アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

サマリー

このプロトコルは、効率的なキャベツ葉肉プロトプラストシステムについて説明しています。さまざまな酸素欠乏治療が試験され、システムは低酸素反応性遺伝子の高い活性化を示し、 アブラナ科 野菜の洪水耐性の遺伝的および分子的メカニズムの研究を促進しました。

要約

気候変動が大雨をもたらす中、 アブラナ科 の主要な野菜であるキャベツは、洪水による低酸素ストレスにより、大幅な収量減少に直面しています。キャベツの氾濫耐性のメカニズムを特定するには、キャベツの形質転換難性を克服するための遺伝的機能研究のための汎用性の高いプラットフォームが必要です。この研究では、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムとそれに対応するプロトプラスト低酸素誘導プロトコルが開発されました。このプロトコールは、キャベツの葉からのプロトプラスト単離の高収率と完全性を達成し、最適化された酵素条件を使用してトランスフェクション効率が40%を超えました。治療前に低酸素の影響を軽減するために、W5溶液を酸素ガスで泡立てて溶存酸素レベルを上げました。EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、脱酸素パックなど、酸素レベルの調整と生理的酸素捕捉処理のためのいくつかの化学物質が試験されました。デュアルルシフェラーゼアッセイでは、キャベツのプロトプラストで嫌気性呼吸応答遺伝子 BoADH1 および BoSUS1L のプロモーターが低酸素治療後に活性化され、脱酸素パックによる処理後に最も高い誘導レベルが観察されることが示されました。要約すると、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムと低酸素治療の組み合わせは、効率的で便利なプラットフォームを示しています。このプラットフォームは、キャベツの低酸素応答に関連する遺伝子機能と分子メカニズムの研究を容易にすることができます。

概要

地球規模の気候変動は洪水を悪化させ、世界中でますます重要な問題として浮上しています。ここ数十年で洪水の頻度が増加傾向にあり、その結果、作物の大幅な損失が発生しています^1,2。キャベツ(Brassica oleracea var. capitata L.)は、世界的に重要な野菜ですが、大雨の悪影響を受けやすいため、極端な気象現象に直面しても持続可能な生産を確保するためには、洪水に強いキャベツ品種の開発が必要です。したがって、キャベツの浸水ストレスに関連する分子メカニズムを理解することは、この課題に対処するために不可欠です。

水没条件下での植物の遺伝子制御メカニズムを理解するために、トランスジェニック系統は遺伝機能研究に広く使用されています。しかし、このアプローチは、高コスト、時間のかかる形質転換、継代培養のプロセス、および多くの作物種での形質転換効率の低さによって制約を受けており、代替の方法論の開発が必要です。プロトプラストベースの一過性発現システムは、汎用性と効率性に優れた代替手段として、植物分子研究に広く応用されています。これらのシステムは、プロモーター活性、環境手がかりに応答したシグナル伝達経路、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-DNA相互作用、および細胞内局在の研究を容易にします³。プロトプラスト一過性発現系の確立は、モデル植物^4,5だけでなく、サトウキビ⁶、カーネーション⁷、胡蝶蘭⁸、ナス⁹などの経済的に重要な作物でも報告されている。さらに、これらのシステムは、Camellia oleifera¹⁰やPopulus trichocarpa¹¹などの木本植物に成功裏に実装されています。しかし、水没による低酸素ストレス下で葉物野菜を研究するためにプロトプラストシステムを適用するためのプロトコルは限られています。したがって、キャベツプロトプラスト一過性発現システムを使用して葉物野菜の低酸素応答を研究することに関心のある人のために、この研究で統合されたプロトコルが開発されました。

細胞レベルでの浸水誘発性低酸素応答を実行するために、低酸素環境をシミュレートするために、以前の研究ではいくつかの酸素捕捉方法が採用されてきました。これらには、EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、および酸素消費バッグの使用が含まれます。EC-オキシラーゼは、通常、ヒト細胞株¹²およびシロイヌナズナプロトプラスト¹³の嫌気性治療に使用されます。OxyFluorは、生細胞蛍光イメージング中の活性酸素種によって引き起こされる光退色を軽減するのに効果的であることがわかっています^14,15。亜硫酸ナトリウムは、線虫の嫌気性治療に用いられており¹⁶、最近では、イネのプロトプラストに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ¹⁷などの技術と組み合わせて用いられている。主に嫌気性細菌培養¹⁸に使用される脱酸素パックは、嫌気性条件下でトウモロコシプロトプラストのZmPORB1プロモーターの活性化を誘導する有効性も実証されています¹⁹。

本研究は、キャベツのプロトプラスト単離と一過性発現のための強固なパイプラインを確立することを目的としています。その後、デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて嫌気性応答遺伝子のプロモーター活性を評価することにより、様々な酸素調整治療の有効性を評価した。この研究で開発されたプロトコルは、 アブラナ属 のシステムの浸水または低酸素ストレスに関連する将来の研究にとって価値があると期待されています。

プロトコル

この研究では、2つの市販のキャベツ品種(B. oleracea var. capitata)、「冬鳥」と「228」が利用されました。プロトコルワークフローを図 1に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.キャベツの苗の準備

1. 48ウェルプラグトレイ(L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm)の丸い正方形の穴(D 4.5 cm x H 4.5 cm)に、市販の植物基質を使用して「フユドリ」と「228」のキャベツの種を播種します。種子を成長培地に約1cmの深さで埋め込みます。
2. キャベツの苗を22°Cの成長室で、16/8時間の明暗サイクルで育てます。光相中は、100 μmol ^m-2·^s-1 (白色蛍光管)の光強度を維持します。
3. 成長の2〜3週間後、葉肉のプロトプラストをさらに分離するために、2葉の段階でキャベツの苗を使用します。
   注:キャベツの苗の推奨サイズは、2枚目の本葉が完全に拡大されますが、3番目の本葉は拡大されず、その長さが1 cmより短い2葉の段階です(図2A)。キャベツの苗の発育段階を同期させるためには、「ふゆどり」の種子は成長速度が異なるため、「228」の種子よりも約2日早く播種する必要があります。この調整により、キャベツ植物間の望ましい段階での均一な成長と成熟が保証されます。

2.キャベツプロトプラストの分離

1. 各プロトプラスト単離の前に、12.5 mLの酵素溶液(表1)を調製します。
   1. 10 mM MES(pH 5.7)と0.6 Mのマンニトールを含む溶液を55°Cで予熱します。 1.5%セルラーゼR10と0.75%マセロチームR10を添加した後、溶液を55°Cで10分間温め続けます。
   2. 酵素溶液が室温(25°C)まで冷えた後、10 mMのCaCl₂ と0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えます。調製した酵素溶液を0.22μmシリンジフィルターを用いて9cmのシャーレにフィルター滅菌します。
      注:溶液を事前に加温すると、酵素の溶解度が高まり、プロテアーゼが不活性化されます。消化効果は、セルラーゼ酵素の種類によって異なります。セルラーゼR10とマセロチームR10の組み合わせは、キャベツのプロトプラストの単離に適しています。
2. 5〜8本のキャベツの苗から2番目の新しく拡大した本葉を集め、鋭利なカミソリの刃を使用して0.5〜1.0mmのストリップにスライスします。すぐに葉のストリップを新しく調製した酵素溶液に移します。
   注:適切な段階でキャベツから健康で指定された葉を選択することが重要です。2葉期のキャベツ苗から新たに拡大した2枚目の本葉は、最も高いプロトプラスト分離効率を提供します。過度に成熟した植物、子葉、または老化した葉は、プロトプラストの単離には推奨されません。5〜12枚の十分に拡大した本葉は、12.5mLの酵素溶液でキャベツのプロトプラストを成功裏に生成できます。プロトプラストの単離に必要な葉の数は、必要なプロトプラストの所望の量によって異なります。通常、5〜8枚の葉から得られるプロトプラストは、その後の実験手順に十分です。
3. 暗闇で30分間真空浸透した後(図2B)、キャベツの葉のストリップを酵素溶液(図2C)に室温でさらに4〜16時間浸しておきます。
   注:酵素消化時間はキャベツの品種によって異なる場合があり、特定の遺伝子型に応じて最適化する必要があります。例えば、「フユドリ」は「フユドリ」の葉が厚いため、「228時間」(4時間)に比べて消化時間が長くなります(16時間)。
4. プロトプラスト含有溶液を等量のW5溶液(2 mMのMES(pH 5.7)、154 mMのNaCl、125 mMのCaCl₂、5 mMのKCl、および5 mMのグルコース(調製については 表1 を参照)で希釈し、酵素消化を停止します。
5. プロトプラスト懸濁液を緩やかに旋回させるか、オービタルシェーカーを使用して放出します。細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーで50 mLのコニカルチューブにろ過します。
   注:単離されたプロトプラストは70μmの細胞ストレーナーを通過することができますが、未消化の植物破片はストレーナーによって保持され、その後懸濁液から除去されます。セルストレーナーは、洗浄後も再利用して75%エタノールで保持することができますが、セルストレーナーをW5溶液で十分にすすいで残留エタノールを除去する必要があります。
6. プロトプラスト溶液を150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。ペレット状にしたプロトプラストを、コニカルチューブの壁に沿って約1mLの流量で10mLのW5溶液を加えて、穏やかに洗浄^します。チューブを150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、この洗浄手順を再度繰り返して、酵素溶液が完全に除去されるようにします。
7. プロトプラストをW5溶液に再懸濁し、氷上に30分間置きます。アイスインキュベーション後、すべての上清が除去されるまで、ピペットで一度に1mLずつ上清を取り除きます。
8. 4 mMのMES(pH 5.7)、0.4 Mのマンニトール、および15 mMのMgCl₂ からなる氷で予冷したMMG溶液にプロトプラストを再懸濁します(調製については 表1 を参照)。
9. 血球計算盤でプロトプラスト濃度を測定し、MMG溶液を用いて最終濃度を4×10⁵ プロトプラスト・^mL-1 に調整します。

3. プロトプラストトランスフェクション

1. 総容量10 μLのプラスミド (5-10 μg) (補足ファイル1) と100 μLのプロトプラスト (4 x 10⁴ プロトプラスト) を混合し、氷上に10分間置きます。
   注:トランスフェクショングレードのプラスミド精製には、製造元の指示に従って市販のプラスミドキットを使用します。約4 x 10⁴ プロトプラストは、通常、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイで使用されます。より大規模な実験では、トランスフェクションに利用できるプロトプラストの量が多くなります。具体的には、10 μgのプラスミドをトランスフェクトした約2 x 10⁵ プロトプラストは、30%から40%の範囲のトランスフェクション効率が実証されています。
2. 40%ポリエチレングリコール4000(PEG4000)、0.1 MのCaCl₂、および0.2 Mのマンニトールを含む等量(110 μL)の新たに調製したPEG溶液(調製については表1を参照)をプロトプラスト溶液に同量(110 μL)加え、穏やかに混合します。
3. プロトプラスト混合物を室温で暗所で10分間インキュベートし、その後、440μLのW5溶液を加えて反応を終了します。
4. トランスフェクションしたプロトプラストを150 x g で2分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを750 μLの酸素富化W5溶液に再懸濁します。再懸濁したプロトプラストを、1% BSAでプレコートした6ウェル組織培養プレートに移します。
   注:細胞インキュベーションに使用するW5溶液は、エアストーンに接続された酸素濃縮器(~90%酸素)を使用して酸素で5分間泡立てる必要があります(図2D)。この酸素化プロセスの後、W5溶液中の最終的な溶存酸素濃度は7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 から29.18mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1、溶存酸素計で測定した値。トランスフェクションされたプロトプラストの再懸濁のためのW5溶液の量は、使用する組織細胞培養プレートの種類によって異なります。12ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートの場合、ウェル内の深さが深いため、インキュベーション中の低酸素ストレスを軽減するために、W5溶液の量を減らすことをお勧めします。BSAコーティングの場合、培養プレートの各ウェルに1 mLの1%BSA溶液を注入し、ウェルを10秒間コーティングしました。その後、BSA溶液を各ウェルから廃棄し、その後、ウェルにW5溶液を補充しました。この手順は、BSAを使用して一時的な非接着性表面を作成し、その後の実験ステップでプロトプラストが培養プレートのプラスチック表面に付着するのを効果的に防ぐことを目的としていました。

4. キャベツプロトプラストの低酸素治療

1. プロトプラストトランスフェクションの直後に化学的または物理的に誘発される低酸素治療を実施します。
   注:低酸素療法は、プロトプラストトランスフェクションの直後に適用することをお勧めします。.プロトプラストのインキュベーションを長期間行うと、その後の低酸素反応が減少する可能性があります。
   1. キャベツのプロトプラストに化学的に誘発された低酸素症の場合は、OxyFluor、EC-オキシラーゼ、および亜硫酸ナトリウムをW5プロトプラスト溶液に加えます。.
      注:W5に0.6単位・^mL-1 EC-オキシラーゼ、0.6単位・^mL-1 OxyFluor、および1 g・^mL-1 亜硫酸ナトリウムを使用した場合、調査した2種類のキャベツで BoADH1 および BoSUS1L プロモーター(図3A)を誘導し、プロトプラストの完全性を低く抑えることができる試験条件でした。
   2. 酸素を消費するバッグ誘発性低酸素症の場合は、3.5Lの嫌気性ジャーに2つの脱酸素パックを入れて、低酸素環境を作り出します。
2. 低酸素処理されたプロトプラストを回収するには、150 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 採取したプロトプラストを液体窒素で凍結し、その後のアッセイのために-80°Cの冷凍庫で保存します。

5. デュアルルシフェラーゼアッセイ

1. デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイは、製造元の指示に従って、わずかな変更を加えて実施します。
   1. キャベツのプロトプラストを50 μLの1x Passive Lysis Bufferに再懸濁し、ボルテックスで10秒間放置します。
   2. 破壊されたプロトプラストを氷上で10分間インキュベートし、10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、上清を回収します。
   3. 20 μLの細胞ライセートをマイクロプレートの各ウェルに加えます。100 μLのルシフェラーゼアッセイ試薬IIをウェルに分注し、マイクロプレートリーダーを使用してホタルルシフェラーゼ活性を測定します。
   4. 市販のアッセイ試薬100 μLを各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーを使用してRenillaルシフェラーゼ活性を測定します。

結果

この研究では、キャベツのプロトプラストを利用した一過性発現システムの開発に成功しました(ワークフローについては図1を参照)。プロトプラストは、セルラーゼ/マセロチーム消化と暗真空浸潤(図2B、C)を使用して、市販のキャベツ品種「ふゆどり」および「228」から適切なサイズの2〜3週齢のキャベツ本葉(図2A)から単離されました。インキュベーション中に水中のプロトプラストが経験する低酸素状態を緩和するために、酸素マシンに接続されたエアストーンバブラーを使用してW5溶液を酸素化しました(図2D)。このプロセスにより、W5溶液中の溶存酸素濃度が7.84mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1から29.18mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1 酸素が泡立ってから 5 分後。単離プロセス後、一晩の消化期間後のプロトプラストの収率は、「ふゆどり」で1.04 x 10⁷、「228」で4.00 x 10⁶ protoplasts·^g-1新鮮重量でした(図2E)。その後、GFPをレポーター遺伝子としてPEG媒介トランスフェクション法の形質転換効率を評価し、キャベツのプロトプラストトランスフェクション効率が両栽培品種で40%を超えていることを示し(図2F)、このシステムの生存性を確認しました。

さらに、キャベツの嫌気性呼吸応答遺伝子である BoADH1p::Lucおよび BoSUS1Lp::Lucベクター(図3A)のプロモーターコンストラクトをレポーターとしてキャベツプロトプラストに導入し、いくつかの処理の低酸素誘導効果を評価しました。また、この一過性発現モデルシステムには、さまざまな酸素調整処理も施されました。その結果、亜硫酸ナトリウムを除くすべての酸素捕捉処理が、キャベツのプロトプラストに低酸素反応をうまく誘発することが示されました(図3B)。具体的には、 BoADH1 のプロモーター活性は、EC-OxyraseおよびOxyFluorによる処理後の対照と比較して、それぞれ約2.6倍および3.2倍に増加し、特に、脱酸素パック処理では7.0倍以上増加しました(図3B)。同様に、 BoSUS1L プロモーター活性はEC-Oxyrase処理で約1.7倍、OxyFluor処理では1.8倍に上昇し、脱酸素パック処理では5.6倍以上の大幅な増加が見られました(図3B)。これらの結果から、脱酸素パックは、このキャベツプロトプラスト実験系において、低酸素環境を作り出すのに優れた効果を発揮することが示唆された。

図1:プロトプラスト単離ワークフローのグラフ表示。 この図は、キャベツの葉組織からプロトプラストを単離する段階的なプロセスを示しています。ワークフローは、手順を明確に理解できるように視覚的に描かれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:キャベツの葉組織からのプロトプラストの単離 (A)市販のキャベツ品種「ふゆどり」と「228」の推奨成長期の外観を示す。2葉期のキャベツの2番目に新しく完全に拡大した本葉(矢印で示されている)は、プロトプラストの分離のために選択されます。スケールバー:2cm.(B)キャベツの葉のストリップの真空浸透プロセスには真空ポンプとデシケーターが使用され、酵素消化の前に30分間の浸潤が行われます。(C)酵素消化中のキャベツの葉のストリップの状態が描かれています。葉組織の完全な消化には、合計4〜16時間が必要です。スケールバー:3cm.(D)写真は、エアストーンに接続された酸素濃縮器を使用して、W5溶液中の溶存酸素濃度を増加させていることを示しています。スケールバー:5cm.(E)「冬鳥」と「228」の両方のキャベツ品種から、新鮮重量(FW)1グラムあたり4.00 x 10^{を超える6} つの葉肉プロトプラストが得られ、顕微鏡で観察されました。スケールバー:200 μm. (F) 両方のキャベツ遺伝子型由来のプロトプラストのトランスフェクション効率は、構成的に発現したGFPレポーターを使用した場合、40%を超えることが示されています。スケールバー:200μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:酸素欠乏条件下でのキャベツプロトプラストの低酸素応答。 (A)低酸素応答遺伝子コンストラクトである BoADH1 および BoSUS1L プロモーターをレポーターとして利用し、キャベツプロトプラストの「ふゆどり」の低酸素応答を評価します。(B)合計5μgのレポータープラスミドを「フユドリ」キャベツプロトプラストにトランスフェクトし、酸素泡W5溶液中でインキュベートした後、低酸素処理に4時間曝露します。W5溶液にEC-オキシラーゼ(0.6単位・^mL-1)、オキシフルオール(0.6単位・^mL-1)、亜硫酸ナトリウム(1g・^mL-1)を添加することにより、インキュベーション中の酸素レベルが低下します。脱酸素剤パックの処理は、3.5Lの嫌気性ジャーに2つの脱酸素剤バッグを入れることによって行われます。「CK」グループは、低酸素治療を行わない対照群を表しています。処理後、プロトプラストを回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイを行います。各値は SD ±平均を表し、n = 4 です。異なる文字は、LSDの事後検定による一元配置ANOVAに基づく有意差(P < 0.05)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:酵素溶液、W5溶液、MMG溶液の調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:プロトプラストトランスフェクションのプラスミドの詳細。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、2つの市販のキャベツ品種からのプロトプラスト単離のための合理化された方法を提供します。この分析法の有効性は、主に、生存可能なプロトプラストの収量とプロトプラストトランスフェクションの効率という2つの重要な品質管理パラメーターを通じて評価されます。このプロトコルの実施により、4.00 x 10⁶ protoplasts·g⁻¹·両方のキャベツ品種から得られた葉肉組織のFW(図2E、F)。この収量は、ナス、カーネーション、サトウキビ、およびプロトプラストの収量が2.5 x 10⁶から1.4 x 10⁷ protoplasts·g⁻¹·FW^の6,7,9,17。これらの結果は、B. oleraceaの多様な遺伝的背景に対するこのプロトコルの適用可能性を示唆しています。

このプロトコルの成功は、いくつかの重要な要素にかかっています。最も重要なのは、適切な成長段階で健康なキャベツの苗から特定の葉を利用することです(図2A)。古い植物や不健康な植物を使用すると、プロトプラストの品質が低下する可能性があります。また、葉の組織を0.5〜1.0 mmのストリップに慎重にカットし、鈍い刃で押しつぶさないようにすることも重要です。4〜16時間続く酵素消化プロセスは、別の重要なステップです。消化期間が4時間未満の場合、消化が不完全になる可能性があり、消化時間が16時間を超えると細胞ストレスのリスクがあります。特に、「フユドリ」のように葉が厚い遺伝子型は、消化時間を延長することでプロトプラストの収量を最大化することが有益である可能性があります。対照的に、「228」は完全な消化にわずか4時間しか必要としませんでした。さらに、消化時間が広いため、実験スケジュールの柔軟性を高めることができます。例えば、4時間の消化では、プロトプラストの単離とその後の一過性アッセイを1日以内に完了させることができます。逆に、16時間の消化では、夕方に酵素消化を開始することができ、翌日に後続のステップを完了することができるため、このプロトコルを適用する際の利便性を高めることができます。さらに、プロトプラストは脆弱で機械的ストレスを受けやすいため、プロトプラスト単離プロセス全体を通じてプロトプラストを優しく取り扱うことが重要です。

洪水ストレスを表す嫌気性条件をシミュレートするために、このプロトコルでは、一般的な酸素排出剤と酸素消費バッグを使用して低酸素環境を作り出しました。システムの有効性を高めるために、酸素マシンを使用してW5溶液を酸素化し(図2D)、処理前のインキュベーション期間中にキャベツのプロトプラストのバックグラウンド低酸素応答シグナルを減らすことを目指しています。5分間の酸素化プロセスにより、溶存酸素レベルが7.84mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 から29.18mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1は、低酸素状態の緩和における顕著な効果を示しています。本研究で用いた酸素捕捉法の中で、脱酸素パックは優れた性能を示し、嫌気性応答コア遺伝子2種において最も高いプロモーター活性を誘導しました(図3)。さらに、この方法には拡張性という追加の利点があり、各細胞培養プレートに酸素捕捉剤を個別に塗布するのではなく、1つの嫌気性ジャーに酸素を消費するバッグを使用して複数のサンプルを同時に処理できます。要約すると、脱酸素パックは、低酸素条件下でのキャベツプロトプラストの応答を評価するのに適した便利で効果的なプラットフォームを提供します。

このプロトコルにはいくつかの利点がありますが、その限界、特にキャベツのプロトプラストのトランスフェクション効率が比較的控えめであることを認識することが重要です。この効率は シロイヌナズナ⁵で報告された90%には達していませんが、それでもプロモーター活性に関するその後の研究を成功させるには十分であることが証明されており(図3)、このシステムでの機能分析の大きな可能性を示しています。

主要な野菜作物としてのキャベツの世界的な重要性を考えると、このプロトコルを低酸素治療および遺伝子分析技術と統合することで、洪水条件下でのキャベツの調節メカニズムについてさらなる洞察を得ることが期待できます。このような洞察は、洪水に強いキャベツ品種の開発を加速させ、異常気象や洪水の増加に直面した重要なニーズに対処できる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)	PhytoTech Labs	M825	酵素溶液調製用
228キャベツ種子	Takii & Co., Ltd. (京都)
50 mL コニカルチューブ	SPL ライフサイエンス	50050	酵素溶液調製用
6ウェル組織培養プレート	Alpha Plus	16106	プロトプラストインキュベーション用
70 μm細胞ストレーナー	Sorfa	SCS701	プロトプラストろ過用
9cmシャーレ	Alpha Plus	16001	酵素消化用
嫌気性ジャー	HIMEDIA	嫌気性ジャー 3.5 L	低酸素治療用
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7906	W5溶液調製および培養プレートコーティング用
塩化カルシウム	J.T.Baker	131301	W5溶液およびPEG溶液調製
用 セルラーゼR10	ヤクルト		酵素溶液調製用
デシケーター	ターソン	402030	真空浸透用
D-Glucose	Bioshop	GLU501	W5溶液調製用
溶存酸素計	Thermo Scientific	Orion Star A223	酸素測定用
D-マンニトール	Sigma-Aldrich	M1902	酵素溶液、PEG溶液、MMG溶液調製用
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	プロメガ	E1960	デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
用 EC-オキシラーゼ	オキシラーゼ株式会社	EC-0005	低酸素治療用
冬鳥キャベツの種	小林タネ株式会社 (加古川市)
高速冷蔵遠心分離機	日立	CR21GIII	プロトプラスト収穫用
マセロチーム R10	ヤクルト		酵素溶液調製
用 塩化マグネシウム	アルファ Aesar	12315	MMG溶液調製用
マイクロ遠心分離機	日立	CT15RE	プロトプラスト収穫用
マイクロプレート	グライナー	655075	デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ用
マイクロプレートリーダー	分子デバイス	SpectraMax Mini	用デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
Millex 0.22 μmシリンジフィルター	メルク	SLGP033RS	酵素溶液調製用
オイルフリー真空ポンプ	ロッカー	ロッカー300	真空浸透用
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	低酸素治療用
脱酸素パック	三菱ガス化学	AnaeroPack, MGCC1	低酸素治療用
酸素濃縮器	UTMOST PERFECT	AII-X	W5溶液中の酸素バブリング用
植物基質	Klasmann-Deilmann	Potgrond H基質	キャベツ苗調製用
プラスミドミディキット	QIAGEN	12145	トランスフェクショングレードのプラスミドDNAの精製
ポリエチレングリコール4000	Fluka	81240	プロトプラストトランスフェクション用
塩化カリウム	J.T.Baker	304001	W5溶液調製用
カミソリ刃	ジレット		キャベツ葉ストリップ調製用
塩化ナトリウム	Bioshop	SOD002	W5溶液調製用
亜硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S0505	低酸素治療用
ウォーターバス	Yihder	BU-240D	酵素溶液調製用