非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、真菌病原体を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー(CAR-NK)細胞を産生するためのトランスフェクションプロトコルの概要を説明します。抗原特異的な活性化を評価するために、改変された細胞を Aspergillus fumigatus 胚芽管と共培養し、IFN-γ分泌を測定しました。
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方法論記事
非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング
この記事について
サマリー
要約
キメラ抗原受容体(CAR)ベースの細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において印象的な有効性を示しています。近年、感染症に対する治療法の開発が進められていますが、真菌感染症を対象とした研究は未だに少ないのが現状です。最適な標的を特定し、細胞産物を最適化するために、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー(CAR-NK)細胞を改変する方法を開発し、真菌による刺激に対する応答を評価しました。この論文では、非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、真菌標的に合わせたCAR-NK細胞を作製するための簡単で堅牢な方法について説明します。NK-92細胞に、ミニサークルDNA(MC)としてベクター化された高活性トランスポゼースSB100XとプラスミドコードCARトランスポゾンをトランスフェクションします。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリー解析を使用して1週間後に評価されます。機能試験に先立ち、導入遺伝子を発現する細胞を磁気活性化細胞選別を用いて濃縮し、さらに1週間培養します。抗原特異的活性化を評価するために、改変された細胞を Aspergillus fumigatus 生殖管と少なくとも6時間共培養します。続いて、分泌されたインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイを用いて測定します。
概要
Aspergillus fumigatus(A.fumigatus)は、平均的な人が毎日100〜1,000の分生子を吸い込んでいる遍在する真菌です1。化学療法を受けている患者や白血病に苦しんでいる患者など、後天性または先天性免疫不全の患者では、A. fumigatusは重度の侵襲性アプセルギルス症を引き起こす可能性があります。毎年、世界中で20万人以上がアスペルギルス症に罹患しています。アゾール誘導体による予防と治療に抗真菌薬を使用しているにもかかわらず、死亡率は30%から95%の間にとどまっています2,3。さらに、この治療法には重大な副作用があり、A. fumigatusの培養物の7%がすでにアゾール耐性を持っています4。
キメラ抗原受容体(CAR)操作T細胞による治療は、悪性疾患の治療において臨床的に成功し、侵襲性アスペルギルス症などの感染症との闘いにおいて有望な前臨床結果を達成しました5,6,7,8。
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プロトコル
ここで説明するすべての実験は、無菌条件下で行う必要があります。このプロトコルでは、(I)コントロールとして機能するDNAを使用しない模擬トランスフェクションと、(II)前述のAf-CAR6を使用したCARトランスフェクションの2つの条件を示します。Af-CARプラスミドには、CARの下流に切断された上皮成長因子受容体(EGFRt)配列が含まれており、トランスフェクションマーカーとして使用されます(補足図S1)。各条件について、4個×10個の6 個のNK-92細胞が必要です。
1. NK-92細胞の培養
- トランスフェクションの1日または2日前に、次の組成で新鮮な細胞培養培地を準備します:75%(v / v)α-MEM培地(ヌクレオシドを含む)+ 12.5%(v / v)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)+ 12.5%(v / v)熱不活化ウマ血清+ 2 mM L-グルタミン。
- 少なくとも10個の7 NK-92細胞を5 × 105 細胞/mLの細胞密度で再懸濁します。
- IL-2を150 UI/mLの濃度で細胞懸濁液に添加します。
- 加湿インキュベーターで細胞....
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結果
Af-CAR NK-92細胞の作製には、トランスフェクション、回収、濃縮、増殖など、約14日かかります。トランスフェクション後、細胞は2日おきに培養され、分裂します。トランスフェクション後2日で最初の分裂中に細胞生存率が低下する可能性があります。通常、細胞はトランスフェクションの4日後に回復し、48時間の倍増時間で増殖を開始します。
回復後、トランスフェクション効率を測定し、10〜20%に達すると予想しています( 代表的な結果を図3に示します)。MACSを介してEGFR陽性細胞を濃縮すると、Af-CAR NK-92細胞の割合が95%以上に増加します( 代表的な結果を図4に示す)。
95%を超えるAf-CAR細胞を含む培養物を機能アッセイに使用しました。ここでは、 A. fumigatus 生殖管と細胞を6時間共培養し、活性化マーカーとしてIFN-ɣ分泌を測定しました。
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ディスカッション
提供されたプロトコールは、非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して真菌病原体を標的とするCAR-NK細胞を作製するためのシンプルで信頼性の高い方法を提供します。この方法は、大きな導入遺伝子の安定的かつ恒久的な挿入を可能にし、これにより、細胞の増殖がさらなる分析に必要な量を得ることを可能にする14,16。
トランスフェクションの成功には、細胞数と生存率、パルス強度と持続時間、DNAの質と量など、いくつかの重要な要因が影響します17。開始する前に細胞の健康状態を評価し、少なくとも90%の生存率を確保することが重要です。パルス強度を上昇させると、細胞集団のトランスフェクション効率が向上することが実証されています。しかし、このアプローチでは、細胞の生存率が大幅に低下する可能性もあります。細胞が過剰で、DNAの量または質が限ら.......
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開示事項
M.H.:CAR技術に関連する特許出願および付与された特許に関する発明者で、一部は業界にライセンス供与されています。WürzburgのT-CURX GmbHの共同創設者兼株式所有者。スピーカーの謝礼:BMS、ヤンセン、カイト/ギリアド、ノバルティス。研究支援:BMS.M.B.は、製薬会社「イーライリリーとその会社」からの旅行支援を報告していますが、これはこの研究とは無関係です。他の著者には利益相反はありません。
謝辞
このプロジェクトの資金と支援は、Wilhelm Sander Stiftung、プロジェクト2020.017.1からMHおよびJ.L.に提供されました。Deutsche Forschungsgemeinschaft (共同研究センター/Transregio 124 病原性真菌とそのヒト宿主: 相互作用ネットワーク-FungiNet; プロジェクト A8 から M.H. および H.E.).
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 MLコニカルボトムチューブ | Greiner Bio-One | 188271 | PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE |
| 50 MLコニカルボトムチューブ | Greiner Bio-One | 227270 | PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE |
| 6-and 96-Well- Cell Culture Plate | Corning Inc. LifeSciences | 83-3736/ 83-3474 | TC処理マルチウェルプレート、フラットボトム、最適な細胞接着処理、ガンマ線照射による滅菌、非発熱性 |
| 7-AAD (7-アミノアクチノマイシン D) | BD Biosciences | 559925 | フローサイトメトリーアッセイで非生存細胞を除外するための使いやすい核酸色素 |
| Alexa Fluor 647 抗ヒト EGFR 抗体 | Biolegend | 352918 | クローン AY13 |
| 抗ビオチン MicroBeads UltraPure | Miltenyi Biotec | 130-105-637 | モノクローナルマウス抗ビオチンに結合した UltraPure MicroBeads抗体 |
| Aspergillus fumigatus | ATCC | 46645 | |
| Biosphere Filter Tips (20 and 100 μL) | Sarstedt | 70.3030.365 / 70.3030.275 | |
| ダルベッコ′リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | 修飾、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養、エンドトキシン、テスト済み |
| ELISA MAXデラックスセットヒトIFN-&γ; | Biolegend | 430104 | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液 (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | 分子生物学用, 0.5 H2O、DNase、RNase、NICKaseおよびプロテアーゼ中のM、検出なし、0.2 &μ;mがフィルタリングされました。 |
| FACSクリーン | BDバイオサイエンス | 340345 | |
| FACSフローシース液 | BDバイオサイエンス | 342003 | |
| FACSリンス液 | BDバイオサイエンス | 340346 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | シグマ・アルドリッチ | F7524 | 滅菌ろ過済み、細胞培養に適した、使用前に不活性化 |
| ギブコ、MEM&α;、ヌクレオシド | サーモフィッシャー科学 | 22571020 | フェノールレッド、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、重炭酸ナトリウム |
| 血清 | サーモフィッシャー科学 | 16050122 | 滅菌ろ過、使用前に熱不活性化 |
| ヒトIL-2 IS、研究グレード | Miltenyi Biotec | 130-097-742 | 研究グレード。ED50は≤0.3 ng/mL、&geの活性に対応。3 ×106IU/mg。 |
| イオノマイシン | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | 、サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用 |
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | W368401 | 細胞培養用 |
| MACS LS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | コラムおよびプランジャー、滅菌パック |
| NK-92 | DSMZ | ACC 488 | |
| ネオンTransfektionssystem 100 μL-Kit | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MPK10096 | 再懸濁バッファー R、電解バッファー E2、100 μL ネオンチップ、ネオンエレクトロポレーションチューブ |
| Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用 |
| ポリスチレン丸底チューブ、 | フローサイトメトリーに使用される | BD Bioscience | S-452400 |
| チューブ、1.5 ML | Greiner Bio-One | 7,26,90,001 | PP、透明、キャップ付き、目盛り注入付き。使用前に滅菌してください。 |
| RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX | モフィッシャー サイエンティフィ | 72400021 | GlutaMAX I、 フェノールレッド、HEPES、滅菌ろ過 |
| TipOne 1000 μL XL 目盛り付きフィルターチップ | StarLab | S1122-1730 | |
| Equipment | |||
| BD FACSCalibur | BD Bioscience | ||
| CO2 インキュベーター C60 | Labotect | ||
| Heraeus Multifuge 3SR | Thermo Scientific | ||
| HydroFLEX マイクロプレートウォッシャー | Tecan | ||
| NanoQuant Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Neon Transfection System | Invitrogen | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Quadro MACSセパレーター | ミルテニーバイオテック |
参考文献
- Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med.
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再版と許可
