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方法論記事

アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

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DOI:

10.3791/67444

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2024年9月20日

 , 
1Department of Horticulture and Landscape Architecture, National Taiwan University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、効率的なキャベツ葉肉プロトプラストシステムについて説明しています。さまざまな酸素欠乏治療が試験され、システムは低酸素反応性遺伝子の高い活性化を示し、 アブラナ科 野菜の洪水耐性の遺伝的および分子的メカニズムの研究を促進しました。

要約

気候変動が大雨をもたらす中、 アブラナ科 の主要な野菜であるキャベツは、洪水による低酸素ストレスにより、大幅な収量減少に直面しています。キャベツの氾濫耐性のメカニズムを特定するには、キャベツの形質転換難性を克服するための遺伝的機能研究のための汎用性の高いプラットフォームが必要です。この研究では、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムとそれに対応するプロトプラスト低酸素誘導プロトコルが開発されました。このプロトコールは、キャベツの葉からのプロトプラスト単離の高収率と完全性を達成し、最適化された酵素条件を使用してトランスフェクション効率が40%を超えました。治療前に低酸素の影響を軽減するために、W5溶液を酸素ガスで泡立てて溶存酸素レベルを上げました。EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、脱酸素パックなど、酸素レベルの調整と生理的酸素捕捉処理のためのいくつかの化学物質が試験されました。デュアルルシフェラーゼアッセイでは、キャベツのプロトプラストで嫌気性呼吸応答遺伝子 BoADH1 および BoSUS1L のプロモーターが低酸素治療後に活性化され、脱酸素パックによる処理後に最も高い誘導レベルが観察されることが示されました。要約すると、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムと低酸素治療の組み合わせは、効率的で便利なプラットフォームを示しています。このプラットフォームは、キャベツの低酸素応答に関連する遺伝子機能と分子メカニズムの研究を容易にすることができます。

概要

地球規模の気候変動は洪水を悪化させ、世界中でますます重要な問題として浮上しています。ここ数十年で洪水の頻度が増加傾向にあり、その結果、作物の大幅な損失が発生しています1,2。キャベツ(Brassica oleracea var. capitata L.)は、世界的に重要な野菜ですが、大雨の悪影響を受けやすいため、極端な気象現象に直面しても持続可能な生産を確保するためには、洪水に強いキャベツ品種の開発が必要です。したがって、キャベツの浸水ストレスに関連する分子メカニズムを理解することは、この課題に対処するために不可欠です。

水没条件下での植物の遺伝子制御メカニズムを理解するために、トランスジェニック系統は遺伝機能研究に広く使用されています。しかし、このアプローチは、高コスト、時間のかかる形質転換、継代培養のプロセス、および多くの作物種での形質転換効率の低さによって制約を受けており、代替の方法論の開発が必要です。プロトプラストベースの一過性発現システムは、汎用性と効率性に優れた代替手段として、植物分子研究に広く応用されています。これらのシステムは、プロモーター活性、環境手がかりに応答したシグナル伝達経路、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-DNA相互作用、および細胞内局在の研究を容易にします3。プロトプラスト一過性発現系の確立は、モデル植物4,5だけでなく、サトウキビ6、カーネーション7、胡蝶蘭8、ナス9などの経済的に重要な作物でも報告されている。さらに、これらのシステムは、Camellia oleifera10やPopulus trichocarpa11などの木本植物に成功裏に実装されています。しかし、水没による低酸素ストレス下で葉物野菜を研究するためにプロトプラストシステムを適用するためのプロトコルは限られています。したがって、キャベツプロトプラスト一過性発現システムを使用して葉物野菜の低酸素応答を研究することに関心のある人のために、この研究で統合されたプロトコルが開発されました。

細胞レベルでの浸水誘発性低酸素応答を実行するために、低酸素環境をシミュレートするために、以前の研究ではいくつかの酸素捕捉方法が採用されてきました。これらには、EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、および酸素消費バッグの使用が含まれます。EC-オキシラーゼは、通常、ヒト細胞株12およびシロイヌナズナプロトプラスト13の嫌気性治療に使用されます。OxyFluorは、生細胞蛍光イメージング中の活性酸素種によって引き起こされる光退色を軽減するのに効果的であることがわかっています14,15。亜硫酸ナトリウムは、線虫の嫌気性治療に用いられており16、最近では、イネのプロトプラストに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ17などの技術と組み合わせて用いられている。主に嫌気性細菌培養18に使用される脱酸素パックは、嫌気性条件下でトウモロコシプロトプラストのZmPORB1プロモーターの活性化を誘導する有効性も実証されています19。

本研究は、キャベツのプロトプラスト単離と一過性発現のための強固なパイプラインを確立することを目的としています。その後、デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて嫌気性応答遺伝子のプロモーター活性を評価することにより、様々な酸素調整治療の有効性を評価した。この研究で開発されたプロトコルは、 アブラナ属 のシステムの浸水または低酸素ストレスに関連する将来の研究にとって価値があると期待されています。

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プロトコル

この研究では、2つの市販のキャベツ品種(B. oleracea var. capitata)、「冬鳥」と「228」が利用されました。プロトコルワークフローを図 1に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.キャベツの苗の準備

  1. 48ウェルプラグトレイ(L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm)の丸い正方形の穴(D 4.5 cm x H 4.5 cm)に、市販の植物基質を使用して「フユドリ」と「228」のキャベツの種を播種します。種子を成長培地に約1cmの深さで埋め込みます。
  2. キャベツの苗を22°Cの成長室で、16/8時間の明暗サイクルで育てます。光相中は、100 μmol m-2·s-1 (白色蛍光管)の光強度を維持します。
  3. 成長の2〜3週間後、葉肉のプロトプラストをさらに分離するために、2葉の段階でキャベツの苗を使用します。
    注:キャベツの苗の推奨サイズは、2枚目の本葉が完全に拡大されますが、3番目の本葉は拡大されず、その長さが1 cmより短い2葉の段階です(図2A)。キャベツの苗の発育段階を同期させるためには、「ふゆどり」の種子は成長速度が異なるため、「228」の種子よりも約2日早く播種する必要があります。この調整により、キャベツ植物間の望ましい段階での均一な成長と成熟が保証されます。

2.キャベツプロトプラストの分離

  1. 各プロトプラスト単離の前に、12.5 mLの酵素溶液(表1)を調製します。
    1. 10 mM MES(pH 5.7)と0.6 Mのマンニトールを含む溶液を55°Cで予熱します。 1.5%セルラーゼR10と0.75%マセロチームR10を添加した後、溶液を55°Cで10分間温め続けます。
    2. 酵素溶液が室温(25°C)まで冷えた後、10 mMのCaCl2 と0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えます。調製した酵素溶液を0.22μmシリンジフィルターを用いて9cmのシャーレにフィルター滅菌します。
      注:溶液を事前に加温すると、酵素の溶解度が高まり、プロテアーゼが不活性化されます。消化効果は、セルラーゼ酵素の種類によって異なります。セルラーゼR10とマセロチームR10の組み合わせは、キャベツのプロトプラストの単離に適しています。
  2. 5〜8本のキャベツの苗から2番目の新しく拡大した本葉を集め、鋭利なカミソリの刃を使用して0.5〜1.0mmのストリップにスライスします。すぐに葉のストリップを新しく調製した酵素溶液に移します。
    注:適切な段階でキャベツから健康で指定された葉を選択することが重要です。2葉期のキャベツ苗から新たに拡大した2枚目の本葉は、最も高いプロトプラスト分離効率を提供します。過度に成熟した植物、子葉、または老化した葉は、プロトプラストの単離には推奨されません。5〜12枚の十分に拡大した本葉は、12.5mLの酵素溶液でキャベツのプロトプラストを成功裏に生成できます。プロトプラストの単離に必要な葉の数は、必要なプロトプラストの所望の量によって異なります。通常、5〜8枚の葉から得られるプロトプラストは、その後の実験手順に十分です。
  3. 暗闇で30分間真空浸透した後(図2B)、キャベツの葉のストリップを酵素溶液(図2C)に室温でさらに4〜16時間浸しておきます。
    注:酵素消化時間はキャベツの品種によって異なる場合があり、特定の遺伝子型に応じて最適化する必要があります。例えば、「フユドリ」は「フユドリ」の葉が厚いため、「228時間」(4時間)に比べて消化時間が長くなります(16時間)。
  4. プロトプラスト含有溶液を等量のW5溶液(2 mMのMES(pH 5.7)、154 mMのNaCl、125 mMのCaCl2、5 mMのKCl、および5 mMのグルコース(調製については 表1 を参照)で希釈し、酵素消化を停止します。
  5. プロトプラスト懸濁液を緩やかに旋回させるか、オービタルシェーカーを使用して放出します。細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーで50 mLのコニカルチューブにろ過します。
    注:単離されたプロトプラストは70μmの細胞ストレーナーを通過することができますが、未消化の植物破片はストレーナーによって保持され、その後懸濁液から除去されます。セルストレーナーは、洗浄後も再利用して75%エタノールで保持することができますが、セルストレーナーをW5溶液で十分にすすいで残留エタノールを除去する必要があります。
  6. プロトプラスト溶液を150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。ペレット状にしたプロトプラストを、コニカルチューブの壁に沿って約1mLの流量で10mLのW5溶液を加えて、穏やかに洗浄します。チューブを150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、この洗浄手順を再度繰り返して、酵素溶液が完全に除去されるようにします。
  7. プロトプラストをW5溶液に再懸濁し、氷上に30分間置きます。アイスインキュベーション後、すべての上清が除去されるまで、ピペットで一度に1mLずつ上清を取り除きます。
  8. 4 mMのMES(pH 5.7)、0.4 Mのマンニトール、および15 mMのMgCl2 からなる氷で予冷したMMG溶液にプロトプラストを再懸濁します(調製については 表1 を参照)。
  9. 血球計算盤でプロトプラスト濃度を測定し、MMG溶液を用いて最終濃度を4×105 プロトプラスト・mL-1 に調整します。

3. プロトプラストトランスフェクション

  1. 総容量10 μLのプラスミド (5-10 μg) (補足ファイル1) と100 μLのプロトプラスト (4 x 104 プロトプラスト) を混合し、氷上に10分間置きます。
    注:トランスフェクショングレードのプラスミド精製には、製造元の指示に従って市販のプラスミドキットを使用します。約4 x 104 プロトプラストは、通常、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイで使用されます。より大規模な実験では、トランスフェクションに利用できるプロトプラストの量が多くなります。具体的には、10 μgのプラスミドをトランスフェクトした約2 x 105 プロトプラストは、30%から40%の範囲のトランスフェクション効率が実証されています。
  2. 40%ポリエチレングリコール4000(PEG4000)、0.1 MのCaCl2、および0.2 Mのマンニトールを含む等量(110 μL)の新たに調製したPEG溶液(調製については表1を参照)をプロトプラスト溶液に同量(110 μL)加え、穏やかに混合します。
  3. プロトプラスト混合物を室温で暗所で10分間インキュベートし、その後、440μLのW5溶液を加えて反応を終了します。
  4. トランスフェクションしたプロトプラストを150 x g で2分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを750 μLの酸素富化W5溶液に再懸濁します。再懸濁したプロトプラストを、1% BSAでプレコートした6ウェル組織培養プレートに移します。
    注:細胞インキュベーションに使用するW5溶液は、エアストーンに接続された酸素濃縮器(~90%酸素)を使用して酸素で5分間泡立てる必要があります(図2D)。この酸素化プロセスの後、W5溶液中の最終的な溶存酸素濃度は7.84 mg·L-1 ± 0.05 mg·L-1 から29.18mg·L-1 ± 0.43 mg·L-1、溶存酸素計で測定した値。トランスフェクションされたプロトプラストの再懸濁のためのW5溶液の量は、使用する組織細胞培養プレートの種類によって異なります。12ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートの場合、ウェル内の深さが深いため、インキュベーション中の低酸素ストレスを軽減するために、W5溶液の量を減らすことをお勧めします。BSAコーティングの場合、培養プレートの各ウェルに1 mLの1%BSA溶液を注入し、ウェルを10秒間コーティングしました。その後、BSA溶液を各ウェルから廃棄し、その後、ウェルにW5溶液を補充しました。この手順は、BSAを使用して一時的な非接着性表面を作成し、その後の実験ステップでプロトプラストが培養プレートのプラスチック表面に付着するのを効果的に防ぐことを目的としていました。

4. キャベツプロトプラストの低酸素治療

  1. プロトプラストトランスフェクションの直後に化学的または物理的に誘発される低酸素治療を実施します。
    注:低酸素療法は、プロトプラストトランスフェクションの直後に適用することをお勧めします。.プロトプラストのインキュベーションを長期間行うと、その後の低酸素反応が減少する可能性があります。
    1. キャベツのプロトプラストに化学的に誘発された低酸素症の場合は、OxyFluor、EC-オキシラーゼ、および亜硫酸ナトリウムをW5プロトプラスト溶液に加えます。.
      注:W5に0.6単位・mL-1 EC-オキシラーゼ、0.6単位・mL-1 OxyFluor、および1 g・mL-1 亜硫酸ナトリウムを使用した場合、調査した2種類のキャベツで BoADH1 および BoSUS1L プロモーター(図3A)を誘導し、プロトプラストの完全性を低く抑えることができる試験条件でした。
    2. 酸素を消費するバッグ誘発性低酸素症の場合は、3.5Lの嫌気性ジャーに2つの脱酸素パックを入れて、低酸素環境を作り出します。
  2. 低酸素処理されたプロトプラストを回収するには、150 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 採取したプロトプラストを液体窒素で凍結し、その後のアッセイのために-80°Cの冷凍庫で保存します。

5. デュアルルシフェラーゼアッセイ

  1. デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイは、製造元の指示に従って、わずかな変更を加えて実施します。
    1. キャベツのプロトプラストを50 μLの1x Passive Lysis Bufferに再懸濁し、ボルテックスで10秒間放置します。
    2. 破壊されたプロトプラストを氷上で10分間インキュベートし、10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、上清を回収します。
    3. 20 μLの細胞ライセートをマイクロプレートの各ウェルに加えます。100 μLのルシフェラーゼアッセイ試薬IIをウェルに分注し、マイクロプレートリーダーを使用してホタルルシフェラーゼ活性を測定します。
    4. 市販のアッセイ試薬100 μLを各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーを使用してRenillaルシフェラーゼ活性を測定します。

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結果

この研究では、キャベツのプロトプラストを利用した一過性発現システムの開発に成功しました(ワークフローについては図1を参照)。プロトプラストは、セルラーゼ/マセロチーム消化と暗真空浸潤(図2B、C)を使用して、市販のキャベツ品種「ふゆどり」および「228」から適切なサイズの2〜3週齢のキャベツ本葉(図2A)から単離されました。インキュベーション中に水中のプロトプラストが経験する低酸素状態を緩和するために、酸素マシンに接続されたエアストーンバブラーを使用してW5溶液を酸素化しました(図2D)。このプロセスにより、W5溶液中の溶存酸素濃度が7.84mg·L-1 ± 0.05 mg·L-1から29.18mg·L-1 ± 0.43 mg·L-1 酸素が泡立ってから 5 分後。単離プロセス後、...

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ディスカッション

このプロトコルは、2つの市販のキャベツ品種からのプロトプラスト単離のための合理化された方法を提供します。この分析法の有効性は、主に、生存可能なプロトプラストの収量とプロトプラストトランスフェクションの効率という2つの重要な品質管理パラメーターを通じて評価されます。このプロトコルの実施により、4.00 x 106 protoplasts·g−1·両方のキャベツ品種から得られた葉肉組織のFW(図2E、F)。この収量は、ナス、カーネーション、サトウキビ、およびプロトプラストの収量が2.5 x 106から1.4 x 107 protoplasts·g−1·FWの6,7,9,17。

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、National Science and Technology Council(MOST 111-2313-B-002-029-およびNSTC 112-2313-B-002-050-MY3)の支援を受けました。 図1では、実験的なアイコンは BioRender.com から提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)PhytoTech LabsM825酵素溶液調製用
228キャベツ種子Takii & Co., Ltd. (京都)
50 mL コニカルチューブSPL ライフサイエンス50050酵素溶液調製用
6ウェル組織培養プレートAlpha Plus16106プロトプラストインキュベーション用
70 μm細胞ストレーナーSorfa SCS701プロトプラストろ過用
9cmシャーレAlpha Plus16001酵素消化用
嫌気性ジャーHIMEDIA嫌気性ジャー 3.5 L低酸素治療用 
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7906W5溶液調製および培養プレートコーティング用
塩化カルシウムJ.T.Baker131301W5溶液およびPEG溶液調製
用 セルラーゼR10ヤクルト酵素溶液調製用
デシケーターターソン 402030真空浸透用
D-GlucoseBioshopGLU501W5溶液調製用
溶存酸素計Thermo ScientificOrion Star A223酸素測定用
D-マンニトールSigma-AldrichM1902酵素溶液、PEG溶液、MMG溶液調製用
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムプロメガE1960デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
用 EC-オキシラーゼオキシラーゼ株式会社EC-0005低酸素治療用
冬鳥キャベツの種小林タネ株式会社 (加古川市)
高速冷蔵遠心分離機日立CR21GIIIプロトプラスト収穫用
マセロチーム R10 ヤクルト酵素溶液調製
用 塩化マグネシウムアルファ Aesar12315MMG溶液調製用
マイクロ遠心分離機日立CT15REプロトプラスト収穫用
マイクロプレートグライナー655075デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ用
マイクロプレートリーダー分子デバイスSpectraMax Mini用デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
Millex 0.22 μmシリンジフィルターメルクSLGP033RS酵素溶液調製用
オイルフリー真空ポンプロッカー ロッカー300真空浸透用
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005低酸素治療用
脱酸素パック三菱ガス化学AnaeroPack, MGCC1低酸素治療用
酸素濃縮器UTMOST PERFECTAII-XW5溶液中の酸素バブリング用
植物基質Klasmann-DeilmannPotgrond H基質キャベツ苗調製用
プラスミドミディキットQIAGEN12145トランスフェクショングレードのプラスミドDNAの精製 
ポリエチレングリコール4000Fluka81240プロトプラストトランスフェクション用
塩化カリウムJ.T.Baker304001W5溶液調製用
カミソリ刃ジレットキャベツ葉ストリップ調製用
塩化ナトリウムBioshopSOD002W5溶液調製用
亜硫酸ナトリウムSigma-AldrichS0505低酸素治療用
ウォーターバスYihderBU-240D酵素溶液調製用

参考文献

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