蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

サマリー

このプロトコルでは、脂質マイクロバブルの作製と、マイクロバブルの物理化学的特性を保存する精製フリーの>95%のラベリング効率を備えた互換性のあるワンポットマイクロバブル放射性標識法の概要を説明します。この方法は、多様な脂質マイクロバブル製剤に有効であり、放射性および/または蛍光マイクロバブルを生成するように調整できます。

要約

マイクロバブルは、血管超音波造影剤から革新的ながん治療プラットフォームへと進化した、脂質シェルのガス充填粒子です。治療用焦点超音波(FUS)と組み合わせることで、生理学的障壁(血液脳関門など)を安全かつ局所的に克服し、他の方法ではアクセスできないがん(膠芽腫や膵臓がんなど)に薬物を送達し、神経変性疾患を治療することができます。マイクロバブルFUSの治療薬は、相乗的併用放射線療法、マルチモーダルイメージング、マイクロバブルシェルからのオールインワンの薬物ローディングと送達など、新たな方向に進んでいます。

放射性トレーサーによるマイクロバブルの標識は、これらの拡張されたセラノスティクス機能を確立するための鍵です。しかし、既存のマイクロバブル放射性標識戦略は、マイクロバブルの物理化学的特性を乱すことが知られている精製方法に依存しており、短寿命の放射性同位元素を使用し、常に安定したキレート化をもたらすとは限りません。全体として、これはマイクロバブル放射線画像の精度と腫瘍放射性同位元素送達の効率を取り巻く曖昧さを生み出します。

このプロトコルは、マイクロバブルの物理化学的特性を維持しながら、>95%の放射性同位元素キレート化効率を達成する、新しいワンポットの精製フリーマイクロバブルラベリング法を説明しています。汎用性が高く、アシル脂質鎖の長さ、電荷、およびキレート剤/プローブ(ポルフィリン、DTPA、DiI)組成が異なるカスタムおよび市販のマイクロバブル製剤にうまく適用できます。これは、ゼロからのマイクロバブル製造中や、蛍光およびマルチモーダル蛍光/放射性特性のモジュール式のカスタマイズ性を備えた既製のマイクロバブル製剤に適応的に適用できます。したがって、この柔軟な方法により、メカニズム、イメージング、および治療用マイクロバブルFUSアプリケーションの進歩に役立つ、カスタマイズされたトレーサブル(ラジオ、蛍光、またはラジオ/蛍光活性)マルチモーダルマイクロバブルの生成が可能になります。

概要

マイクロバブルは、タンパク質、ポリマー、またはほとんどの場合脂質シェルによって安定化されたガスコアを持つミクロンサイズの超分子セラノスティクス剤です(図1A)。血流に注入されると、マイクロバブルは、それらのガスコア^1,2が溶解する前の数分間の時間枠で超音波によって検出可能なガス/液体界面を維持する。その結果、マイクロバブルの最初の臨床使用は、リアルタイム超音波画像造影剤³としてであった。治療用焦点付き超音波(FUS)の発明により、マイクロバブルの臨床ユーティリティが拡大しました。低周波FUSによって刺激されると、マイクロバブルは振動し、一過性の血管透過化から局所組織アブレーションまで、標的を絞った調整可能な機械的力を生成します^4,5。その結果、過去20年間で、マイクロバブルFUSは、血液脳関門(BBB)の開門、腫瘍(膵臓がん、脳がん、肝臓転移がんなど)の薬物およびイメージングプローブの送達、神経変性疾患治療、およびがんアブレーションについて研究されてきました6,7,8,9,10,11。

マイクロバブルのセラノスティックな武器庫は、新しくエキサイティングな方向に進歩し続けています。従来のマイクロバブル-FUS送達アプリケーションは、市販のマイクロバブルと並行して治療用またはイメージングカーゴを同時投与することに依存していました。マイクロバブルシェル/生物学的相互作用を理解し、カスタムメイドの非商用マイクロバブル製剤を探索し、マイクロバブルシェル12,13,14に直接貨物をロードしたオールインワンセラノスティックマイクロバブルを生成することにより、マイクロバブルFUS送達能力を強化することへの関心が高まっている。実際、脂質マイクロバブル薬物送達研究の約40%は、このようなシェルロードマイクロバブルを利用しています¹⁵。イメージングと薬物送達を超えて、マイクロバブルFUSは、がん放射線療法¹⁶を強化し、ソノダイナミックセラ^ピー17,18を通じて、他の点では良性のシェルロード剤の抗腫瘍効果を活性化することにも有望であることが示されています。

マイクロバブルがんアプリケーションにおけるこれらの従来型および拡張された方向性は、放射性トレーサーでマイクロバブルシェルを標識することにより、より戦略的に進めることができます。オールインワンのカーゴロードマイクロバブルの領域では、このような放射性標識は、1)これらのロードされたマイクロバブルシェルのオンターゲットおよびオフターゲットの生体分布のゴールドスタンダードの定量的評価を促進し、2)オンターゲット送達を最大化するためのマイクロバブル組成物の最適な選択を通知する薬物動態学的構造活性相関を導き出し、3)戦略的かつ適切な画像誘導アプリケーションおよび治療計画(例:組織ターゲットの種類、 線量測定、オフターゲットの安全性懸念を軽減するための薬剤選択、従来の協調治療パラダイムと比較した有用性)オールインワンカーゴロードシステム^15,19。前臨床段階では、マイクロバブルシェルの運命をこのように理解することで、より広範なマイクロバブルFUSの作用機序を明らかにすることもできます。例えば、マイクロバブルシェルから標的細胞への脂質移動は、FUS対応ソノポレーションに影響を与えることが示されている^12,20。したがって、このような移植を理解し最適化することで、ソノポレーションが関与する前臨床および臨床のマイクロバブルFUS療法(in vitroトランスフェクション、薬物送達、腫瘍アブレーション、放射線感作、およびソノダイナミックセラピー20,21,22,23,24,25).二重の超音波および放射線画像施設はまた、従来の二重の薬剤設計ではなく、単一の薬剤からのFUS血管開口および治療モニタリング(例えば、BBB開口速度論)を可能にするであろう²⁶。同様に、脂質マイクロバブル放射性標識は、マイクロバブル-FUS +放射性医薬品の同時送達プラットフォーム²⁷に代わるオールインワンの単一薬剤マイクロバブル-FUS/放射線療法として役立つ可能性がある。

マイクロバブルの脆弱性は、このようなラベリングにとって大きな課題です。既存のすべての放射性標識戦略は、マイクロバブルの安定性とサイズを乱すことが知られている精製方法によって制限されていますが、一部のものは効果がなく不安定な放射性標識28,29,30,31,32も備えています。精製要件は、より長いプロトコルにもつながります。短寿命放射性同位元素(例えば、¹⁸F t_1/2 1.8 ^{h,28,29 99m}Tc_{t 1/2} 6 ^h,3268Ga t_1/2 1 h³¹)の使用と組み合わせると、放射性同位元素の崩壊に関連する非効率性が生じ、放射線画像と治療計画の時間枠が狭くなります。全体として、これらの制限は、短くて代表性の低い放射線画像の取得、不正確な薬物動態データ、および非効率的な腫瘍放射性同位元素送達のリスクがあります。  

本稿では、ポルフィリンの強力で安定した金属キレート化能力を活用することで、これらの制限を克服しています。ポルフィリンは、高度に共役した平面環と、さまざまな金属を収容できる中央配位部位を持つ有機複素環式高分子です。これには、銅-64(t_1/2 12.7時間)、陽電子放出断層撮影法(PET)を備えた放射性医薬品、およびγ計数の実現可能性³³などの長寿命放射性同位元素が含まれる。脂質骨格に結合すると、ポルフィリンは、親の非標識粒子^33,34の特性を維持しながら、速度、高いキレート化効率、および血清安定性で銅-64で容易に取り込むことができる。さらに、ポルフィリンは蛍光活性があり、ナノ粒子および微粒子のモジュール式自己消光により、粒子の破壊時に回復します。PETおよびγカウントを補完する読み出しにより、バルクおよび顕微鏡の両方のシェルフェイト分析が容易になります(図1A)¹⁵。

ポルフィリン脂質をキレート剤として使用することにより、これらの特性を利用して、既存のマイクロバブル放射性標識法に関連する制限を克服する、新しいワンポットの精製不要のマイクロバブル放射性標識法(図1B、C)を生成しました。このプロトコルは、>95%の銅-64キレート化効率を達成し、標識後の精製を必要とせず、マイクロバブルの物理化学的特性を維持します。これは、活性化する前に脂質マイクロバブルの「ゼロアップ」製造に容易に統合できます(図1B)。汎用性が高く、アシル脂質鎖の長さ(C16〜C22)、電荷(中性および陰イオン性)、およびポルフィリン-脂質組成物(1 mol%、10 mol%、30 mol%)が異なるカスタムおよび市販のマイクロバブル製剤にうまく適用でき、ラジオ活性と蛍光活性の両方を持つマイクロバブルを生成します。その適応性は、ポルフィリンを超えて拡張することもできます。ワンポットプロトコールは、市販の代替キレート剤(ジエチレントリアミンペンタアセテート(DTPA)-脂質など)および蛍光色素(DiIなど)を使用するように変更することができます。また、「スパイキング」アプローチにより、既製のマイクロバブル製剤を標識するように変更することもできます。したがって、この方法により、機構、イメージング、および治療用マイクロバブルFUSアプリケーションの進歩に役立つ、カスタマイズされたトレーサブル(ラジオ、蛍光、またはデュアルラジオ/蛍光アクティブ)マイクロバブルの製造が可能になります。以下のプロトコルでは、脂質マイクロバブルの作製、ワンポット放射性標識プロトコルの適用、必要な放射性標識と物理化学的特性の特性評価、および潜在的な修飾について概説しています。

図1:マイクロバブル製造および放射性標識プロトコル (A)ポルフィリン脂質は、ピロフェオフォルビド-a-脂質の形で、このプロトコル内でマルチモーダルキレート剤として機能します。銅-64(i)にキレート化されたモノマーとして、PETおよびイメージング機能を備えています。その蛍光は粒子の形で消光され(マイクロバブル(ii)および溶解後のナノ子孫(iii))、粒子破壊(iv)で消光されません。(B)このレポートに記載されている脂質膜の水和/活性化プロトコルにより、脂質マイクロバブルをゼロから生成し、(C)脂質懸濁液形成とマイクロバブル活性化との間のワンポット放射性標識の統合。この図は、Rajora et ^al.15の許可を得て改作されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. 試薬の調製

1. 酢酸アンモニウム緩衝液(0.1 M、pH 5.5)を調製
   1. 分析天びんを使用して、770.8 mgの酢酸アンモニウムを計量紙に秤量します。秤量した量を清潔な250mLガラスビーカーに移します。
   2. 目盛り付きピペットで測定した90mLの二重蒸留水(ddH₂O)をビーカーに加えます。攪拌子を追加し、ビーカーを磁気攪拌板に置き、酢酸アンモニウムを溶解します。わずかな渦が発生する速度で攪拌しますが、溶液が飛散することはありません。
   3. pH 4 および 7 の標準試料を使用して、装置の指示に従って pH メーターを校正します。キャリブレーションが完了したら、pHプローブを酢酸アンモニウムバッファーに挿入します。
   4. 溶液に酢酸104μLを加え、撹拌して溶解させ、pHを測定します。
      注:この時点で、pHは5.5に近くする必要があります。
   5. マイクロピペットを使用して、10 Nの水酸化ナトリウム(または緩衝液が塩基性になりすぎる場合は塩酸)を5〜10 μL刻みで加えて、緩衝液のpHを調整します。攪拌し、pHを測定し、必要に応じて繰り返します。添加された塩基/酸の量をメモします。
   6. 十分な量のddH₂Oを添加して、合計100 mLのバッファーを作成します。
      注:例えば、pH調整中に45 μLの10 N水酸化ナトリウムを使用した場合、9.851 mLのddH₂Oがビーカーに添加されます(100 mL [目標容量]-90 mL [ステップ1.1.2] - 0.104 mL [ステップ1.1.4] - 0.045 mL [ステップ1.1.5] = 9.851 mL)。
   7. バッファを蓋付きの保存容器に移す前に、最後にもう一度完全に攪拌します。
   8. 機器の指示に従ってpHメーターを清掃します。
      注意: 濃水酸化ナトリウム水溶液と塩酸は皮膚反応を引き起こす可能性があるため、手袋を使用して取り扱う必要があります。
2. ハイドレーションバッファー(PGG)の準備
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をシリンジに吸引し、端部にポリエーテルスルホン0.2μmの細孔サイズシリンジフィルターを装備します。PBSをきれいなプラスチック製の蓋付き遠心分離管にろ過します。
      注:代替メンブレン材料(ポリフッ化ビニリデンなど)の0.2μmポアシリンジフィルターは、メンブレンがPBSおよび酢酸アンモニウムと互換性がある限り使用できます。
   2. ろ過したPBS、プロピレングリコール、およびグリセロールをマイクロピペットで8:1:1の容量比で組み合わせて、水和バッファー(PGGとも呼ばれる)を作製します。プロピレングリコールとグリセロールを添加する場合は、ピペットチップの表面に残っているプロピレングリコールまたはグリセロールの液滴を吸引して拭き取ってから、試薬をゆっくりとPBSにピペッティングします。PBSには、明確なひも状の粘性濁りが見られます。
      注:p1000マイクロピペットを使用して、最初にPBSを遠心チューブに加え、次にプロピレングリコールとグリセロールを追加することをお勧めします。そのため、ピペットチップに液体の動きが見えなくなり、ピペットチップを試薬から取り出すときに空気が取り込まれなくなるまで、マイクロピペットでゆっくりと吸引する必要があります。容量マーキングのあるマイクロピペットチップは、理想的には、そのようなマーキングと一致する試薬容量を選択するために使用する必要があります(たとえば、1 mLまたは5 mLのPGGを作成し、マイクロピペットチップの0.1 mLまたは0.5 mLのマーキングをそれぞれ使用して、プロピレングリコールとグリセロールの完全な吸引を視覚化します)。マイクロピペットの先端の表面を拭くときは、先端の開口部を拭かず、側面のみを拭いてください。
   3. 試薬が均一に溶解するまで、ピペットチップを溶液に入れたままピペットを上下に動かします。溶液に気泡が入らないように注意してください。
   4. 水和バッファーの完全な混合物をさらに確保するには、遠心分離チューブをキャップし、ゆっくりと上下に回転させます。渦巻きにしないでください。
   5. チューブを1000 x g 未満で20〜30秒間回転させ(最低温度4°C、最大RT)、観察できない気泡を取り除きます。
3. 水和/放射性標識バッファー(AA-PGG)を調製します。
   1. シリンジフィルター0.1 M、pH 5.5酢酸アンモニウム緩衝液(ステップ1.1から)、およびPBSをステップ1.2.1に従って別々のチューブに入れます。
   2. ろ過された酢酸アンモニウム緩衝液、ろ過されたPBS、プロピレングリコール、およびグリセロールをp1000マイクロピペットを介して5:3:1:1の酢酸アンモニウム緩衝液(PBS:プロピレングリコール:グリセロール容積比)の遠心分離管に組み合わせます。手順1.2.2〜1.2.5に従って、吸引、混合、および遠心分離の手順に従ってAA-PGGを作成します。
4. インスタント薄層クロマトグラフィー(iTLC)溶離液
   1. 最大0.1gのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を秤量し、キャップ付きバイアルに移します。2% w/vのEDTA溶液が作れるようにddH₂Oに溶解します(例えば、50 mgのEDTAに対して、2.5 mLのddH₂Oを添加します)。
   2. 2% w/v EDTA溶液とステップ1.1の酢酸アンモニウム緩衝液を9:1 v/v比(90% EDTA溶液、10%酢酸アンモニウム緩衝液)で組み合わせます。得られたiTLC溶離液をキャップして保存します。

2. 脂質膜の形成

注:この手順では、市販のマイクロバブルDefinity^®を模倣した組成物で脂質膜の形成を概説し、ポルフィリン-脂質が宿主脂質を置換し、全脂質の30 mol%を構成する。しかし、放射性標識プロトコルは、多様な脂質製剤(C16、C18、C22鎖長、中性または陰イオン電荷、さまざまなポルフィリン-脂質モル組成)に適用することができます。補足スプレッドシート(補足ファイル1)が添付されており、記載されている配合およびその他の配合の計算、組成、質量、およびストック体積を提供します。すべての脂質は、ポルフィリン-脂質、ピロフェオフォルビド-a-脂質(pyro-lipid)を除いて市販されており、その合成は以前に詳細に記載されている^35,36。

1. 補足ファイル1を使用して、必要なフィルム数に基づいて各脂質に必要な総質量を決定します。
2. 空の0.5ドラムガラスバイアルを分析天びんに載せて計量します。
   注:ほこりは、マイクロバブルの形成の成功を妨げます。したがって、キャップなしで保管されている場合は、バイアルに加圧空気を吹き込んで、ほこり/微粒子を取り除きます。
3. 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)を計量紙に秤量します。
   注:秤量した質量は、ステップ2.1から取得し、さらに0.5〜1 mgを追加して、後のステップでサンプル処理中の損失を考慮する必要があります。
4. DPPCを秤量したガラスバイアルに移し、再秤量してバイアル中の脂質質量を決定します。このプロセスにより、ガラスバイアルへの脂質の転写が容易になり、脂質粉末の損失/こぼれが減少し、脂質質量のより正確な測定が可能になります。
5. 他の脂質(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000](DPPE-mPEG)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸(DPPA)、およびC16ピロ脂質)について、ステップ2.2から2.4を繰り返します。
   注:パイロ脂質が秤量可能な粉末の形で利用できず、むしろ未知の量のフィルムまたはアリコートとして利用できない場合、それをクロロホルムに溶解して、その濃度を前に説明したランベルトベールの法則を使用してメタノール中のUV-Vis吸光度測定を通じて計算できるストックを形成することができる³⁵。
6. マイクロピペットまたはガラスシリンジを使用して、ガラス試験管に次の有機溶媒と溶液を調製します:1)クロロホルム、2)9:1 v / vクロロホルム:メタノール、および3)65:35:8クロロホルム:メタノール:ddH₂O。最後に、成分をピペットで動かし、ddH₂O、メタノール、クロロホルムの順に混合します。
   注意:メタノールとクロロホルムは健康に害を及ぼし、可燃性で揮発性です。目の保護具、手袋、白衣を着用し、ドラフトを使用してください。
7. 補足ファイル1を使用して、脂質ストックの作製に必要な有機溶媒/溶液の量を計算し、適切な容量のガラスシリンジを選択します。
   注:この容量は、25〜100μLのガラスマイクロリットルシリンジを使用して容易に測定できるフィルムあたり15〜100μLのストックアリコート容量に対応するストック濃度をもたらすはずです。
8. ガラスシリンジをクロロホルムで3回すすぎます。プランジャーを前後にポンプで動かして、シリンジを乾燥させます。
9. ステップ2.7のスプレッドシート計算に従って、洗浄したガラスシリンジを介して有機溶媒/溶液を測定し、個々の脂質バイアルに追加して脂質ストックを形成します。パイロ脂質をクロロホルムに溶解し(ステップ2.5の注に従ってすでに溶解している場合を除く)、DPPCおよびDPPE-mPEGを9:1 v / vクロロホルムに溶解します:メタノールおよびDPPAを65:35:8クロロホルム:メタノール:ddH₂Oに溶解します。すべての添加に同じガラスシリンジを使用する場合は、各脂質の間をすすぎ、乾燥させます。.
   注:選択した製剤にDPPAまたはそのC18鎖長バリアントが含まれていない場合、パイロ脂質、ホストPC脂質、およびPEG脂質はすべてクロロホルムに溶解できます。
10. バイアルとボルテックスにキャップをします。
11. 計算した量のストック脂質溶液を、ガラスマイクロリットルシリンジを介して新しい0.5ドラムガラスバイアル(フィルムバイアル)に加えます。最初の脂質ストックの場合、針先をバイアルの下部中央に挿入し、バイアルの壁が飛び散らないようにゆっくりと突っ込みます。その後の追加では、針先を液面の真上に置き、バイアルの側面に触れて、針を下の液体にさらさないように最終的な滴を取り除きます。.
    注:汚染が発生した場合は、脂質添加物の間にガラスシリンジをすすぎ、乾燥させてください。複数のフィルムを作成する場合は、溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、フィルムとストックバイアルの両方を添加物の間にキャップします。
12. バイアルを手動で直立させて静かに回転させ、内容物を混合します。バイアルの壁に溶液をはねかけないでください。
13. キャップを外し(キャップを保管)、バイアルのヘッドスペースに窒素ラインを挿入します。窒素の流れを調整して、液体表面にわずかな目に見える乱れを引き起こしますが、漏斗や飛沫はありません。
14. 窒素ラインを挿入した直後にバイアルをボルテックスします。バイアルの底から1 cm以下のところに溶媒が上昇した漏斗を形成するのに十分な低速から開始します。溶剤の飛散を避けてください。溶媒が蒸発するにつれて、渦速度をゆっくりと一時停止せずに上げ、すべての液体が蒸発するまで溶媒の高さを維持します。その結果、バイアルの下3分の1全体に薄膜がコーティングされます。
15. バイアルを真空装備のデシケーターに入れ、フィルムを真空下で8〜72時間乾燥させます。バイアル(開口部を除く)またはデシケーターをアルミホイルで覆います。
    注:プロトコルはここで一時停止できます。次のステップは、フィルムの乾燥後に行うか、フィルムをアルゴンの下に保管し、パラフィルムで密封し、-20°Cの冷凍庫で最大1か月間、乾燥させておくとさらに長く保管することができます。

3.脂質フィルムの水分補給

注:マイクロバブルを in vitro または in vivoで使用する場合は、特に指定がない限り、ステップ3.3から5.4には滅菌済みのマイクロピペットチップ、チューブ、シリンジ、および針を使用してください。

1. フィルムを真空から取り外すか、冷凍庫で保管されている場合は、RTまで温めます。
2. 250mLのビーカーに水を入れ、水を70〜80°Cに加熱します。
3. ウォーターバスソニケーターを69°Cに加熱します。
4. マイクロピペットで1mLのAA-PGG(ステップ1.3)を脂質フィルムバイアルの端に下ろし、気泡の発生を防ぎます。
   注:非キレート化コントロールまたは蛍光のみのマイクロバブルを作製する場合は、AA-PGGの代わりにPGG(ステップ1.2)を使用してください。
5. バイアルの開口部をキャップで部分的に覆い、パーフルオロプロパン(PFP)ラインを挿入するのに十分なスペースを残します。PFPをバイアルのヘッドスペースに液体の20秒間流し込み、液体が目に見えて乱れるが飛散しないようにします。PFPを直接懸濁液に流さないでください。バイアルにキャップをします。
   注意: 流れの強度と時間が適切である場合、バイアルは触ると冷え始めます。
6. バイアルの下半分を70〜80°Cのウォーターバスに1分間浸します。次に、69°Cのバスソニケーターで少なくとも30秒間、または脂質膜がAA-PGGに均一に分散するまで超音波処理します。気泡の発生やマイクロバブルの形成を早期に活性化することは避けてください(早期の活性化は、脂質懸濁液の乳白色/曇った領域として現れます)。必要に応じてバイアルの表面を拭いて、懸濁していない脂質が残っているかどうかをよりよく識別します。.
   注:超音波処理後1分以内に脂質膜が水和しない場合は、70〜80°Cの浴で再加熱し、再度超音波処理してください。
7. 脂質フィルムが均一に懸濁されたら、最後にもう一度1分間加熱し、さらに30秒間超音波処理します。
8. バイアルを拭き取り、受動的にRTまで冷まします(~5〜10分)。
9. ステップ3.5に従ってバイアルのヘッドスペースにPFPを補充し、キャップの端をパラフィルムで密封します。
   注:プロトコルはここで一時停止し、8時間以内に再開できます。

4.放射性ラベリング

注:非キレート化コントロールまたは蛍光のみのマイクロバブルについては、プロトコルセクション5にスキップしてください。

注意:特に指定がない限り、このプロトコルの手順4.4〜4.6を放射線実験室で実行してください。 ⁶⁴名CuCl₂ は放射線学的危険性であり、皮膚への曝露、吸入、または摂取による多系統毒性のリスクがあります。可能な限り、先端がゴム製の鉗子を使用して間接的にヒュームフードで取り扱ってください。取り扱いの際は、保護用の白衣、個人用のリングとバッジの線量計、ダブルグローブを着用してください。 ⁶⁴CuCl₂ が2インチのリードシールド全体で処理されていることを確認します。必要に応じて、鉛で覆われた容器に入れて輸送してください。廃棄物容器をふるい、使用後の汚染状況について運用調査を実施します。

1. ガラスビーカーまたは磁気攪拌棒を含む大きな結晶化皿に60°Cの水浴を準備します。サーマルプローブを水に挿入した温度制御されたホット/スタープレートを使用し、弱いが目に見える漏斗を生成する速度で攪拌するように設定します。
2. 0.1 N HCl中に ⁶⁴CuCl₂ を含む密封されたバイアルを、ゴム先端鉗子を介して用量キャリブレーターに移します。
   注: ⁶⁴CuCl₂を注文する場合は、5-20 μLの0.1 N HClに溶解するようにリクエストしてください。マイクロバブルの収率を維持するためには、少量が重要です。
3. 線量キャリブレーターで測定された銅-64活性と時間に注意してください。鉗子を使用してバイアルを取り出し、リード付き容器に入れます。
4. 64 CuCl₂について報告された容量で記録された活性を除算して、MBq·^mL-1値を求めます。
5. ステップ3.9の脂質懸濁液のキャップを外し、バイアルホルダーに固定します。
6. ⁶⁴CuCl₂バイアルのキャップを外し、鉗子で固定します。
7. マイクロピペットは、40〜250MBqの活性に対応する^64CuCl₂溶液の容量を脂質懸濁液に移します。ピペットチップが懸濁液に沈んでいることを確認してください。プランジしてからピペットで上下に動かして、⁶⁴CuCl₂を完全に移します。
   注:添加される ⁶⁴CuCl₂ の量は、放射性標識マイクロバブルの意図されたアプリケーションおよび線量キャリブレータの感度に依存する。マウスの縦方向(注射後最大48時間)のPETおよび in vivo での採血には、それぞれ最低220MBqおよび50MBqが推奨されます。
8. 脂質懸濁液と ⁶⁴CuCl₂ バイアルの両方をキャップします。
9. 平らなゴム先端の鉗子を使用して、放射性脂質懸濁液を手動で少なくとも5回上下に回転させ、懸濁液を介して ⁶⁴CuCl₂ を穏やかに混合します。バイアルを振ったり落としたりしたり、気泡が発生しないようにしてください。
10. 右側を上にしたら、懸濁液を安定させたまま、バイアルのキャップをそっとフリックします。これにより、キャップに閉じ込められた液体がバイアルの底に引き寄せられます。バイアルのキャップを慎重に部分的に外し、18 Gの針付きPFPラインを挿入します。ステップ3.5に従って、バイアルのヘッドスペースにPFPを20秒間充填します。バイアルにキャップをし、パラフィルムで密封します。
11. 用量キャリブレーターでバイアルの活性を測定し、時間をメモします。
    注:十分な活性がバイアルに移らなかった場合は、ステップ4.5〜4.11を繰り返し、 ⁶⁴CuCl₂の適切な追加容量を追加します。
12. バイアルをフォームバイアルホルダーに入れ、バイアルの下半分が熱にさらされるように押し込みます。ホルダーを攪拌する60°Cのウォーターバスに入れ、1時間加熱します。
13. キレート化反応が進行している間に、iTLCプレートを調製します。新しい手袋を着用しながら、ガラス製のマイクロファイバークロマトグラフィー紙を1 cm x 8 cmのストリップにカットします。ストリップを80°Cのガラス乾燥オーブンで加熱します。
    注:この手順は、非放射性実験室で実行できます。
14. 1時間後、ステップ4.12のバイアルを火から下ろし、ティッシュで端を拭きます。
15. バイアルをゴム先端の鉗子で手動で上下に回転させ、バイアル壁の結露を脂質懸濁液に再凝縮させます。
16. バイアルを直立させた状態で、チューブを安定させながらキャップをはじきます。パラフィルムをはがし、キャップの周りを拭いて、溜まったお風呂の水を取り除きます。
17. バイアルを慎重に外し、脂質懸濁液を1〜2μL吸引します。懸濁液をiTLCストリップの下部中央から1 cmの位置に置き、バイアルを再度キャップします。スポットを乾かします。
    注:理想的には、反応混合物ごとに最低2つのiTLCを見つけ、放射性標識脂質懸濁液ごとに確実に開発する必要があります。
18. マイクロピペットで、iTLC溶離液200μL(ステップ1.4で調製)を10 mL試験管の底に注入します。試験管を鉛容器に収納します。斑点のあるiTLCをチューブに加え、溶離液がストリップの上端から約1 cmになるまでストリップが発達するのを待ちます。
19. 開発されたiTLCストリップを鉗子を使用して取り外します。ストリップを垂直に持ち、γカウンターおよびプッシュキャップ対応の丸型5 mLプラスチックチューブで3分の1にカットし、各ストリップの3分の1が個々の3分の1に直接収まるようにします。プッシュキャップを3本のチューブに挿入します。
20. γカウンターでストリップ含有チューブと空/キャップ付きコントロールチューブを測定し、銅-64活性を測定し、関連する1分あたりのカウント数(cpm)を記録します。他の読み取り値からコントロールチューブのアクティビティを差し引いて、バックグラウンドアクティビティを修正します。
    注:ストリップの下3分の1(ピース1)の補正された測定値は、脂質懸濁粒子にキレート化された銅-64に関連付けられています。中央のセクション(ピース2)には、非超分子の形で遊離銅-64および ⁶⁴のCu-パイロ脂質キレートの筋が含まれています。上部(ピース3)には、主に遊離銅-64が含まれています。
21. 式1で放射性化学純度を計算します。
    (式1)
    注:ピース1のcpmが不当に低いと思われる場合(たとえば、ピース2または3よりも低い、または同等)、または読み取り値がγカウンター非線形/飽和しきい値を超えている場合は、iTLCの放射性標識懸濁液の低容量または希釈アリコート(1〜2μL)を見つけてください。
22. 脂質懸濁液あたりの両方の iTLC ストリップから得られる放射性化学的純度が 94% ≥であることを確認してください。そうでない場合は、脂質懸濁液を60°Cで加熱し続け、iTLCを介して30分間隔でキレート化をモニターします。
23. 放射性標識脂質懸濁液バイアルとマイクロピペット8.89μLの1 N NaOHを懸濁液にキャップを外し、ピペッティングで上下させて塩基を完全に移し、懸濁液を中和します。バイアルにキャップをし、鉗子で手動で回転させて反転/元に戻してから、バイアルキャップを軽くたたきます。
24. ステップ4.10に従ってヘッドスペースをPFPで満たし、パラフィルムでキャップしてシールします。

5. マイクロバブルの活性化と分離

1. 機械式バイアルシェーカーを介して脂質懸濁液を4530rpmで45秒間活性化し、乳白色のマイクロバブル懸濁液を生成します。バイアルを受動的にRTまで約10分間冷却します。結果として生じる乳白色の懸濁液は、時間の経過とともに2つの層に分離します。
   注意: バイアルの内容物は、活性化後に乳白色に見えるはずです。アクティベーション後の一時停止がより明確になることは、アクティベーションの失敗を示しており、その貢献者については後のセクションで説明します。
2. RTになったら、バイアルを静かに反転/戻し、マイクロバブル懸濁液を再懸濁します。バイアルを平らな面にセットし、デカンテーションする前に2分間待ってから、次のように目的のマイクロバブル集団を取得します。
   1. 1mLのプラスチックシリンジに18Gの針を装備し、空気を吸引して注入してシリンジ/針を排出します。2分経過したら、バイアルのキャップを素早く外し、パラフィルムのシールを一気に破ります。
   2. バイアルの底部(ターゲットマイクロバブル集団)から400〜550μLを引き出し、より大きな望ましくないマイクロバブル集団の上部の泡状層が吸引されないようにします。
      注意: 必要に応じて、バイアルを片側に傾けて端部ボリュームをシリンジに集め、泡沫状/軽い層が吸引されないようにします。
3. 針の端を慎重に拭いて泡状の汚染物質を取り除き、分離されたマイクロバブル懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。キャップをそっと閉めます(キャップを急に開けたり閉じたりしないでください)。これは、放射性標識マイクロバブルの最終的な作動懸濁液です。
4. 線量キャリブレーターで最終マイクロバブル製品の活性を測定し、時間を記録します。この値をステップ 5.2 でデカントした懸濁液の量で割ると、MBq·^mL-1 値が得られ、目的のアプリケーションに応じて注入量が計算されます。
   注:放射性標識されたマイクロバブルを使用する準備が整いました。セクション 6 は、最大 24 時間後まで実行できます。これらの放射性標識マイクロバブルをマルチモーダル(超音波、PET、蛍光)イメージングを通じてin vivoで注入および追跡する方法については、Rajora et al.15を参照してください。

6. 放射性標識の効率の検証

1. マイクロバブル懸濁液を穏やかなピペッティングまたはバイアル反転により再懸濁します。
   注:マイクロバブルの作業製品を渦巻きにしないでください。ボルテックスはマイクロバブル懸濁液を不安定にします。
2. 放射性標識懸濁液10-200 μLを0.5 mL 30,000 Molecular Weight Cut-Off(MWCO)遠心分離フィルターユニットに加えます。容量<200μLを使用する場合は、フィルターユニットにddH₂Oを追加して、合計200μLの容量を構成します。フィルターユニットは、互換性のあるマイクロ遠心チューブとキャップに収納します。
   注:放射性標識マイクロバブルの in vitro または in vivo での使用に適用される前に、およびそれとは別に放射性標識試験を実施することは、プロトコルを正常に完了するために推奨されます。この場合、このステップでは、より大きな容量(例えば、200μL)を使用することができます。その後、プロトコールを治療セッションに使用する場合は、まず治療量/注射液を準備し、次に残りの放射性標識マイクロバブル懸濁液でセクション6をできるだけ早く実施します。
3. RTで12,000 x g で10分間遠心分離します。
   注:微量遠心分離機は鉛シールドで囲む必要があります。
4. 微量遠心チューブとそのキャップの間の接続をはさみで切断します。
   1. 「キャップ」とラベル付けされた20mLシンチレーションバイアルにキャップを入れます。フィルターユニットを新しい微量遠心チューブ(チューブ2)に移します。
   2. 1本目の微量遠心チューブに尿中液を入れ、「チューブ1」とラベル付けした20 mLシンチレーションバイアルに入れます。200 μL ddH₂Oをチューブ2のフィルターユニットに加えます。
5. チューブ2のフィルターユニットをRTで12,000 x g で遠心分離します。
6. 手順 6.4 と 6.5 を繰り返します。チューブ1キャップを挟んだ「キャップ」シンチレーションバイアルにチューブ2キャップを追加します。チューブ2を新しい20 mLシンチレーションバイアルに入れます。
7. 3本目の微量遠心チューブのキャップをカットし、ステップ6.4に従って「キャップ」バイアルに入れます。フィルターユニットを「ユニット」とラベル付けされた新しい20 mLシンチレーションバイアルに移し、低清がチューブ3に残り、「ユニット」バイアルに移されないことを確認します。フィルターユニットの端に液滴が見られる場合は、フィルターユニットをチューブ3に戻し、キャップをして、10秒間回転させます。チューブ3を新しい20 mLガラスシンチレーションバイアルに入れます。
8. 5つのシンチレーションバイアル(チューブ1、チューブ2、チューブ3、キャップ、ユニット)にキャップをします。ブランクコントロールとして、空で蓋付きの20 mLシンチレーションバイアルを1つ調製します。
9. 6つのシンチレーションバイアルをγカウンターで銅-64活性を測定します。ブランクバイアルの活性を他のバイアルの活性から差し引きます。式2を使用して放射性標識/キレート化効率を計算します。
   (式2)
   注:ユニットのcpmが不当に低い場合(例:チューブと同等)、または読み取り値がγカウンター非線形/飽和しきい値を超えている場合は、シンチレーションバイアルを最大4日間鉛容器に保管して、値がしきい値を下回るまで活性が減衰し、再測定します。

7. マイクロバブル物理化学的特性評価

注:ラボが放射性サンプル処理用の指定された機器を持っていない限り、マイクロバブルの物理化学的特性評価は、非放射性の「冷たい」銅キレートサンプルを使用して実施する必要があります。この「コールド」ラベリングは、意図したアプリケーションに使用されるマイクロバブルの投与量を評価するために不可欠なマイクロバブルの収量の評価を容易にします。さらに、制御された非キレート化マイクロバブルとの比較が可能になり、放射性標識プロセスがマイクロバブルの特性を乱さないようにすることができます。この「コールド」ラベリングと関連する物理化学的特性評価は、放射性標識マイクロバブルの適用前に行うべきであり、放射性標識の変更が必要な場合にフィードバックとして使用できます(ディスカッションを参照)。

1. 「コールド」銅マイクロバブルラベリング
   1. ステップ4.7で脂質懸濁液に添加した ⁶⁴CuCl₂ 溶液の容量、脂質膜内のポルフィリンモル%組成、 ^および64CuCl₂ 製品シートに記載されている比活性を使用して、放射性標識中に達成されるおおよその金属:ポルフィリンモル比を計算します。計算例は、補足ファイル 1 にあります。
   2. 現在のプロトコルのセクション 1 から 3 に従います。
   3. 0.1 N HCl中に0.1 mg·^mL-1 CuCl₂ 溶液を調製します。
   4. ステップ7.1.1から計算した脂質懸濁液にこのCuCl₂ 溶液の適切な量をマイクロピペットで注入し、バイアルにキャップをします。
   5. バイアルを回転させてCuCl₂ を脂質懸濁液に混合し、ステップ4.9、4.10、および4.12に従ってヘッドスペースをPFPで満たし、シールし、加熱します。バイアルの取り扱いにはゴム製の鉗子は必要ありません。
   6. 1時間後、バイアルを火から下ろし、外側を拭いて乾かします。バイアルをRTまで冷まします。
   7. 脂質懸濁液を中和し、混合し、ヘッドスペースにPFPを充填し、ステップ4.23および4.24に従ってシールします。
   8. マイクロバブル懸濁液とデカントを活性化して、ステップ5.1〜5.3に従って動作する製品を取得します。
2. マイクロバブルサイジング
   注:マイクロバブルのサイジングは、アクティベーション後すぐに実施する必要があります。作業懸濁液の安定性を評価する場合は、サンプル調製と測定を30分間隔で繰り返します。通常、1〜2時間のウィンドウは、活性化後にマイクロバブル作動懸濁液が使用/投与される時間枠を表しています。安定性測定の目的は、この時間枠全体でマイクロバブルのサイズと収率が維持され、作業溶液から投与されるすべての処理に同様のマイクロバブル集団が含まれるようにすることです。
   1. コールターカウンター(CC)をオンにし、 Edit SOP ツールを使用して次のパラメータを設定します:30 μmアパーチャ、0.6-18 μmサイズ範囲、アパーチャ電流400-600 μA、プリアンプゲイン4-8、400ビン、各実行の前後のフラッシュ、容量分析、5 μLサンプル量。
   2. 0.2 μmの媒体真空ろ過ユニットを通じてCC電解質をろ過します。電解質容器とサンプル調製用の別の容器を満たします。
   3. バックグラウンド測定:10 mLの使い捨てキュベットに10 mLのろ過済み電解質を充填し、ベースライン測定を実行します。カウントが 400 未満であることを確認します。そうでない場合は、機器をフラッシュします。
   4. サンプル測定
      1. 10 mLのろ過済み電解質を新しいキュベットに加えます。マイクロバブルサスペンションを手動で反転/元に戻すことにより、再一時停止します。バイアルの下部中央から5μLのマイクロピペット。ピペットチップの端(開口部を除く)を拭き、サンプルを準備した電解質に直接突っ込みます。
      2. ピペットを上下に動かして、懸濁液を完全に移します。ピペットチップを使用して、マイクロバブル懸濁液の「小片」が分散するまで電解質を静かに渦巻かせます。
   5. CCでサンプルを測定します(分析物ごとに2回の実行)。
      注:5μLのマイクロバブルサンプル容量は、通常、1-5 x 10⁹ マイクロバブル・^mL-1 濃度を含むサンプルに適しています。このサンプル量は、特定の CC 装置のセットアップや、サンプルのマイクロバブル収量が上記の範囲外にあるかどうかに応じて、調整が必要な場合があります。
3. 共焦点イメージング
   注:マイクロバブルサイジングの直後、ステップ7.2の注記に従って、マイクロバブルの安定性が保持される時間枠内で共焦点イメージングを実施します。
   1. マイクロバブル懸濁液を再懸濁し、1〜5μLをスライドガラス顕微鏡の中心に移します。マイクロバブル懸濁液滴の上にカバースリップを慎重に置き、気泡が閉じ込められないようにします。サスペンションはカバースリップの下に広がります。
   2. 油浸対物レンズを使用して、マイクロバブルを60倍の倍率で画像化します。明視野および633nm励起/ 640-765nmの発光下で画像を取得します。明視野画像と蛍光画像を重ね合わせます。
      注:プローブがマイクロバブルシェル内に均一に組み込まれている場合、蛍光シグナルは目に見えるすべての粒子のシェルを横切って重なる必要があります。
4. スペクトロフルオロメトリー
   注:分光蛍光測定測定は、マイクロバブルの活性化から24時間以内に行うことができます。
   1. 前述のように1%Triton X-100を調製します³⁵。
   2. 最初の測定の15〜30分前に分光蛍光光度計の電源を入れます。
   3. 1% Triton X-100の蛍光スペクトルを、石英キュベット内の410 nm励起および600-800 nmの発光範囲を使用して測定します。リファレンス検出器信号 (S1/R1 と呼ばれることが多い) で信号を正規化するオプションを選択します。
      注:Triton X-100はピペットで移動すると簡単に泡立ちます。そのため、キュベットに移すときは、最初のマイクロピペットストップにのみ突入してください。
   4. キュベットをメタノールですすぎ、サンプルの間に加圧空気を入れて乾燥させます。
   5. 1% Triton X-100 6 mLを15 mL遠心チューブに移します。マイクロバブル懸濁液を再懸濁し、マイクロピペットで1μLを吸引します。ピペットチップの開口部以外の端を拭き、準備した1% Triton X-100にサンプルを移し、ピペッティングで上下に動かして移し替えを完了します。溶液をボルテックスし、石英キュベットに移します。
      注:サンプルの比率を調整します:機器の感度と非線形飽和しきい値に応じて1%Triton X-100。
   6. このサンプルは、ステップ 7.4.3 のパラメーターを使用して測定します。この測定値は、「破壊された」粒子に対応します。
   7. PBSを使用して手順7.4.3〜7.4.6を繰り返します。この測定値は「無傷」の粒子に対応します。
   8. 1% Triton X-100 および PBS 測定値を使用して、破壊されたサンプルスペクトルと無傷のサンプルスペクトルをベースライン補正します。
   9. PBS(F_PBS)および 1% Triton X-100(F_Tx)中のインタクトサンプルのベースライン補正蛍光シグナルを積分して、式 3 でクエンチング効率(QE)を計算します。
      (式3)
5. UV-Vis分光法
   注:分光法測定は、マイクロバブル活性化後72時間まで行うことができます。
   1. 懸濁液が透明になるまで、RTの浴超音波処理器を使用して、マイクロ遠心チューブ内のマイクロバブル懸濁液のアリコートを超音波処理します。これにより、分光法中の散乱効果が減少します。
   2. 最初の測定の10分前に分光光度計の電源を入れます。0.25 nmのスキャン間隔と200〜800 nmの取得範囲を選択します。ベースライン減算を有効にします。
   3. 測定には、パス長1cmの石英キュベットを使用してください。測定の合間にキュベットをメタノールですすぎ、加圧空気で乾燥させます。
   4. メタノールのベースライン測定値を取得します。
   5. 超音波処理された透明なマイクロバブル懸濁液をボルテックスし、10〜50μLを200〜1000μLのメタノールを含むマイクロ遠心チューブに移します。メタノールの量が測定され、清潔なガラスマイクロリットルシリンジを介してチューブに追加されることを確認します。溶液をボルテックスして、「破壊された」サンプルを取得します。
      注:サンプルの希釈は、ポルフィリンのローディング効率とモル%組成に依存します。20 mol% のパイロ脂質マイクロバブル組成物には、20 倍希釈が適しています。
   6. UV-Visスペクトルを収集します。
   7. ステップ7.5.4から7.5.6を繰り返し、メタノールの代わりにPBSを使用します。
      注:マイクロピペットを使用して、ガラスマイクロリットルシリンジの代わりにPBS容量を測定できます。

8. プロトコルの変更

1. 代替キレート剤
   1. セクション2に従って脂質膜を調製し、パイロ脂質を代替の脂質共役銅キレート剤(例えば、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸(アンモニウム塩)で置き換え、以下DTPA-脂質と呼ぶ)。 補足ファイル 1 を使用して、必要な質量とストック体積を計算します。
      注:代替キレート剤のさまざまなモル組成の試験は、高収率の安定したマイクロバブルが生成できない上限を決定するために必要になる可能性があります。
   2. セクション3から6に従って、放射性標識マイクロバブルを生成し、特性評価します。
   3. ステップ 7.1 から 7.3 に従って、「冷たい」銅キレート化マイクロバブルを特徴付けます。粒子の形態を評価するには、明視野共焦点顕微鏡の画像取得のみが必要です。代替キレート剤が蛍光性の場合は、ステップ7.4および7.5に加えて、関連する励起波長と発光波長を使用して共焦点顕微鏡検査を実施します。
2. 代替蛍光色素
   1. セクション2に従って脂質フィルムを調製し、パイロ脂質を別の脂質標識またはインターカレート蛍光色素(DiIなど)に置き換えます。 補足ファイル 1 を使用して、必要な質量とストック体積を計算します。
      注:代替蛍光色素のさまざまなモル組成の試験は、高収率の安定したマイクロバブルが生成できない上限を決定するために必要になる可能性があります。
   2. AA-PGG の代わりに PGG を使用してセクション 3 に従います。
   3. ステップ 5.1 から 5.3 とステップ 7.2 から 7.5 を完了します。
3. 「スパイキング」アプローチ:事前に形成されたマイクロバブル脂質懸濁液の標識
   1. セクション2に従って、他の脂質成分を含まないパイロ脂質のみを使用して、ポルフィリン脂質膜を生成します。パイロ脂質の量については、 補足ファイル1 を参照してください。
   2. 1mLの水和緩衝液の代わりに100〜200μLのAA-PGG(または放射性標識が不要な場合はPGG)を使用して、セクション3に従ってパイロ脂質フィルムを水和します。
   3. パイロ脂質懸濁液全体を既製の脂質マイクロバブル懸濁液に移します。
   4. ヘッドスペースをPFPで満たし、加熱し、懸濁液を超音波処理し、ステップ3.4から3.9に従ってPFPの下に密封します。パイロ脂質懸濁液が既製の脂質マイクロバブル懸濁液に分散するのを監視し、完全に分散するまで加熱/超音波処理サイクルを行います。
      注:セプタムシールされた市販のマイクロバブルバイアルを使用する場合、パイロ脂質懸濁液は、バイアルのヘッドスペースにPFPを補充することなく、シリンジ/ニードルを介してバイアルに導入できます。
   5. セクション4から7に従って、放射性標識(以下のステップ8.3.5.1を参照)、活性化、分離(以下の注を参照)、および関連する特性評価を実施します。
      1. 別のアプローチは、最初に水和したパイロ脂質懸濁液を放射性標識し、>94%の放射性化学的純度を監視し、1 N NaOHで中和し(パイロ脂質フィルムを水和するために使用されるAA-PGG体積に応じて体積を変更します)、次に放射性標識されたパイロ脂質懸濁液をステップ8.3.3に従って既製のマイクロバブル脂質懸濁液に導入することです。
         注:この修正されたアプローチは、脂質の水和中に生成されたがマイクロバブルに組み込まれていないサブミクロンのマルチラメラ小胞を除去する単離プロセスが続く場合にのみ、蛍光またはマルチモーダル放射性標識マイクロバブルを生成するために使用する必要があります。詳細については、ディスカッションを参照してください。

結果

放射性標識マイクロバブルを製造する際の定量化可能な主な結果は、放射性化学的純度と放射性標識効率です。このプロトコルでは、iTLCと検証済みの遠心法をそれぞれ使用して、それぞれを特徴付けます。 図2A は、全脂質の1 mol%、10 mol%、または30 mol%の組成で、宿主脂質をパイロ脂質に置換した市販のマイクロバブル模倣製剤全体で、平均≥95%の放射化学的純度と効率が達成されたことを示しています。1 mol% および 10 mol% の発熱脂質製剤では、これらの値を達成するために、より濃縮された脂質懸濁液(0.15 mL 対 1 mL)が必要でした。現在のプロトコルで達成された高い放射性化学的純度とキレート化効率により、標識後の精製の必要性はなくなりました。

これは、C16、C18、および C22 鎖長脂質で構成され、全体的に中性または陰イオン性の表面電荷を持つ代替製剤にも当てはまりました(図 2B)。これらの変異体は、平均マイクロバブルサイズ、許容可能なマイ...

ディスカッション

現在の脂質マイクロバブル放射性標識プロトコルは、>95%の放射性純度、>95%のキレート化効率、および標識後の精製を必要とせずにマイクロバブル物理化学的特性の保持を達成します。これらの成果は、既存のラベリングプロトコルでは達成できなかった進歩を表しています。精製手順がないため、放射性同位元素(この場合は銅-64)をより迅速に使用でき、放射性崩壊による非効率的な放射能損失を減らすことができます。結果として生じるマイクロバブル特性の保持は、銅-ポルフィリンキレート^化33の既知の安定性と組み合わされ、その後の任意の放射線画像または治療が、遊離放射性同位元素または精製修飾マイクロバブル集団に関連するものと比較して、目的のマイクロバブルを代表することをより確実にする。

現在のプロトコルは、マイクロバブルの物理化学的特性のそのような保持を確実にするために、並行した「コールド」ラベリングと主要な特性評価技術を統合した最初のプロトコルでもあります。実際、これは、マイクロバブルのサイズ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
64CuCl2	ワシントン大学医学部、マリンクロット放射線研究所	N/A	少量の注文 (<10 & マイクロ;L)0.1 N HCl
酢酸	どの会社		>95%純度
アルミホイル	会社
酢酸アンモニウム	どの会社		でも 純度:≥ 98%
バランス - 分析	会社		0.1 mgまで測定可能
バスソニケーター	どの会社		69 oCまで加熱可能
CC開口部 - 30ミクロン	ベックマン・コールター	A36391	粒径範囲:0.6-18 um
CC電解質	ベックマン・コールター	8546719	アイソトンII希釈剤
CCソフトウェア	ベックマン・コールター	・マルチサイザー 4e
心分離機フィルターユニット(0.5 mL 30,000 MWCO)、互換性のあるマイクロ遠心チューブ付き	MilliporeSigma	UFC503096	Amicon Ultra - 0.5 mL
心分離管 - 15 mLキャップ付き
			度: &ge99.8%
コールターカウンター	ベックマン コールター	B43905	マルチサイザー 4e コールターカウンター
カバー スリップ	VWR	48393081	VWR マイクロカバーガラス
CuCl2	どの会社		酸化していないことを確認する
CuCl2
キュベット - クォート、1 cm 経路長	どの会社
ベット - CC 測定用 10 mL プラスチック	ベックマン コールター	A35471	コールター カウンター アキュベット ST
ddH2O	どの会社		超純水浄化システム
DiI (1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸塩)	任意の会社		粉末フォーム
線量校正器	任意の会社		銅-64
を読み取ることができますDPPA (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸 (ナトリウム塩))	Avanti Polar Lipids	830855P	粉末形態
DPPC (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)	Avanti Polar Lipids	850355P	粉末形態
DPPE-MPEG (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (アンモニウム塩))Avanti	Polar Lipids	880200P	粉末形態
DTPA-脂質(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミンペンタ酢酸(アンモニウム塩))	Avanti Polar Lipids	790106P	粉末状
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)	任意の会社
マカウンター	会社		銅-64
マカウンティングチューブプッシュキャップ	Globe Scientific	22-171-665	ランジ付き12mmチューブ用プラグキャップ
ガンマカウンティングチューブ	Sarstedt	55.1579	5 mL, 75 x 12 mm, PS
ガラスビーカー - 250 mL	あらゆる企業		100 oCまでの温度に耐えることができます
ガラス乾燥オーブン	あらゆる企業		80 oCまで加熱可能
ガラスマイクロリットルシリンジ - 25、50、100、 1000 & マイクロ;L	任意の企業		有機溶剤と互換性あり
ガラスシンチレーションバイアル - 20 mL	VWR	66022-081	VWR®シンチレーションバイアル、ホウケイ酸ガラス、スクリューキャップ付き、パルプホイルライナー付き
ガラスバイアル - 0.5ドラム	VWR	66011-020	VWR バイアル 1/2ドラム、黒色フェノールスクリューキャップとポリビニール表面パルプライナー付き
グリセロール	シグマアルドリッチ	G7757-1L	度:  ≥ 99.0%
目盛り付きピペット/ガン	あらゆる企業
ホット/スタープレート			自動温度制御用温度プロブを装備
塩酸 - 0.1 N	企業
iTLC プレート	アジレント	A120B12	iTLC-SA クロマトグラフィー紙
実験用組織	あらゆる企業
メディア真空ろ過ユニット	あらゆる企業		0.22ミクロン細孔径、PESメンブレン、500mL漏斗容量
メタノール	あらゆる企業		純度:  ≥ 99.8%、HPLCグレード、ACS仕様に適合
マイクロ遠心分離管 非滅菌 - 1.5mL	あらゆる企業
マイクロ遠心チューブ滅菌 - 1.5 mL	マイクロ
ピペット - p1000、p200、p20、p10	どの企業		済み
顕微鏡スライド	ッシャーサイエンティフィ	12-550-15	スーパーフロストプラス顕微鏡スライド プレクリーニング針
- 18 G			滅菌パラ
フィルム	あらゆる企業
PBS	シグマ アルドリッチ	D8537-500ML	DPBS、改質、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養に最適
PFP	FluoroMed	APF-N40HP	純度:  ≥ 99.8%
PFP ライン			約 50 cm の直径 1/4 インチ プラスチック ホース
PFP レギュレーター	スウェージロック	SS-1RF4 および SS-4HC-1-4
pHメーター	会社
pH規格 4および7	会社
p1000、p200、p10用ピペットチップ - 非滅菌	会社
p1000、p200、p10用ピペットチップ - 滅菌 任意の	会社
シリンジ - 1 mL	任意の会社		菌プロ
ピレングリコール	BioShop	PRO888.500	純度:  ≥ 99.5%
パイロ脂質	N/A		社製
ゴムチップ鉗子	どの会社		先端の細いエッジと平らな/四角いエッジの組み合わせをお勧めします
さみ	会社でも
水酸化ナトリウム - 1 N	どの会社
水酸化ナトリウム - 10 N	どの会社でも
光蛍光光度計	会社		410 nmの励起と600-850 nmの発光が可能
光蛍光測定ソフトウェア	Horiba	FluorEssence
分光計	任意の会社
シリンジ - 1 mL	任意の会社		使い捨て、プラスチック、滅菌
シリンジフィルター - 0.2ミクロン孔径	任意会社		膜材質:PESまたは酢酸アンモニウム/酢酸およびPBS試験管と互換性のあるその他の試験
管 - 10 mL
Triton X-100	任意の会社
真空デシケーター/真空	任意の会社
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515030-0508	プロトコルでは機械式バイアルシェーカーと呼ばれ
量紙	会社		でも、製品の損失を避けるために、計量紙を3x3cmの正方形にカットすることをお勧めします