ペレット)を、小型EVを回収するためにP2 EV画分(110,000 × g ペレット)を調製する15。イムノブロッティングによる逐次遠心分離から得られた大型および小型EVのLC3-IIレベルを評価する方法論は安定しており、再現性があります16。EVのLC3-IIレベルの解析に加えて、オートリソソームとオメガソームの形成を解析することで、オートファジーの調節不全がLC3-II陽性EVの放出にどのようにつながるかについての理解が深まります。本研究では、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害された場合にLC3-II陽性EVが放出される際に、輸送小胞の標的膜への移動を促進するSNAREタンパク質であるシンタキシン6(STX6)が抑制的な役割を果たしていることを示している17。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HeLa細胞の培養培地からの細胞、P1、P2 EV画分の調製

  1. HeLa細胞培養培地からのP1およびP2 EV画分の調製
    1. 1日目
      1. セルカウンターを使用して細胞をカウントし、DMEM高グルコース、10%FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンで構成される培地を含む6cmプレート上に1×106 細胞を播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
    2. 2日目(オプション)
      1. 20 μM siRNA溶液を調製します。
      2. 100 μLの還元血清培地と3 μLのsiRNAを低保持チューブで混合し、 溶液Aを調製します。
      3. 100 μLの還元血清培地と5 μLのトランスフェクション試薬を低保持チューブで混合し、 溶液Bを調製します。
      4. 溶液Aと溶液Bを混合し、室温(RT)で5分間インキュベートします。
      5. 溶液AとBの混合物をHeLa細胞の培養に用いる培地に加えます。細胞を37°Cで5%CO2と制御された湿度で24時間インキュベートします。
    3. 3日目
      1. 細胞をPBSで洗浄し、500 μLの0.25%トリプシンと1 mM EDTA溶液、37°C、5% CO2 、湿度制御済み溶液に5分間さらします。
      2. 2.5 mLの培地を細胞に加え、200 μLのピペットチップが取り付けられたパスツールトランスファーピペットを使用して、シングルセル懸濁液を調製します。
      3. セルカウンターを使用して細胞をカウントし、10cmプレートに1×10個の6 個の細胞を播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
        注:イムノブロッティング分析に必要な培地からEVを収集するためには、少なくとも1×106 細胞を調製する必要があります。
    4. 4日目
      1. ビヒクル(DMSO)または100 nM Bafilomycin A1(Baf)のいずれかを含む培地(ステップ1.1.1.1を参照)を調製します。
      2. 細胞をビヒクルまたは100 nM Bafを含む培地にさらし、5% CO2 で37°Cで24時間湿度を制御してインキュベートします。
    5. 5日目
      1. 10cmプレートからすべての培地を回収し、15mLチューブに移し、3,000 × g で4°Cで10分間遠心分離して細胞破片を除去します。
        注:10cmプレートの残りのセルは、セクション1.2.1で使用されます。
      2. P1 EV画分の単離には、3,000 × g の遠心分離後に上清を遠心チューブに移し、20,000 × g の4°Cで1時間遠心分離します。
      3. P2 EV画分の単離には、20,000 × g の遠心分離後に上清を超遠心チューブに移し、110,000 × g で4°Cで1時間遠心分離します。
      4. ラボ用ワイプでチューブ内の余分な水分を拭き取った後、遠心分離チューブ内の残りのペレットを50 μLの2倍サンプルバッファー[2.5% SDS、125 mM Tris-HClバッファー(pH 6.8)、30%グリセロール、10% 2-メルカプトエタノール、0.4% ブロモフェノールブルー]に再懸濁して、P1 EV画分を調製します。
      5. 上清をデカンテーションして除去し、チューブ内の余分な水分をラボ用ワイプで拭き取り、超遠心チューブ内の残りのペレットを50 μLの2xサンプルバッファーに再懸濁して、P2 EV画分を調製します。
      6. P1およびP2 EVフラクションを100°Cのヒートブロックで10分間インキュベートします。
        注:20,000 × g および110,000 ×gで遠心分離した後は、残りのペレットを誤って廃棄 しないように、チューブ を振らないでください。チューブを傾けて上清を移した後、ペレットが残りの上澄みに再び浸らないように、チューブの位置を維持します。
  2. 培養HeLa細胞からの細胞分画の調製
    1. 5日目
      1. 10 cmプレートから15 mLチューブに培地を移した後、10 cm皿の細胞をPBSで洗浄し、2 mLの0.25%トリプシンと1 mM EDTA溶液に5% CO2 で37°C、湿度を制御した5分間さらします。
      2. 8 mLの増殖培地を細胞に加え、200 μLのピペットチップが付いたパスツールトランスファーピペットを使用して細胞をピペットし、シングルセル懸濁液を調製します。
      3. 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
      4. 吸引器で上清を除去し、細胞ペレットにPBSを添加し、次いで1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離する。
      5. 吸引器を使用してPBSを除去し、1%サルコシルを含むA68バッファー[10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5、0.8 M NaCl、1 mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N、N-四酢酸(EGTA)]で細胞ペレットを超音波処理します。
      6. BCAタンパク質アッセイキットを使用して、細胞ライセートのタンパク質濃度を測定します。
      7. 300 μLの細胞ライセートを100 μLの4倍サンプルバッファーと混合し、混合物を100°Cでヒートブロック上で10分間インキュベートして、細胞画分を調製します。

2. イムノブロッティング解析

  1. サンプル中の等量のタンパク質をSDS-PAGE18で分離します。
  2. 分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
  3. 移載後、ブロッキング剤でメンブレンを20分間ブロッキングします。
  4. ブロックされたメンブレンを、RTで10%(v/v)のウシ血清を含むTrisバッファー中の示された一次抗体と一晩インキュベートします。
  5. メンブレンをTrisバッファーで5秒間洗浄した後、ビオチン標識二次抗体と室温で2時間インキュベートします。
  6. メンブレンをTrisバッファーで5秒間洗浄した後、0.4%(v/v)溶液Aおよびキットの溶液Bを含むTrisバッファーとRTで1時間インキュベートします。
  7. メンブレンをPBSで洗浄し、0.04%(w / v)ジアミノベンジジン、0.8%(w / v)NiCl2·6H2O、および0.3%(v / v)H2O2 を含むPBSとインキュベートして、バンドの比色検出を行います。
    注:シグナルの検出には、化学発光法も許容されます。
  8. スキャナーでメンブレンの画像をデジタル化し、フィジーを使用してデンシトメトリー分析を行います。
    1. フィジーを使用してデジタル化された画像を開き、[ 画像] |タイプ |8 ビット。
    2. 長方形ツールをクリックし、長方形をドラッグしてバンドを囲むように長方形のサイズを調整します。解析するバンドを特定するには、[解析] |ゲル |[最初のレーン] を選択します。
    3. 長方形を 2 番目以降のバンドに配置し、[ 分析] |ゲル |[Next Lane] を選択します。
    4. 最終的なバンドを認識したら、[解析] |ゲル |プロット レーン。
    5. バンドの信号領域を直線で囲み、 ワンドツールをクリックし、領域内をクリックしてバンドの信号強度を計算します。

3. オートファゴソームとオートリソソームの数の解析

  1. 1日目
    1. セルカウンターでHeLa細胞の数をカウントし、LAMP1-GFPおよびmCherry-LC3を発現する5 ×5個のHeLa細胞を3.5cmの皿に播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
  2. 2日目(オプション)
    1. セクション1.1.2で説明されている手順を3.5cmの皿で実行します。
  3. 3日目
    1. 3.5cmの皿から培地を捨てます。
    2. 細胞をPBSで洗浄し、400 μLの0.25%トリプシンと1 mM EDTA溶液に曝露し、5% CO2 で37°Cで5分間インキュベートします。
    3. 1.6 mLの増殖培地を細胞に加え、パスツールトランスファーピペットでピペットでピペットして、単一細胞懸濁液を調製します。
    4. セルカウンターを使用してセルの数を数え、8チャンバーのカバースリップに1×10個の4 個のセルをシードします。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
      注:チャンバー付きカバースリップの2つのウェルは、セクション3.4.2に記載されているDMSOまたはBaf処理後に、それぞれコントロール細胞およびSTX6ノックダウン細胞用に調製されます。
  4. 4日目
    1. ビヒクル(DMSO)またはDMSOに溶解した100 nM Bafのいずれかを含むフェノールレッドを含まない増殖培地(フェノールレッドを含まないDMEM、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を調製します。
    2. 培地をフェノールレッドを含まない、ビヒクルまたは100 nM Bafのいずれかを含む培地と交換し、4時間インキュベートします。
      注:オートファゴソームおよびオートリソソーム数に対するBafの影響を評価するには、ビヒクル処理された細胞をコントロールとして調製します。
    3. 観察前に、0.33 μg/mL Hoechst 33342で核を30分間染色します。
    4. 共焦点レーザー顕微鏡で60倍対物レンズを使用してライブセルイメージングを行い、10種類のフレームをキャプチャーします。
      1. RGBマージされた画像をフィジーで開き、[ 画像]|カラー |チャンネルを分割します。
      2. 各イメージの赤信号と緑信号に 一定のしきい値 を設定するには、[ イメージ] |調整 | 各実験のしきい値。
      3. 赤または緑の信号が正の領域の数をカウントするには、[ 解析] |パーティクルを解析します。 [集計 ] ボックスをオンにし、[ OK] をクリックします。 Count の値を記録して、オートファゴソームおよびリソソームに関連する小胞を特定します。
      4. 緑の画像に赤の画像を重ねるには、[ 編集] |貼り付けコントロール。緑の画像をコピーしてから、赤の画像に貼り付けて結合し、赤と緑の信号の両方に正の領域を強調表示します。
      5. オートリソソーム数を特定するには、赤と緑の両方の信号に陽性の領域の数をカウントします 。パーティクルを解析します。 「Summarize 」ボックスをオンにして 「OK」をクリックし、「 Count 」セクションに値を記録して、オートファゴソームとリソソームに関連付けられた小胞を特定します。
    5. オートリソソームとオートファゴソームの総数を細胞の総数で割って、細胞あたりのオートリソソームとオートファゴソームの数を計算します。
      注:3つの独立した実験のそれぞれで少なくとも35個の細胞を数えます。

4. オメガソーム形成の解析

  1. 1日目
    1. セルカウンターでHeLa細胞の数を数え、3.5cmの皿に1個×10個の5 個の細胞を播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
  2. 2日目(オプション)
    1. セクション 1.1.2 で説明されている手順を実行します。
  3. 3日目
    1. ステップ3.3.1-3.3.2の説明に従って、シングルセル懸濁液を調製します。
    2. セルカウンターで細胞を数え、3.5cmの皿に1個×10個の5 個の細胞を播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
  4. 4日目
    1. 1 μgのpEGFP-C1-hAtg13、3 μLのDNAトランスフェクション試薬、および100 μLの還元血清培地を低保持チューブで混合します。混合物を20分間インキュベートし、次にそれを培養培地に加えます。
    2. 細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
  5. 5日目
    1. ステップ3.3.1-3.3.2で説明されているように、細胞をトリプシン化します。
    2. 2.5 mLの増殖培地を細胞に加えます。パスツールトランスファーピペットを使用して混合物をピペットでピペットし、単一細胞懸濁液を調製します。
    3. セルカウンターを使用して細胞をカウントし、8チャンバーのカバースリップに1×10個の4 個の細胞を播種します。細胞を37°Cで5%CO2 と制御された湿度で24時間インキュベートします。
  6. 6日目
    1. ステップ3.4.1-3.4.4に従って、共焦点レーザー顕微鏡を使用してステップ4.5.3の細胞のライブセルイメージングを行います。10 フレームの異なる画像をキャプチャします。
      1. 手順3.4.4.1〜3.4.4.3に従って、RGBマージされた画像をそれぞれの赤、緑、青の画像コンポーネントに分割し、各画像の緑の信号に一定のしきい値を設定し、GFP信号強度を決定します。 Total Area セクションの値を記録して、GFP-ATG13の信号強度を決定します。
      2. 総シグナル強度を調査したセル数で割って、セルあたりのシグナル強度を計算します。
        注:3つの独立した実験のそれぞれで少なくとも34個の細胞を数えます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先行研究で示されたように、Baf処理は、EVリッチ画分においてTSG101(P1:P < 0.01、P2:P = 0.012、EZR19の二元配置ANOVAにより決定)およびLC3-II(P1:P < 0.01、P2:P < 0.01、EZR19の二元配置分散分析によって決定)のレベルを増加させました。特に、Baf処理により、EV分画中のSTX6(P1:P < 0.01、P2:P < 0.01、EZR19の二元配置ANOVAで決定)のレベルも上昇し(図1A)、STX6がEVの成分である可能性が示唆されています。増殖性細胞核抗原(PCNA)は、EV画分では観察されませんでした。細胞画分中のSTX6のイムノブロッティングにより、STX6のレベルはsiRNAノックダウンとともに半分に減少することが明らかになりました(図1B)。 STX6 ノックダウンは、ビヒクル処理条件とBaf処理条件の両方で、細胞画分とEV画分のTSG101レベルに影響を与えませんでした(図1C)。しかし、 STX6 ノックダウンは、ビヒクル処理条件下では細胞画分のLC3-IIレベルを増加させましたが、Baf処理条件下では増加しませんでした。 STX6 ノックダウンは、Baf処理条件下でEV画分のLC3-IIレベルも増加させました(図1D)。これらの知見は、イムノブロッティングによりEV中のLC3-IIを検出する方法が、ノックダウン効率がそれほど高くなくても十分に感度が高いことを示唆しています。さらに、これらの結果は、 STX6 ノックダウンがBaf処理下で細胞内オートファゴソーム数を増加させ、オートファゴソーム関連小胞の細胞外放出を増強することを示しています。

STX6のノックダウンが細胞内オートファゴソームとオートリソソーム数に影響を与えるかどうかをさらに調べるために、オートファゴソームマーカーmCherry-LC3とリソソームマーカーLAMP1-GFPを使用してオートファゴソームとリソソームを可視化しました。共焦点生細胞イメージングにより、LAMP1-GFPおよびmCherry-LC3を発現するHeLa細胞にGFP陽性およびmCherry陽性の小胞が明らかになりました(図2A)。オートリソソームはGFP陽性小胞およびmCherry陽性小胞として同定され、オートファゴソームはGFP陰性およびmCherry陽性小胞として同定されました。STX6ノックダウンは、ビヒクル処理条件下でオートファゴソームおよびオートリソソームの数を増加させた(図2B、C)。しかし、STX6のノックダウンは、Baf処理条件下ではオートファゴソームおよびオートリソソーム数に影響を与えませんでした(図2B、C)。

STX6のノックダウンによる細胞内オートファゴソーム数の増加がオートファゴソーム形成の亢進によるものかどうかを判断するために、オートファゴソーム形成に必要なプロセスであるオメガソーム形成を、オメガソームマーカーGFP-ATG13シグナル強度を用いて検討しました。共焦点ライブセルイメージングは、GFP-ATG13のアセンブル画像を提供し、オメガソーム形成を示しました(図3A)。STX6ノックダウンはGFP-ATG13の信号強度を減少させました(P = 0.023、EZR19の二元配置ANOVAで決定)。STX6ノックダウンは、ビヒクル処理条件下ではGFP-ATG13信号強度に有意な影響を与えませんでしたが、Baf処理条件下では信号を大幅に減少させました(図3B)。まとめると、これらの知見は、STX6ノックダウンがオートファゴソーム関連小胞の蓄積に関連するLC3-II陽性小胞の放出を増加させることを示しています。

figure-results-1
図1:ビヒクルまたはBaf処理下でコントロールまたはSTX6 siRNAをトランスフェクションしたHeLa細胞の細胞、P1、およびP2フラクションの免疫ブロッティング結果。 HeLa細胞をビヒクル(DMSO)または100 nM Bafで、コントロールまたは STX6 siRNAによるトランスフェクション後24時間処理しました。細胞、P1(20,000 × g ペレット)、およびP2(110,000 × g ペレット)画分を単離しました。(A)STX6、TSG101、LC3、およびPCNAを示す各画分の代表的なイムノブロッティング画像。(B-D)イムノブロット画像から、(B)STX6、(C)TSG101、(D)LC3-IIのデンシトメトリー分析を行いました。シグナル強度は、ビヒクルまたはBafで処理したコントロール細胞または STX6 siRNAトランスフェクション細胞に対して正規化しました。棒グラフは、S.E.M. (N = 3) ±平均値を表します。*は、Excelの両側非対応 t検定によるP<0.05を示します。略語: STX6 = syntaxin 6;Baf =バフィロマイシンA1;DMSO = ジメチルスルホキシド; TSG101 = 腫瘍感受性遺伝子 101;LC3 = 微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B;PCNA = 増殖性細胞核抗原;S.E.M. = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:コントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクトしたLamp1-GFPおよびmCherry-LC3を共発現するHeLa細胞のビヒクルおよびBaf処理条件下での共焦点画像解析。 (A)LAMP1-GFPとmCherry-LC3を安定的に発現するHeLa細胞の共焦点像をコントロールまたは STX6 siRNAで48時間トランスフェクションした後、DMSOまたは400 nM Bafに4時間曝露しました。スケールバー = 20 μm. (B,C) (B) オートファゴソーム (LAMP1-GFP ネガティブおよび mCherry-LC3 ポジティブドット) および (C) オートリソソーム (LAMP1-GFP および mCherry-LC3 ダブルポジティブドット) の定量化をフィジーのソフトウェアを使用して行いました。棒グラフのデータは、S.E.M. (N = 3) ±平均値として表示されます。* は P < 0.05 を示し、Excel の両側の不対応 t 検定に基づきます。略語:Lamp1 =リソソーム関連膜タンパク質1;LC3 = 微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B;STX6 = 構文6;Baf =バフィロマイシンA1;GFP = 緑色蛍光タンパク質;S.E.M. = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:GFP-ATG13を発現するHeLa細胞にコントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクションし、ビヒクルまたはBaf処理を施した共焦点イメージング。 (A)HeLa細胞にコントロールまたは STX6 siRNAをトランスフェクションした後、pEGFP-C1-hAtg13トランスフェクションを行い、DMSOまたは400 nM Bafで4時間処理しました。(B)相対的なシグナル強度は、各条件のシグナルをBafで処理したコントロールsiRNAトランスフェクト細胞のシグナルに標準化することによって決定した。棒グラフは、データを平均± S.E.M. (N = 3) として示しています。*は、Excelの両側非対応 t検定によるP<0.05を示します。略語: hAtg13 =ヒトオートファジー関連遺伝子13;STX6 = 構文6;Baf =バフィロマイシンA1;DMSO = ジメチルスルホキシド;S.E.M. = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:コントロールsiRNAをトランスフェクトし、Bafで処理したHeLa細胞の細胞、P1、およびP2フラクションのイムノブロット解析。 HeLa細胞にコントロールsiRNAをトランスフェクションし、100 nM Bafに24時間曝露しました。次に、細胞、P1(20,000 × g ペレット)、およびP2(110,000 × g ペレット)の画分を調製しました。ULK1とPCNAの代表的なイムノブロット画像で、比較のために各画分でそれらのレベルを示しています。略語:Baf = bafilomycin A1;ULK1 = unc-51様オートファジー活性化キナーゼ1;PCNA = 増殖細胞核抗原。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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イムノブロッティング試験では、細胞画分、マイクロベシクルリッチP1 EV画分、およびエクソソームリッチP2 EV画分におけるLC3-IIおよびTSG101のレベルが明らかになりました。生細胞イメージングを使用してオートファゴソーム、オートリソソーム、オメガソームを調べ、 STX6 ノックダウンがオートファジーに影響を与えるかどうかについての洞察が得られました。これらの結果から、 STX6 のノックダウンがLC3-II陽性のEVの放出に影響を及ぼし、オートファジー経路の調節不全に関連している可能性があることが示唆されています。この方法の主な利点は、異なる供給元から発生した大型EVと小型EVを区別できることです。微小胞、エクソソーム、またはゴルジ装置の特異的マーカーを用いたフローサイトメトリー解析により、 STX6 ノックダウンがLC3-II陽性小胞の放出にどのように影響するかがさらに明らかになるかもしれません。

しかし、イムノブロッティング研究の限界は、Baf処理下での STX6 ノックダウン後のEV画分のLC3-IIレベルの観察された増加が、放出されるLC3-II陽性小胞の数の増加によるものなのか、それともEVあたりのLC3-IIレベルの増加によるものなのかが不明のままであることです。これらの可能性を区別するために、ナノ粒子追跡分析またはフローサイトメトリー分析を使用して小胞をカウントすると、LC3-II陽性小胞の数が増加しているかどうか、または小胞あたりのLC3-IIレベルが上昇しているかどうかを判断するのに役立つ場合があります。

プロトコールの重要なステップは、EVフラクションを調製するための培地の分画です。EVは、遠心分離管内の小さなペレットとして観察されます。同等のEV画分を調製するには、EVペレットのタンパク質濃度が希釈されないように、遠心分離後に上清を慎重に移すか廃棄することが重要です。細胞画分からEV画分への汚染を調べるために、細胞質タンパク質、unc-51様オートファジー活性化キナーゼ1(ULK1)、および核タンパク質、PCNAのレベルをこの研究の画分間で比較しました(補足図S1)。細胞画分のタンパク質濃度は一般に細胞数を反映するが、細胞タンパク質濃度は細胞周期のステージ20 またはプロテオスタシスの障害21に影響される。オートファジーは、タンパク質stasisの維持に不可欠です22。 STX6 ノックダウンまたはBaf処理によるオートファジーの調節不全は、細胞数に関係なくタンパク質濃度を変化させる可能性があります。

STX6 のノックダウンはsiRNAトランスフェクションによって達成され、GFP-ATG13の過剰発現はDNAトランスフェクションによって達成されます。トランスフェクション効率は、細胞の種類、密度、および数に影響されます。siRNA配列の効率的なアラインメントもノックダウン効率に影響を与える可能性があります。トランスフェクション効率が低い場合は調整が必要です。

本結果は、 STX6 ノックダウンがBaf処理条件下でEV画分中のオートファゴソームマーカーLC3-IIのレベルを増加させたが、TSG101のレベルに影響を与えなかったことを示している。このことから、STX6は、オートファゴソームとリソソームの融合が阻害されると、オートファゴソーム由来の小胞の放出を抑制するが、MVB由来の小胞の放出は抑制しないことが示唆されます。

また、STX6 のノックダウンは、増殖条件下での細胞LC3-IIレベルを増加させ、STX6がオートファジーを制御していることを示唆しています。実際、 STX6 のノックダウンはオートファゴソームとオートリソソームの数を増加させましたが、オメガソームの形成を促進しませんでした。オートリソソームの成熟はオートファジー性リソソームの改質を引き起こす23。STX6がオートリソソームの成熟過程を媒介し、その機能喪失により未成熟なオートリソソームが増加し、オートファジー性リソソームのリフォームが抑制されることでオートファゴソーム-リソソーム融合の調節不全につながる可能性があります。

Baf処理は、その発現がダウンレギュレーションされた場合でも、EV画分のSTX6レベルを増加させました。以前の研究では、リソソーム機能が阻害されると、オートファゴソーム関連小胞がEVとして放出されることが示唆されていました13,14。STX6は、A群連鎖球菌(GAS)を含むオートファゴソーム様液胞などのオートファゴソーム関連小胞に局在することが知られている24。したがって、STX6は、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害されるとEVとして放出されるオートファゴソーム関連小胞に局在している可能性があります。

TDP-43の病理の広がりは、ALSおよびFTLD-TDPの進行と密接に関連しています3。TDP-43の病理が脳や脊髄にどのように広がるかは不明ですが、EV経路がその広がりを媒介している可能性があります。以前の研究では、オートファジー-リソソーム経路の調節不全がTDP-43を含むLC3-II陽性EVの放出につながることが示されています13。本研究は、オートファゴソーム-リソソーム融合が阻害された場合のEV放出の制御におけるSTX6の役割を示唆しています。イムノブロッティングにより細胞内およびEV画分のLC3-IIレベルを評価する方法論は、今後の研究に役立つはずです。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、この記事の内容と利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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本研究は、日本学術振興会科研費[課題番号23K06837](東京)および武田科学振興財団(大阪)からのY.T.の資金提供を受けて行われました。著者らは、HeLa細胞を提供してくださったDavid C. Rubinsztein博士(ケンブリッジ医学研究所、ケンブリッジ、英国)に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25 % トリプシン EDTA富士フイルム 和光201-16945
10 cm ディッシュサーモフィッシャー サイエンティフィック150464
15 mL チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック339650
200 μL ピペットチップ日本ジェネティクスFG-301ピペッティング
2-メルカプトエタノールナカライ テスク21417-52><試料緩衝液
3,3'-ジアミノベンジジン 四塩酸塩ナカライ テスク11009-41DAB液
3.5cm皿用材料 サーモフィッシャーサイエンティフィック150460
6 cm ディッシュ TrueLineTR4001
アルミブロックサーモスタットバス(乾式温浴)EYELA273860
吸引器SANSYOSAP-102吸入液
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
ビオチン標識ヤギ 抗ウサギ IgG 抗体ベクター研究室 BA-10002nd 抗体 イムノブロッティング用
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody Vector Laboratories BA-20002nd antibody for immunoblotting
Blocking OneNacalai Tesque03953-95a material for immunoblotting
ブロモフェノールブルーNacalai Tesque05808-61a material for
sample buffer solution
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
遠心分離機 5702 Rエッペンドルフ5703000039
計数スライド デュアルチャンバーバイオ・ラッド1450015J細胞計数
デジタル Sonifier 450ブランソン
ジメチル スルホキシドnacalai tasque09659-14車両
DMEM 高グルコースNacalai Tesque08458-45培養培地
DMEM フェノールレッドなしナカライテスク08489-45培地
EGTA同人堂 348-01311A68ソリューションの材料
Excelマイクロソフトバージョン 16.16.27風刺的分析
EZRリファレンス No. 24バージョン 1.68風刺的分析
FBSシグマ173012培地
フィジーNIH画像分析ツール
グリセロールナカライ テスク09886-05
サンプル緩衝液
Hoehst33342同人堂の材料 H342
過酸化水素富士フイルム 和光080-0186DAB溶液用材料
キムワイプ S-200日本製紙 クレシア62011クリーニングワイプ
ローリテンションチューブ日本ジェネティクスFG-MCT015CLBsiRNAおよびDNAトランスフェクション
LSM780 共焦点レーザー顕微鏡カールツァイス
モノクローナルマウス アンチ-LC3抗体MBLM186-31st immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate富士フイルム 和光149-01041DAB溶液材料
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩Nacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 超遠心分離機Beckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo FisherScientific31985-070siRNAおよびDNAトランスフェクション
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
ペニシリン/ストレプトマイシンNacalai Tesque26253-84培地
Pierce BCA Protein Assay Kitsサーモフィッシャーサイエンティフィック23225
ポリクローナルウサギ抗PCNA抗体BioAcademia70-0801st 抗体イムノブロッティング
ポリクローナルウサギ 抗シンタキシン 6 抗体プロテインテック10841-1-APイムノブロッティング用第1抗体
ポリクローナルウサギ 抗TSG101抗体プロテインテック28283-1-APイムノブロッティング用第1抗体
ポリクローナルウサギ 抗ULK1抗体プロテインテック20986-1-APイムノブロッティング用第1抗体
ポリフッ化ビニリデンメンブレンミリオーレIPVH00010免疫ブロッティング用材料
RR 開発コアチームバージョン 4.4.1サティスティカル解析
RNAiMAXサーモフィッシャーサイエンティフィック13778siRNA トランスフェクション試薬
siRNA STX6サーモフィッシャーサイエンティフィックHSS115604トランスフェクション用 siRNA
塩化ナトリウムナカライ テスク31320-05Tris
buffer and A68
Dodecyl Sulfate NadiumFujifilm Wako192-13981a material for
sample buffer solution
SPARK Microplate ReaderTECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300siRNA transfection
スクロース富士フイルム 和光193-00025A68溶液
用材料 TC20 サーマルプリンター付き自動セルカウンターBio-Rad1450109J1細胞計数
サーモバス東京 リカキカイMG-3100インキュベーション
TransIT-293Mirus BioMIR 2700DNA トランスフェクション試薬
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300DNA トランスフェクション試薬
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンNacalai Tesque35406-75トリスバッファー、サンプルバッファー、A68溶液
トリパンブルー染料 0.40%Bio-Rad1450021細胞計数用
材料 ウルトラクリアオープントップチューブ、16 x 96mm ベックマン・コールター361706P1 EVフラクション
ウルトラクリアチューブの収集、14 x 89mmベックマン・コールター344059P2 EVフラクション
クタステインABCスタンダードキットVector Laboratories PK-4000immunoblotting
洗浄ボトル1-4640-02洗浄膜
μ-スライド 8 ウェル高ibidi80806
solution ベの収集

参考文献

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TDP 43 A1 siRNA Syntaxin 6

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