非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、真菌病原体を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー(CAR-NK)細胞を産生するためのトランスフェクションプロトコルの概要を説明します。抗原特異的な活性化を評価するために、改変された細胞を Aspergillus fumigatus 胚芽管と共培養し、IFN-γ分泌を測定しました。
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方法論記事
非ウイルス性眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた真菌感染症を標的とするキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞のエンジニアリング
この記事について
サマリー
要約
キメラ抗原受容体(CAR)ベースの細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において印象的な有効性を示しています。近年、感染症に対する治療法の開発が進められていますが、真菌感染症を対象とした研究は未だに少ないのが現状です。最適な標的を特定し、細胞産物を最適化するために、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー(CAR-NK)細胞を改変する方法を開発し、真菌による刺激に対する応答を評価しました。この論文では、非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、真菌標的に合わせたCAR-NK細胞を作製するための簡単で堅牢な方法について説明します。NK-92細胞に、ミニサークルDNA(MC)としてベクター化された高活性トランスポゼースSB100XとプラスミドコードCARトランスポゾンをトランスフェクションします。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリー解析を使用して1週間後に評価されます。機能試験に先立ち、導入遺伝子を発現する細胞を磁気活性化細胞選別を用いて濃縮し、さらに1週間培養します。抗原特異的活性化を評価するために、改変された細胞を Aspergillus fumigatus 生殖管と少なくとも6時間共培養します。続いて、分泌されたインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイを用いて測定します。
概要
Aspergillus fumigatus(A.fumigatus)は、平均的な人が毎日100〜1,000の分生子を吸い込んでいる遍在する真菌です1。化学療法を受けている患者や白血病に苦しんでいる患者など、後天性または先天性免疫不全の患者では、A. fumigatusは重度の侵襲性アプセルギルス症を引き起こす可能性があります。毎年、世界中で20万人以上がアスペルギルス症に罹患しています。アゾール誘導体による予防と治療に抗真菌薬を使用しているにもかかわらず、死亡率は30%から95%の間にとどまっています2,3。さらに、この治療法には重大な副作用があり、A. fumigatusの培養物の7%がすでにアゾール耐性を持っています4。
キメラ抗原受容体(CAR)操作T細胞による治療は、悪性疾患の治療において臨床的に成功し、侵襲性アスペルギルス症などの感染症との闘いにおいて有望な前臨床結果を達成しました5,6,7,8。A. fumigatus hyphaeの細胞壁のタンパク質を標的とする前述のAf-CAR-T細胞は、前臨床モデルで有望な結果を示しています6。
移植片対宿主病のリスクの低下、サイトカイン放出症候群、および神経毒性により、CAR-NK細胞は急性感染症の「既製」治療薬としてCAR-T細胞の貴重な代替品となっています9。さらに、NK細胞は抗真菌免疫応答に重要な役割を果たすことが示されています。A. fumigatusで刺激されると、NK細胞はIFN-ɣなどのサイトカインやCCL-3やCCL-4などのケモカインを分泌し、細胞傷害性顆粒を放出する10,11。
NK-92細胞株は、遺伝子工学のためのNK細胞の一般的な供給源であり、比較的単純な培養条件で迅速な増殖と増殖の利点を提供する12。いくつかの前臨床試験では、CAR形質導入NK-92細胞が血液腫瘍と固形腫瘍の両方の治療に利用できる可能性が実証されています。その安全性、有効性、および「既製の」細胞療法としての可能性を調査するために、数多くの臨床試験が進行中です13。
NK細胞で高いトランスフェクション効率と安定した導入遺伝子発現を達成することは困難です。ウイルス法は高い効率性を約束しますが、その後の発がんに伴う挿入変異のリスクを伴います9,14。最新世代のスリーピングビューティー(SB)トランスポゾンベクターは、ウイルスおよび一過性の非ウイルス遺伝子導入法の限界を克服し、安定した遺伝子導入のための安全で強力で経済的に実行可能なシステムを提供します15。
したがって、このプロトコルは、生命を脅かす侵襲性アスペルギルス症の患者にとって「既製の」治療オプションとして機能する可能性のあるAf-CAR-NK-92細胞の生成のための新しい方法論を概説しています。このアプローチの有効性は、 A. fumigatus hyphaeによる刺激によるIFN-ɣの産生の増加によって例証されています。
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プロトコル
ここで説明するすべての実験は、無菌条件下で行う必要があります。このプロトコルでは、(I)コントロールとして機能するDNAを使用しない模擬トランスフェクションと、(II)前述のAf-CAR6を使用したCARトランスフェクションの2つの条件を示します。Af-CARプラスミドには、CARの下流に切断された上皮成長因子受容体(EGFRt)配列が含まれており、トランスフェクションマーカーとして使用されます(補足図S1)。各条件について、4個×10個の6 個のNK-92細胞が必要です。
1. NK-92細胞の培養
- トランスフェクションの1日または2日前に、次の組成で新鮮な細胞培養培地を準備します:75%(v / v)α-MEM培地(ヌクレオシドを含む)+ 12.5%(v / v)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)+ 12.5%(v / v)熱不活化ウマ血清+ 2 mM L-グルタミン。
- 少なくとも10個の7 NK-92細胞を5 × 105 細胞/mLの細胞密度で再懸濁します。
- IL-2を150 UI/mLの濃度で細胞懸濁液に添加します。
- 加湿インキュベーターで細胞を37°Cで5%CO2で培養します。
注:IL-2は、最終濃度5 ng/mLで使用できます。
2. 非ウイルス性トランスフェクション
- 顕微鏡下で細胞の品質を確認します。細胞クラスターの懸濁液と明確な背景は、健康な細胞培養を示しています。
- 6ウェルプレートに、各条件についてウェルあたり2 mLの細胞培養培地を加えます。プレートを37°Cの加湿インキュベーターに5%CO2で置きます。
注:抗生物質はトランスフェクション後の細胞生存率を低下させる可能性があります。培地を抗生物質を含まない状態に保ちます。 - 細胞をカウントし、(例:トリパンブルー染色)を使用して細胞生存率を確認します。
- 8 × 106 NK-92細胞を15 mLの円錐形ボトムチューブに移します。200 × g で5分間遠心分離し、加速と減速を3にします。このプログラムは、次のすべての遠心分離ステップに使用します。
- 遠心分離中に、2本の1.5 mL反応チューブを調製します。Af-CAR用のDNA(プラスミドDNA8 μg、SB100X Mini Circle 4 μg、 表1)をチューブの1つにピペットで移します。2 番目の 1 つは DNA フリーにして、モック コントロールにします。
- 遠心分離機の準備ができたら、上清を静かに捨て、細胞を含むチューブに最大15 mLの予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を満たします。
- 遠心分離機(ステップ2.4)。
- 遠心分離中に、各チューブに3 mLの電解バッファーを添加することにより、各条件に対してトランスフェクションシステムチューブを1本調製します。最初のチューブをピペットステーションに入れます。
- 遠心分離機の準備ができたら、上清を静かに捨て、細胞ペレットを200 μLの再懸濁バッファー(100 μL/4 × 106 細胞)に再懸濁します。
注:細胞を15〜30分以上再懸濁バッファーに放置すると、細胞の生存率とトランスフェクション効率が低下するため、避けてください。 - 100 μLの細胞懸濁液を2つの反応チューブのそれぞれに加えます。やさしく混ぜます。
注:ピペッティング中は、気泡がアーク放電を引き起こし、細胞死につながるため、気泡を避けてください。 - トランスフェクションシステムピペットで最初の反応チューブからDNA細胞混合物をピペットでピペットし、ピペットステーションに配置されたチューブに垂直に挿入します。
注意: 先端がぴったりと収まっていることを確認してください。 - 最初のパルスを 1,650V 、パルス時間を 20ms に設定し、 Startを押します。
- 完了後、2番目のパルスを 500V に設定し、パルス時間を 100msに設定します。 [スタート]を押します。
- 完了後、ピペットステーションからピペットをゆっくりと取り出し、すぐに細胞を2 mLの予熱細胞培養培地を含む調製した培養プレートの1つのウェルに移します(ステップ2.2を参照)。プレートを円状にゆっくりと動かして、セルが均等に分布していることを確認します。
- 模擬サンプルについては、DNAフリー反応チューブ(ステップ2.9を参照)から細胞懸濁液100μLを取り出し、新しいチューブと新しいピペットチップを使用して、ステップ2.11からステップ2.14まで同じ手順を繰り返します。
- プレートを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。
- 30分間のインキュベーション後、IL-2を最終濃度150 UI/mLで添加します。
3. フローサイトメトリーを用いたトランスフェクション効率の確認
- 1週間の培養と2日おきの細胞分割の後、各条件の細胞1〜5個×10個5個をポリスチレン丸底チューブに入れます。
- 1 mLの緩衝液(PBS + 0.5%(v / v)FBS + 2 mM EDTA)を加えて細胞を洗浄します。上清を遠心分離して廃棄します。
- 細胞ペレットを50 μLのバッファーに再懸濁します。1 μL の 7-AAD を添加して、死細胞を検出します。
- 5 μLの抗tEGFR-Alexa Fluor 647抗体を添加して、トランスフェクションした細胞を染色します。
- 4°Cで20分間インキュベートします。
- 細胞を洗浄します(ステップ3.2を参照)。
- 細胞ペレットを200 μLのバッファーに再懸濁します。
- フローサイトメーターでサンプルを測定します。
注:トランスフェクション効率が十分でない場合は、導入遺伝子発現細胞の濃縮を進めてください。
4. 磁気活性化セルソーティング(MACS)による導入遺伝子発現細胞の濃縮
注:最適な結果を得るには、8〜10×10個の6 細胞でプロトコルを開始します。すべての遠心分離ステップは4°Cで行われます。
- ステップ 3.2 で説明したようにバッファーを準備します。細胞を15 mLの円錐形ボトムチューブ内のバッファーで1〜2 ×10 6/100 μLの濃度で希釈します。
- 1-2細胞×106 細胞あたり1 μLの抗EGFRt-ビオチンを添加し、チューブを静かに渦巻かせて溶液が均一に分布するようにします。
- 4°Cで25分間インキュベートし、その後、チューブに最大10 mLのバッファーを充填します。
- 遠心機。上清を捨てます。
- 8 μL/1 ×10 6 セルのコールドバッファーを加えます。
- 106 細胞あたり2 μLの抗ビオチン磁気ビーズ×添加します。
- 4°Cで15分間インキュベートします。
- バッファーを最大10mL充填して洗浄します。
- 遠心機。上清を捨て、細胞を500 μLのバッファーに再懸濁します。
- LSカラムをMACSマグネットにセットし、3 mLのバッファーで洗浄します。
- バッファーがカラム内を完全に移行したらすぐに、セル懸濁液を追加します。
- カラムをそれぞれ3 mLのバッファーで3回洗浄します。
- カラムをマグネットから取り外し、清潔な 15 mL の円錐形ボトムチューブに入れます。
- 5 mLのバッファーをカラムに加えます。プランジャーを使用して、EGFR陽性細胞をできるだけ早く洗い流します。
- 細胞を数日間培養します。次に、フローサイトメトリーで効率を確認します。
5. 機能テスト
注:今後の実験では、次の培地を準備して使用します:RPMI + 20%FBS。
- 1日目 - 種まき Aspergillus fumigatus conidia
- 培地に2.5 × 105 conidium / mLの濃度でA.fumigatus conidia懸濁液を調製します。
- 96ウェル培養プレートで、分生子懸濁液100 μLをウェルあたりピペットで取り、25°Cで16時間インキュベートします。
注:潜生子は潜生子が発芽します(図1)。
- 2日目 - CAR NK-92細胞との共培養
- MockとAf-CAR NK-92の細胞を培地で2回洗浄します。
- 1ウェルあたり100μLの培地に5個×10個の4 細胞を添加することにより、エフェクター対ターゲット比2:1で真菌と共培養します(図2)。
- ポジティブコントロールのために、100 μLの培地にウェルあたり1 ngのPMAと100 ngのイオノマイシンを加えます。培地中の細胞は、ネガティブコントロールとしてのみ使用します。
- プレートを加湿したCO2 インキュベーターで37°Cで少なくとも6時間インキュベートします。
- プレートを300 × g で5分間遠心分離します。
- 各ウェルを100μL収穫します。底面には触れないでください。上清を反応チューブに移します。
注:上澄みだけがピペットでできており、成長した真菌はピペットで動かされていないことを確認してください。疑わしい場合は、別の遠心分離ステップを追加してください。 - 製造元の指示に従ってIFN-ɣELISAを実行するか、サンプルを使用するまで-80°Cで保存してください。
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結果
Af-CAR NK-92細胞の作製には、トランスフェクション、回収、濃縮、増殖など、約14日かかります。トランスフェクション後、細胞は2日おきに培養され、分裂します。トランスフェクション後2日で最初の分裂中に細胞生存率が低下する可能性があります。通常、細胞はトランスフェクションの4日後に回復し、48時間の倍増時間で増殖を開始します。
回復後、トランスフェクション効率を測定し、10〜20%に達すると予想しています( 代表的な結果を図3に示します)。MACSを介してEGFR陽性細胞を濃縮すると、Af-CAR NK-92細胞の割合が95%以上に増加します( 代表的な結果を図4に示す)。
95%を超えるAf-CAR細胞を含む培養物を機能アッセイに使用しました。ここでは、 A. fumigatus 生殖管と細胞を6時間共培養し、活性化マーカーとしてIFN-ɣ分泌を測定しました。
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ディスカッション
提供されたプロトコールは、非ウイルス性のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して真菌病原体を標的とするCAR-NK細胞を作製するためのシンプルで信頼性の高い方法を提供します。この方法は、大きな導入遺伝子の安定的かつ恒久的な挿入を可能にし、これにより、細胞の増殖がさらなる分析に必要な量を得ることを可能にする14,16。
トランスフェクションの成功には、細胞数と生存率、パルス強度と持続時間、DNAの質と量など、いくつかの重要な要因が影響します17。開始する前に細胞の健康状態を評価し、少なくとも90%の生存率を確保することが重要です。パルス強度を上昇させると、細胞集団のトランスフェクション効率が向上することが実証されています。しかし、このアプローチでは、細胞の生存率が大幅に低下する可能性もあります。細胞が過剰で、DNAの量または質が限ら...
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開示事項
M.H.:CAR技術に関連する特許出願および付与された特許に関する発明者で、一部は業界にライセンス供与されています。WürzburgのT-CURX GmbHの共同創設者兼株式所有者。スピーカーの謝礼:BMS、ヤンセン、カイト/ギリアド、ノバルティス。研究支援:BMS.M.B.は、製薬会社「イーライリリーとその会社」からの旅行支援を報告していますが、これはこの研究とは無関係です。他の著者には利益相反はありません。
謝辞
このプロジェクトの資金と支援は、Wilhelm Sander Stiftung、プロジェクト2020.017.1からMHおよびJ.L.に提供されました。Deutsche Forschungsgemeinschaft (共同研究センター/Transregio 124 病原性真菌とそのヒト宿主: 相互作用ネットワーク-FungiNet; プロジェクト A8 から M.H. および H.E.).
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 MLコニカルボトムチューブ | Greiner Bio-One | 188271 | PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE |
| 50 MLコニカルボトムチューブ | Greiner Bio-One | 227270 | PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE |
| 6-and 96-Well- Cell Culture Plate | Corning Inc. LifeSciences | 83-3736/ 83-3474 | TC処理マルチウェルプレート、フラットボトム、最適な細胞接着処理、ガンマ線照射による滅菌、非発熱性 |
| 7-AAD (7-アミノアクチノマイシン D) | BD Biosciences | 559925 | フローサイトメトリーアッセイで非生存細胞を除外するための使いやすい核酸色素 |
| Alexa Fluor 647 抗ヒト EGFR 抗体 | Biolegend | 352918 | クローン AY13 |
| 抗ビオチン MicroBeads UltraPure | Miltenyi Biotec | 130-105-637 | モノクローナルマウス抗ビオチンに結合した UltraPure MicroBeads抗体 |
| Aspergillus fumigatus | ATCC | 46645 | |
| Biosphere Filter Tips (20 and 100 μL) | Sarstedt | 70.3030.365 / 70.3030.275 | |
| ダルベッコ′リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | 修飾、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養、エンドトキシン、テスト済み |
| ELISA MAXデラックスセットヒトIFN-&γ; | Biolegend | 430104 | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液 (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | 分子生物学用, 0.5 H2O、DNase、RNase、NICKaseおよびプロテアーゼ中のM、検出なし、0.2 &μ;mがフィルタリングされました。 |
| FACSクリーン | BDバイオサイエンス | 340345 | |
| FACSフローシース液 | BDバイオサイエンス | 342003 | |
| FACSリンス液 | BDバイオサイエンス | 340346 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | シグマ・アルドリッチ | F7524 | 滅菌ろ過済み、細胞培養に適した、使用前に不活性化 |
| ギブコ、MEM&α;、ヌクレオシド | サーモフィッシャー科学 | 22571020 | フェノールレッド、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、重炭酸ナトリウム |
| 血清 | サーモフィッシャー科学 | 16050122 | 滅菌ろ過、使用前に熱不活性化 |
| ヒトIL-2 IS、研究グレード | Miltenyi Biotec | 130-097-742 | 研究グレード。ED50は≤0.3 ng/mL、&geの活性に対応。3 ×106IU/mg。 |
| イオノマイシン | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | 、サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用 |
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | W368401 | 細胞培養用 |
| MACS LS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | コラムおよびプランジャー、滅菌パック |
| NK-92 | DSMZ | ACC 488 | |
| ネオンTransfektionssystem 100 μL-Kit | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MPK10096 | 再懸濁バッファー R、電解バッファー E2、100 μL ネオンチップ、ネオンエレクトロポレーションチューブ |
| Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | サイトカイン分泌のポジティブコントロールとして使用 |
| ポリスチレン丸底チューブ、 | フローサイトメトリーに使用される | BD Bioscience | S-452400 |
| チューブ、1.5 ML | Greiner Bio-One | 7,26,90,001 | PP、透明、キャップ付き、目盛り注入付き。使用前に滅菌してください。 |
| RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX | モフィッシャー サイエンティフィ | 72400021 | GlutaMAX I、 フェノールレッド、HEPES、滅菌ろ過 |
| TipOne 1000 μL XL 目盛り付きフィルターチップ | StarLab | S1122-1730 | |
| Equipment | |||
| BD FACSCalibur | BD Bioscience | ||
| CO2 インキュベーター C60 | Labotect | ||
| Heraeus Multifuge 3SR | Thermo Scientific | ||
| HydroFLEX マイクロプレートウォッシャー | Tecan | ||
| NanoQuant Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Neon Transfection System | Invitrogen | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Quadro MACSセパレーター | ミルテニーバイオテック |
参考文献
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