非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤の定量的構造活性相関、活性予測、分子動力学

Summary

この研究では、 インシリコ 戦略を使用して、列挙されたエトラビリンをHIVの有望な治療薬として特定しました。分子間相互作用とダイナミクスに関する私たちの発見は、可能なHIV治療の代替として新しいNNRTIの合理的な設計を支持しています。

Abstract

HIV-1薬剤耐性の発生率の増加は、特に南部アフリカにおいて、併用抗レトロウイルス療法の有効性に課題をもたらしています。非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(NNNTI)に対する耐性の発現は、抗レトロウイルス療法の長期的な成功を脅かしています。2019年、抗菌薬耐性は、世界で推定127万人の死亡を直接占めました。この研究では、NNTRI薬とその誘導体を調査するために インシリコ アプローチを採用しました。使用された手法には、密度汎関数理論の計算、分子ドッキング、計数、定量的構造活性相関(QSAR)分析、分子動力学シミュレーション(MDS)、一般化ボルン法と表面積法による分子力学が含まれていました。この解析では、さまざまなピリミジン誘導体と6種類のNNRTI薬剤に焦点を当て、HIV-1タンパク質(PDBコード1HQU)との相互作用を調べました。

調査中の6つのNNRTIの生物学的活性を予測するために、QSARモデルが開発されました。94種類のピリミジン誘導体を用いたQSARモデルは、R² OF.0.822、Q² 0.815を達成し、高い予測精度を示しました。

MDSは、さまざまなリガンドと新たに開発された代替品の安定性を評価するために実施され、200ナノ秒のシミュレーション時間にわたってタンパク質の活性部位に結合したままであることを確認しました。エトラビリンは約4.5 Åの二乗平均平方根偏差(RMSD)変動を示し、列挙された誘導体は3.5 ÅのRMSD変動を示しました。分子ドッキング、MDS、および自由エネルギー計算を通じて、列挙されたエトラビリンは最高の性能を示し、活性値は7.373、ドッキングスコアは-10.517 kcal/molでした。さらに、列挙されたエトラビリンの結合の計算された自由エネルギーは-89.684 kcal / molであり、調査中の他のリガンドを上回っていました。大幅な改善は、改変されたエトラビリンが抗レトロウイルス療法の新規薬剤として有望な可能性を秘めていることを示唆しています。

得られた低いRMSD値、増強されたアミノ酸相互作用、および最も高い結合自由エネルギーは、列挙されたエトラビリンがHIV / AIDS治療の実行可能な代替手段として機能する可能性があることを示しています。

Introduction

治療の目覚ましい進歩にもかかわらず、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)によって引き起こされる後天性免疫不全症候群(AIDS)の深刻な世界的な健康上の脅威は、依然として根強い脅威^です1。逆転写酵素阻害剤(RTI)として知られる抗レトロウイルス薬は、HIV感染の治療に使用されます。逆転写酵素は、レトロウイルスの複製に必須のウイルス性デオキシリボ核酸(DNA)ポリメラーゼ酵素であり、逆転写酵素阻害剤(RTI)によって阻害されます。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)および非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(NNNRTIs)は、主要なRTI^です2。

HIVの標準治療薬として登場したのは、さまざまな抗ウイルス薬を組み合わせた高活性抗レトロウイルス療法(HAART)で、エイズの蔓延を効果的に抑制し、かつては致命的だったこの病気を治療可能な慢性疾患に変えています³。HIV-1のNNRTIは、現在、HAARTレジメン⁴の重要な部分を占めています。薬剤耐性(AMR)は、世界で最も重大な健康上の脅威の一つであり、推定127万人が死亡しています⁵。そのため、AMRのトラブル解決と新規抗菌薬の同定が急務となっています。世界保健機関(WHO)によると、AMRは世界の多くの地域で憂慮すべきレベルに達しています。

これは、食料安全保障、経済成長、健康安全保障を損なうとともに、社会的・経済的不平等を助長するなど、持続可能な開発目標の達成に深刻なリスク^{をもたらします6。}薬剤耐性ウイルスの蔓延は、HIVと戦うために設計された抗レトロウイルス薬でさえも増加しています。最近の統計によると、2022年末の時点で、世界中で約3,000万人が抗レトロウイルス療法を受けています^7。

WHOは30の調査を実施し、そのうち21の調査で、第一選択の抗レトロウイルス療法を開始した個人の10%以上がネビラピンまたはエファビレンツ⁸に耐性を持っていたことを発見しました。さらに、以前に抗レトロウイルス薬に曝露したことがある人は、曝露していない人に比べてNNRTIに対する耐性を持つ可能性が最大3倍高くなります⁹。研究によると、新たにHIVと診断された生後18か月未満の乳児のかなりの数が、薬剤耐性株の高い割合を示したことが明らかになりました^10,11。驚くべきことに、彼らのほぼ半数は、治療を開始する前から-(NNRTI)耐性株を持っていました。これらの知見は、革新的なHIV治療法をデザインするための研究を迅速化する必要性を強調している。

薬剤耐性株の発生と長期使用による望ましくない副作用は、NNRTIの臨床使用に避けられない課題をもたらしています¹²。併用抗レトロウイルス療法(cART)を開始すると、有害な副作用の可能性にもかかわらず、HIV陽性者の平均余命が延びます。これらの副作用には、脂肪異栄養症、高脂血症、骨密度の低下、2型糖尿病につながる血糖値の上昇、高血圧、脳卒中のリスクの増加、肥満に関連する問題など、非感染性疾患を発症するリスクが含まれます¹³。HIV感染の初期段階における早期診断と適切な医療への迅速なアクセスは、臨床的および公的観点から大きな利点を提供します。ARTのタイムリーな開始と日和見感染症に対する予防は、HIV関連の病気と死亡率の顕著な減少につながります。

ARTの使用は、循環するHIVリボ核酸のレベルを低下させることにより、HIVの二次感染の可能性の低下にも寄与する可能性があります。さらに、他の性感染症や重複感染の治療に取り組むことで、同様にさらなるHIV感染の可能性を減らすことができる¹⁴。NNRTIは、HIVのアロステリック領域または部位に結合することによりRTと相互作用する阻害剤の任意の治療クラスの1つです。このタイプの阻害は、NNRTIが基質の活性部位ではなく外部に結合するため、一般に非競合阻害剤として知られています。この効果により、基質結合部位のコンフォメーションが変化し、標準基質の結合が妨げられ、鎖の早期終了につながります。NRTIと比較して毒性が低く、構造が単純で、プロテアーゼ阻害剤よりもバイオアベイラビリティが向上し、選択性が優れているため、NNRTIは最も魅力的なHIV阻害剤となっています¹⁵。したがって、新規NNRTIの合成と設計は、薬物動態の観点から重要である^16,17。

NNRTIは、その強力な有効性と低い毒性により、HIV/AIDS治療に不可欠です。しかし、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツなどの初期のNNRTIは、NNRTI結合部位¹⁸のウイルス変異による耐性に遭遇します。ジアリールピリミジン(DAPY)ファミリーの一部であるこれらの薬剤は、初期のNNRTIに耐性を持つものを含むさまざまなNNRTI株に対して強力な活性を示します¹⁹、これはおそらくその分子柔軟性とHIV-1に対する高い耐性バリアによるものです^20,21。その成功にもかかわらず、HIV-1 RTの高い変異率と内因性プルーフリーディング活性の欠如は、エトラビリンとリルピビリンを使用する患者に新たな耐性プロファイルをもたらしました^22,23。これらのウイルス変異は、初期のNNRTI薬に関連するものと同様に、互いに異なります²⁴。50種類以上の構造的に多様な化合物がNNRTIとして同定されています。注目すべきは、6つのNNRTIがHIV-1の治療薬として承認を得ていることです。これらの承認された薬剤には、ネビラピン(NVP)、デラビルジン(DLV)、エファビレンツ(EFV)、エトラビリン(ETR)、リルピビリン(RPV)、およびドラビリン(DOR)が含まれます。図1は、これら6つの承認されたNNRTI薬²⁵の化学構造を示す。

最近の研究²⁶では、DFT計算と分子ドッキングにより、ロバスタチンとシンバスタチンが抗コロナウイルス剤としての可能性を示していることが示唆されています。バーチャルスクリーニングにより、エファビレンツ足場に類似した5つの新しい候補分子が同定され、COVID-19メインプロテアーゼの活性ポケットに優れた結合親和性が認められました。

Soltan et ^al.27 は、FDA 承認薬によるフラグメントベースの戦略を用いて化学誘導体を設計することにより、HIV RT への結合能を改善するための新規分子の同定について同様の研究を実施しました。彼らは特に、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、およびリルピビリンの構造を基礎的な足場として活用しました。これらの誘導体の薬物類似性は、Swiss-ADMEを通じて評価され、続いてそれらを関連する結晶構造にドッキングしました。この研究は、親の足場と比較して優れた結合親和性を示す化合物の選択で終了し、特に第2世代のNNRTIであるエトラビリンとリルピビリンから設計された誘導体でより顕著な改善が見られました。例えば、誘導体RPV01およびRPV15は、リルピビリンよりもドッキングエネルギー値の有意な増加を示し、HIV RTの野生型と変異型の両方を標的とする潜在的な有用性を示しています。

ムルゲサンと共同研究者²⁸ は、HIV治療の有効性を高め、耐性を最小限に抑えるためのさまざまな医薬品化学アプローチを提案した研究を実施しました。この研究では、分子ハイブリダイゼーション、バイオイソステリック置換、およびハイスループットスクリーニングが採用されました。彼らの研究では、HIVの野生型株と薬剤耐性株の両方に対して高い効力を持つ新しいNNRTI足場を特定することに成功しました。彼らは、優れた選択性と低毒性を示すDAPY誘導体を開発し、一部の化合物はナノモル濃度で効果的な阻害を示しました。

最近では、 インシリコ 研究と並行して計算ツールを使用することが、薬物の量子化学的特性の実用的な分析により人気を博しています²⁹。本研究では、コンピュータ支援型創薬、密度汎関数理論、定性的構造活性相関、分子動力学などを用いて、強力なNNRTIを発見しました。

Protocol

1. 計算の詳細—タンパク質調製

1. モニター画面のウィンドウアイコンをクリックし、[すべてのアプリ]をクリックします。下にスクロールしてSchrodingerフォルダに移動し、フォルダを開き、図2Bに示すMaestroアイコンをクリックし、図2Bに示すように開くを選択してソフトウェアを起動します。
2. 選択したタンパク質構造を取得するには、ソフトウェアの[ファイル]タブボタンに移動します。ポップアップする短いメニューから、図 3A に示すように [Get PDB] を選択し、図 3B に示すように、選択した PDB コードをテキスト ボックスに入力します。ダウンロードボタンをクリックすると、選択したPDBファイルがプロジェクトウィンドウに表示されます。
3. または、検索ボックスにタンパク質データベースの識別コード(PDB ID)を入力して、選択したタンパク質をProtein Data Bankからローカルコンピューターにダウンロードし、[ダウンロード]をクリックしてPDBファイルをローカルコンピューターにダウンロードします。「ファイル」タブに移動し、「構造のインポート」オプションを選択します。インポート インターフェイスから、図 3C に示すようにダウンロードした PDB ファイルを見つけ、図 3D に示すように [インポート] ボタンを選択します。
   注:タンパク質構造は、図4に示すように、別のウィンドウで3D構造として開きます。
4. ソフトウェアの右上に移動し、タスクオプションを選択して、検索バーにタンパク質調製物と入力します。右側のディスプレイで[Protein Preparation Workflow]をクリックします(図 5A を参照)。
5. ポップアップ表示されるタンパク質調製ワークフローウィンドウで、保存するファイル名としてジョブ名を書き込み、図5Bに示すように、右下隅にある緑色の[実行]ボタンをクリックします。
6. ジョブの実行を監視するには、図 5C に示すように、右上隅の [ジョブ] ボタンをクリックします。
7. 調製したタンパク質を選択して右クリックし、図5Dに示すようにスプリットリガンドを選択します。配位子、水、その他に分割することを選択します。これは、タンパク質成分をワークスペースナビゲーターの独立したエントリとして持つためです

2. リガンド調製

1. 検索バーに選択した化合物の名前を入力して、PubChemデータベース³⁰から目的の化合物をダウンロードする。構造を通過し、3 次元 (3D) 構造を選択します。右上のウィンドウで[ダウンロード]をクリックして、構造座標を構造化データファイル(SDF)としてダウンロードします。3D 構造が使用できない場合は、2D 構造をダウンロードし、他のツールを使用して 2D 構造から 3D 構造を生成します。
2. SchrodingerのFile タブをクリックし、Import Structuresを選択します( 図6Aを参照)。ストラクチャーがSDFファイル形式で保存されているファイルの場所に移動し、準備するコンパウンドをロードします。
3. Schrodingerソフトウェアの右上隅にある[タスク]を選択します。検索バーに「LigPrep」と入力し、左側の右側のウィンドウで [LigPrep] を選択します (図 6B を参照)。
4. 「次から構造を使用」を選択して、「ワークスペース」テーブルまたは「プロジェクト」テーブルからファイルを選択します。図 6C に示すように、LigPrep ウィンドウから優先オプションを選択し、ファイルをローカル・コンピューターに保存し、「run」をクリックしてリガンド調製のためのジョブをサブミットします。

3. リガンドの形状と最適化

1. ダウンロードした構造のジオメトリ最適化のためにソフトウェア³¹ を開きます。[ ファイル ] タブ (図 7A) に移動し、[ 開く ] を選択して、ダウンロードした SDF ファイルを PubChem データベースから選択します。
   注:ファイルはメインウィンドウにロードされます。もう一方の紫色のウィンドウをクリックして、同じ化合物を視覚化します。実装されたすべての設定は、紫色のウィンドウに結果を表示します。
2. [計算]タブに移動し、[ガウス計算設定]タブを選択します。図 7B に示す「Job type」タブにナビゲートし、「Optimization」または「Opt+Freq」を選択します。
   注:原子または化合物の(サイズ)数に応じて、最初に最適化し、次に周波数を最適化します。コンパウンドが小さい場合は、Opt+Freqを実行します。分子が大きければ大きいほど、Opt+Freqの両方を実行するのにかかる時間は、Optimizationの後にFrequencyを実行するのに比べて長くなります。
3. [メソッド] タブに移動し、量子化学メソッドを選択し、各セクションのドロップダウン矢印から、選択した関数、基底セット、電荷、およびスピンの Kohn–Sham グローバル ハイブリッド交換相関密度を選択します。
4. タイトルに移動し、調査中の化合物の名前を指定します。
5. [リンク 0] タブに移動し、選択した [メモリ制限] と共有プロセッサを指定します。図 7C に示すように、[Full path] ボックスのチェックを外します。
6. 下部にある「Edit 」ボタンをクリックして、 図 3C に示すように、Gaussian 入力ファイルを保存します。ファイルを、選択したファイル名で Gaussian ジョブ・ファイル (gjf) として優先ロケーションに保存します。
   注:ガウス入力ファイルを保存すると、ファイルの内容がメモ帳に表示されるポップアップウィンドウが表示されます。設定オプションでは利用できなかった料金や機能の変更などのオプションを含む、ファイルの内容を編集します。準備されたGaussianジョブファイルは、ローカルコンピュータ経由で最適化と周波数計算を実行するための送信入力ファイルとして使用されます。
   続いて、MN15-L官能基³² および6-31++G(d,p)基底セット³³を用いて、これらの構造の幾何学的最適化を行った。ただし、最適化および周波数プロセスの実行で問題が発生した場合は、HPCを使用して作業を提出することができます。

4. レセプターグリッドの生成

1. Tasksに移動し、receptor grid generation³⁴を選択する。図8Aに示す受容体グリッド生成インターフェースは、コア結晶リガンドが結合しているタンパク質の活性部位を特定します。[Pick]をクリックしてリガンドを特定し、図8Bに示すポップアップトップ通知から共結晶化リガンドが存在するかどうかを確認します。
2. ワークスペースから リガンド および/または 残基 を選択すると、選択した目的の化合物がワークスペースで青色のハイライト表示されます。
3. レセプターグリッド生成パネルの設定タブを選択して、 グリッドボックスのサイズを設定します。グリッドボックスのデフォルトサイズは、10 Å x 10 X 10 Åです。 「グリッドボックス 」タブでボックスの寸法を変更するには、必要な値を直接入力するか、ワークスペース内のボックスのサイズを手動で変更します。
   メモ: または、必要に応じて、図 8C に示すように [詳細設定] タブから追加のパラメータを設定します。すべての設定を確認して、正確性を確保します。
4. [実行] をクリックして、グリッドの生成を開始します。完了したら、生成されたグリッドファイルを後続のドッキングシミュレーション用に保存します。ジョブが完了すると、図 8D に示すように、通知メッセージが表示されます。

5.分子ドッキング

1. 図9Aに示すように、Tasks、Docking³⁵、およびLigand Docking(glid docking)に移動して、タンパク質と調製したリガンドをロードします。
2. 上記の手順4.1のグリッドファイルをロードし、 図9Bの「Use ligand」オプションを使用してワークスペースからリガンドを選択します。
3. 図 9 C に示す設定タブから、優先するドッキング精度の方法を選択します (デフォルトのドッキング精度は標準精度 (SP)) です。
4. 力場をOPLS4に設定して、分子相互作用を正確にモデル化します。Constraintsタブで制約条件(水素結合など)を設定します。
5. すべての設定を確認し、ドッキング ジョブまたはファイルを保存します。 [実行 ] をクリックして、ドッキング プロセスを開始します。
6. ジョブが完了したことを示す通知が表示され、ドッキング結果のために Project テーブルが開きます。バインディングのポーズ、スコア、インタラクションを調べます。

6. 2D-QSARモデル生成

1. KNIME コミュニティハブの Web ページに移動し、検索バーで AutoQsar を検索します。図 10A に示す 2 番目の AutoQsar エントリーを選択します。
2. download ワークフロー アイコンをクリックし、図 10B に示すポップアップメニューで download workflow を選択します。ワークフローをローカル コンピューターに保存します。
3. KNIME³⁶ がインストールされていることを確認し、ローカルコンピュータから開きます。 標準的な微笑み、構造の名前、活性/ IC₅₀ の値 (マイクロモル)、および-log(活性/ IC)または 任意の化学記述子を含むスプレッドシートをコンパイルします。ファイルをコンマ区切り値 (CSV) 形式でローカル コンピューターに保存します。
4. [ファイル]に移動し、AutoQSAR^{ワークフロー37}をインポートします。ポップアップ・ウィンドウで、「Import KNIME Workflow」をクリックして、ダウンロードした AutoQSAR ワークフローを選択し (図 10C を参照)、「Open |次へ |終了。
5. AutoQsar ワークフローは、左上の KNIME Explorer ウィンドウに表示されます。ワークフローをダブルクリックして、ワークフローをメインウィンドウに移動します。
6. 分子リーダー(MAEへ)アイコンをダブルクリックし、設定タブからファイルの追加をクリックして、データ入力データまたはパラメータを含むワークシートを追加します。
7. [メモリ ポリシー] タブを選択し、[テーブルをディスクに書き込む] |わかりました。
8. 「Extract Properties」ボタンを右クリックし、「Configure」を選択します(図10Dを参照)。
9. 選択した分子特性または化学的特性を 除外 ウィンドウから選択して、 含める ウィンドウにフィルタリングします。 [適用] をクリックします。
10. AutoQSAR Build Modelを右クリックし、Configureをクリックします。QSARモデル名をポップアップダイアログに入力します。
11. 設定ボタンをクリックし、含まれているものから適合するプロパティを選択します。ランダムなトレーニング セット値 (85%:15% など) と、保持するいくつかのモデルを選択します。[適用] をクリックします。
12. 下部の Molecule Reader を右クリックし、[ Configure]を選択します。試験するリガンドを含む準備済みのCSV Excelファイルから試験リガンドを読み込みます。
13. [抽出プロパティ] を右クリックし、設定を任意の場所に設定します。
14. 上部の Molecule Reader を右クリックし、 executeを選択します。
    注意: オレンジ色の点はプロセスが開始されたことを示し、緑色のライトはプロセスが正常に実行されたことを示します。次のステップは、すべてのノードが正常に実行されるまで続行されます。
15. .2つ目のMolecule Reader for Test ligandsを実行します。
16. すべてのノードが正常に実行された後のテストとトレーニングセットの結果を含むzipフォルダを保存します。
    注:SD - 標準偏差、R2 - 実際のアクティビティ値と予測されたアクティビティ値のトレーニングセットの相関関係、Q2 - テストセットの実際のアクティビティと予測されたアクティビティの相関関係など、クロスバリデーションの結果に基づいて、最もパフォーマンスの高いモデルを選択します。
17. スコアラーまたは統計ノードを使用してモデルのパフォーマンスを評価することにより、ワークフローのパフォーマンスを評価します。
18. 結果を解釈するには、 機能の重要度を使用してメイン記述子またはキー記述子を特定します。結果を散布図または棒グラフとして視覚化し、パフォーマンスと記述子の関係を判断します。ワークフローを保存し、結果データ、予測、ビジュアライゼーションを散布図やCSVファイルとしてエクスポートします。

7. 列挙

1. [タスク] に移動し、図 11A に示すように Ligand Designer を検索します。
2. ドッキングされたタンパク質とリガンド複合体のペアをワークスペースナビゲーターから選択します。リガンド デザイナー ウィンドウで [ワークスペースの分析] をクリックします。新しいリガンドを生成および評価するには、図11Bに示すように、表示されるワークフローのリストからIsostereスキャンを選択します。これは、分子の既存の部分にフラグメントを追加することでリガンドを拡張する成長方法を意味します。
3. enumeration オプションを設定したら、表示される Isostere Scanning 通知ウィンドウで enumerate をクリックします。同じタンパク質と異なるリガンドについて、すべてのリガンドが同じプロセスを実行するまで、ステップ6.2を繰り返します。 Projects Tableから列挙されたリガンドを確認します。
4. 設計した配位子をエクスポートして構造を保存します。
   注: 列挙方法では、シミュレーションの完了時にドッキング スコアのセットが生成されました。
5. ドッキングスコアが負の化合物を列挙したものを個別に選択し、セクション4で概説したドッキング手順を使用して再ドッキングします。

8.ホモとルモ

1. ソフトウェアを開き、最適化されたリガンドをGaussianジョブファイル形式でアップロードします。
2. ツールに移動し、図 12A に示すように、赤と緑のドットで [MO エディタ] を選択します。
   注: 列挙方法では、シミュレーションの完了時にドッキング スコアのセットが生成されました。
3. MO エディタ パネルの method で、図 12B に示すように、既存の Chk または FChk ファイルから Load Mos をクリックして FChk ファイルをロードします。
4. 「visualize」タブ | update をクリックします。図 12D に示すように、現在のサーフェスが表示されるまで ~10 秒待ちます。
5. 強調表示された黄色の図の横にある2つの チェックボックス のいずれかをクリックして、 HOMO または LUMO³⁸ サーフェスを選択して、その隣のウィンドウに表示します。
6. 紫色の背景を右クリックして、[ ファイル]を選択します。[ 画像ファイルの保存 ]をクリックして、 図12Eに示すように、現在の表面の画像を保存します。
7. 紫色の背景を右クリックして、[表示]を選択します。図 12F に示すように、[一般] タブで背景を、[表面] タブで表面の透明度を、[テキスト] タブでフォント サイズと色、[分子] タブで画像品質と表面の優先レイアウトを変更する表示形式を選択します。
8. または、キューブ ファイルを生成し、GaussView で FChk ファイルをアップロードします。 Results タブに移動し、 Surfaces/Contoursを選択します。 キューブアクション をクリックし、キューブをロードします。 Surface Actions をクリックし、新しいサーフェスを選択します。手順 8.7 を繰り返して、サーフェスを編集します。
   注:HOMOとLUMO³⁹の間のエネルギーギャップ(LUMOとHOMOの差)が小さいほど、分子の反応性が高くなると予想されます。エネルギーギャップ(E_ギャップ)を各分子の式1を用いて計算します。
   

9. 分子動力学シミュレーション—システムの準備と最小化

1. Schrodinger Suiteがローカルコンピュータにインストールされていることを確認し、タンパク質-リガンド複合体構造をワークスペース⁴⁰にロードする。
2. [タスク]ボタンをクリックして、[Desmond System Builder⁴¹]を選択します。システムビルダーパネルで、[ソルベーション]タブを選択し、タンパク質-リガンド複合体に適した[Predefined solvent model](図 13A)、[Box shape](図 13B)、[Box size](ボックスサイズの計算方法)(図 13C⁴²)を選択します。
3. [イオン]タブを選択し、[再計算]をクリックして、対イオンを追加し、目的の塩濃度を設定することでシステムを中和します。
4. 力場として選択したOPLS43,44を選択します。
5. ジョブに適切な名前を付け、ジョブ ファイルをローカル コンピューターに保存します。 [実行 ] をクリックして、準備のためにジョブを送信します。
   注: ジョブ名が保存されていることを確認してください。詳細な名前を使用します。
6. 平衡化と生産
7. ワークスペースでプロジェクトを表示する システムの準備後。Workspace Navigator からタンパク質-リガンド複合体を選択し、タスクをナビゲートして、 分子動力学 (Desmond) を選択します。
8. リガンド-タンパク質複合体を分子動力学パネルのワークスペースからロードします。シミュレーションタブから目的のシミュレーションタイムラインを選択します。アンサンブル クラス⁴⁵ として NPT を選択します。
9. ジョブに適切な名前を付け、ジョブを書き出します。 Close をクリックして、分子動力学ウィンドウを終了します。
10. 分子動力学法の準備のために書き出されたジョブをローカルターミナル経由で送信します。完了時に、完了したジョブを開き、初期設定されたシミュレーションタイムラインから所望のシミュレーション時間⁴⁵(例えば、100ns、200ns)までシミュレーション時間を継続します。
    注:他のタンパク質-リガンド複合体について手順9を繰り返します。
    1. 完了したジョブを Schrodinger Maestro ソフトウェアで開き、別々のジョブが実行された場合は、異なるシミュレーション時間枠をマージします。 [タスク ]ボタンに移動し、 シミュレーションインタラクション図を選択します。マージされたファイルまたは単一のファイルをロードして、軌跡を視覚化します。
11. 視覚化とその他の詳細な出力結果を含むレポートを生成します。

10. 一般化ボルンと表面積を持つ分子力学 (MM-GBSA)

1. 軌道ファイルを開き、軌道を再生します。タンパク質-リガンド複合体が平衡化している場所を視覚化し、フレーム数に注意してください。処理のために端末を介してジョブを送信します。
2. 他のタンパク質-リガンド複合体について、セクション9(タンパク質分子動力学シミュレーションの準備)を繰り返します。
3. 出力ファイルの内容を分類/表示して、生成された結果を分析します。ΔG平均を読み取り、タンパク質-リガンド複合体の結合自由エネルギーを取得します。
4. CSV ファイルをダウンロードして、さまざまな分子内分子の寄与を視覚化します。
5. 錯体の自由結合エネルギーを計算するには、結合エネルギー(ΔG_結合)、コロンビック溶媒和モデル(ΔG_結合 Coulumb)、非極性溶媒和項(ΔG_結合 Lipo)、水素結合補正(ΔG_結合 Hbond)、共有結合結合(ΔG_結合 共有結合)、π-π充填補正(ΔG_結合 パッキング)、一般化ボルン静電溶媒和エネルギー(ΔG_結合 )など、さまざまな熱力学および脱溶媒和パラメータに注意してくださいsol GB)、ファンデルワールス相互作用(ΔG_結合 vdW)など、さまざまな相互作用が考えられます。
   1. 式 2 に示すように、MD シミュレーション内の各スナップショットで決定された ΔG_バインド値を平均化して、最終的な ΔGbind を導き出します。

Results

受容体グリッド生成と分子ドッキング

Maestroの受容体グリッド生成ツールを使用して、その後のドッキングのための結合部位を適切に特徴付けました。共結晶化した配位子は、グリッドを定義するために使用されました。分子ドッキング用のSP精密グライドセッティングを使用しました。Schrödinger MaestroのLigPrepツールは、OPLS4力場を使用してドッキングするためのリガンドを準備するために使用されました。分子動力学シミュレーションでは、OPLS4力場がデズモンドで使用されました。力場は古典的な分子シミュレーションの基本であり、その精度は創薬におけるタンパク質-リガンド結合シミュレーションの品質にとって重要です。OPLS4では、チャージとパラメータの割り当てはSchrödinger Maestroを使用して完了しました。OPLS4パラメータの適用により、OPLS2005のデフォルトパラメータと比較して、エネルギー比較と幾何学的比較の両方で大幅な改善が見られました。

これには、HIV-1標的タンパク質に親和性があることが知られている特定のリガンドをドッキングすることが必要であり、リガンド分子と受容体残基との間の相互作用の徹底的な分析が可能になりました。 表 1 は、QSAR モデリングの複合分類の概要を示しています。

HBY561をドッキングすると、再ドッキングされたリガンドを結晶性タンパク質1HQUの活性部位に見出されたものと比較することにより、ドッキングプロトコルを評価しました。ドッキングされ結晶化したHBY561の構造は、補足ファイル1(補足図S1および補足図S2)に記載されています。ドッキングされた姿勢と参照構造の間の類似性を評価するために、2.0 Å 未満の二乗平均平方根偏差 (RMSD) 値は、信頼性の高いドッキング結果の基準として広く認識されています。このしきい値は、予測された構造が実験データと密接に一致していることを示します。この研究では、参照構造とドッキングポーズを比較した場合、リガンドは1.27 ÅのRMSDを示しました(補足図S3に赤で示されています)。これは、ドッキングプロトコルがこの作業に十分であることを示し、その結果、すべてのリガンドが同じ設定を使用してドッキングされました。表2に示したドッキングスコアを調べると、エファビレンツとエトラビリンは、共結晶リガンドHBY561(-9.242 eV)のドッキングスコアと比較して、-10.432 eVと-9.647 eVで最も好ましいスコアを示しています。補足ファイル1の補足図S4は、元のHIV-1タンパク質とクリスタルリガンド、エトラビリン、およびエファビレンツとの間のリガンド相互作用図を示しています。

水素結合、π-πスタッキング、および疎水性相互作用は、結合に寄与する主要な力です。HBY561と指定されたタンパク質1HQUとの間に水素結合の特異的な例が現れ、アミノ酸残基LYS101が明示的に関与していました。この結合パターンは、 図14に示すように、配位子EfavirenzとEtravirineで行われた観察結果を反映しています。

さらに、HBY561、エトラビリン、エファビレンツが関与するいくつかのタンパク質位置での結合には、分子間力、水素結合、π-πスタッキングに加えて、疎水性相互作用が不可欠でした。エファビレンツでは、TYR318と芳香環との間にπ-πのスタッキングが観察されました。水素結合とπ-πスタッキングの両方が、リガンドとタンパク質との間の結合結合を維持するために不可欠でした。HBY_561、ネビラピン、ドラビリン、エファビレンツ、およびエトラビリンのリガンド相互作用図は、 補足ファイル1-補足図S5に示されています。

これらの分子間力は、タンパク質とリガンドの相互作用に影響を与え、HIV-1のAMRを低下させる医薬品の開発に不可欠です。結合親和性、特異性、および作用機序を強化する役割は、ウイルスを効果的に標的にして阻害できる薬剤の設計に役立ち、それによってHIV-1治療の文脈で高まる抗菌薬耐性の懸念に対処します。

2D-QSARデータセットの準備

トレーニングとテストのフェーズには、94の化合物が含まれていました。これらの化合物は4つのクラスに分類され、それぞれが試験された特定のタンパク質に関連するリガンドを表しています。トレーニングプロセスでは、アクティビティ、HOMO、LUMOの3つの記述子として、KNIME AutoQSARワークフローを利用しました。

2D-QSAR生成

94分子すべてに、実験データによって活性値が決定されました(補足表S1)。QSARモデルから生成された結果を 表3に示します。 補足表S2 のクラス1化合物をQSARモデリングに使用し、追加されたAr基とそれぞれの活性値を示しました。4つのクラスの結果から、最高スコアの0.8223、^R2 の0.815、 ^Q2 の0.8182が達成されたことが示され、これはクラス1に相当します。これは、R² が 1 に近く、Q² が 0.7⁴⁶ より大きいことを目標とする前の基準と一致します。そのため、QSARモデルの学習にはクラス1を選択しました。クラス3とクラス4のモデルは、それぞれ0.8172と0.6673という優れた相関値^R2 を示しましたが、クラス1の性能とは一致しませんでした。

Q² スコア 0.8223 と R² の差が 0.3⁴⁷ 以下であるという基準に従って、提案された QSAR モデルの安定性をさらに検証するために、相互相関が行われました。クラス 1 の提案モデルには 0.0038 の差があります。観測された活動と予測された活動を示す散布図を 図 15 に示します。

HOMO-LUMOのエネルギーギャップ

最も低い空いている分子軌道と最も高い占有分子軌道との間のエネルギーギャップの決定は、一般にHOMO-LUMOエネルギーギャップとして知られており、6つのNNRTI化合物の文脈における分子の化学反応性と速度論的安定性を特徴付ける上で重要な役割を果たします。フロンティア分子軌道は、HIVタンパク質の結合部位との電荷移動相互作用を促進する上で極めて重要な役割を果たします。エネルギー最小値の確認は、振動周波数を調べ、負の周波数または虚数周波数がないことを確認することによって確認されました。その後、各エネルギー最小値についてHOMO値とLUMO値を求めました。HOMO値が高いほど、分子が電子供与体として熟練していることを意味し、値が低いほど、分子が弱い電子受容体として機能することを示唆しています。 補足図S6 は、最適化された6つのNNRTIのHOMO_LUMOエネルギーギャップを表しています。さらに、HOMOとLUMOのエネルギー準位との間のエネルギーギャップの縮小は、分子の強力な電子受容能力と生理活性により、研究対象の分子間で発生する分子間電荷移動相互作用に強く影響する⁴⁸。

表4に示されているように、エネルギーギャップ値の傾向は降順に従います:エファビレンツ>エトラビリン>HBY-561>ネビラピン>デラビルジン>ドラビリン>リルピビリン。エファビレンツとエトラビリンで観察された大きなエネルギーギャップは、ドッキングスコアの分析が生物活性とHOMO-LUMOギャップとの相関関係を明らかにしていることを示しています。特に、HOMO-LUMOギャップ値が大きいほど抗ウイルス性が高くなります。これは、化合物の安定性だけでなく、受容体との安定した相互作用を形成する可能性も示しています。HOMO-LUMOギャップは、特にHIV-1医薬品設計の文脈において、分子の生理活性を理解する上で重要な役割を果たします。

列挙

仮想ライブラリの列挙のために、さまざまなツールが作成されています。列挙に使用されるツールには、Schrödinger が含まれます。これは、コアホッピング法に依存しており、ライブラリは、試薬化合物⁴⁹からのフラグメントでコア構造上の1つまたは複数のアタッチメントを置き換えることによって作成される。Maestro v13.1の列挙ツールは、6つのNNRTIのそれぞれにカスタムサイドグループまたはアトムを追加するために使用されました。新しい化合物は、活性を予測するためにも使用されました。 表5に見られるように、最初に最適化されたNNRTI分子と比較して、列挙された分子の期待活性値には改善が見られました。

列挙されたリガンドの活性値に示された改善は、追加されたカスタムR基が新規の提案された化合物と元のタンパク質の相互作用の力に影響を与えたときに実行される列挙プロセスによるものでした。列挙された化合物は、これらの分子を最適化し、それらの振動周波数を計算することにより、量子力学のために調製されました。それらのエネルギーギャップが計算され、NNRTIのエネルギーギャップと比較されました。 表6に示すように、全体的な観察結果は、列挙された化合物が最適化された化合物よりも安定していることを示しています。

表6では、列挙された化合物のエネルギーギャップが最適化された化合物と比較して同様の傾向を示していることが観察されました。これは、列挙された分子の化学的性質が、コンフォメーションの回転に関係なく変化しなかったことを示しています。したがって、彼らはタンパク質のアミノ酸残基との重要な分子間力を維持することができました。

プロトコルセクション6で概説されているように、NNRTIの列挙プロセスを実行する前に、観測された出力結果には、列挙プロセスからの初期ドッキングスコアがあり、列挙されたドッキングスコア列の下に表7で表されています。プロトコルセクション4で説明したように、分子ドッキングプロセスは、列挙された化合物の提案されたドッキングスコアを検証するために実施されました。列挙された化合物を再ドッキングした後、「再ドッキングされた列挙された配位子」列に示されているように、新しいドッキングスコアが改善したことが観察されました。列挙された化合物の再ドッキングスコアは、 表7の「元のドッキングスコア」列の下に表されている元のNNRTIのドッキングスコアと比較されました。列挙された化合物について、HBY_561、エトラビリン、エファビレンツ、およびドラビリンのドッキングスコアは、同等の最適化された化合物のドッキングスコアよりも優れていることが観察されました。ただし、Delavirdineは、列挙および最適化されたDelavirdineと同じドッキングスコアを持っています。

分子動力学

HBY 561とLYS101、電気陰性のN原子、およびOHとの間に3つの水素結合が形成されます。結晶配位子、または第3分子は、硫黄と水素と同時に2つの水素結合を確立し、GLU138と3番目の水素結合を確立します。重要なことは、π-πスタッキングと疎水性相互作用が、関与する分子間力に大きく寄与することです。さらに、追加の水素結合の存在は分子動力学にとって重要であり、特に結果として得られる二乗平均平方根偏差(RMSD)グラフに反映されます。全体として、エファビレンツは、非常に電気陰性の窒素原子、他の非芳香族環上の酸素原子、および中央環のリガンドの高電気陰性Nとの間のベンゼン環とTYR318と3つの水素結合が形成されることが観察されます。環からのNとOHおよびLY101との間に第2の水素結合が見られます。エトラビリンはLYS101と3つの水素結合を示します。ドラビリンはGLU138と水素結合を形成します。ネビラピンはLY101と2つの水素結合を示します。

この場合、すべてのリガンドに共通するアミノ酸残基相互作用はLYS101です。構造は異なりますが、すべて同じアミノ酸残基と相互作用します。MDシミュレーションは、プロトコルセクション2.8にリストされているパラメータを使用して実行し、各リガンド(NNRTIおよびリストされているNNRTI)が1HQUの活性部位にどの程度良好または不十分に結合するかを確認しました。 図16 に示すリガンド相互作用は、タンパク質のアミノ酸LY101と分子HBY 561、ネビラピン、エファビレンツ、およびエトラビリンとの間に強固な水素結合があることを示しています。 表7の比較からわかるように、これらの強い相互作用が各化合物の高いドッキングスコアを説明しています。

1HQUの活性部位におけるNNRTIおよび列挙されたNNRTIを含む各リガンドの結合効率を評価するために、分子動力学シミュレーション(MDS)を実施しました。具体的には、元の最適化されたコンボよりも優れたドッキングスコアを示した4つの列挙された化合物が選択されました。これらの選択された化合物は、リガンドの存在下での原子間相互作用を考慮して、特定の期間における各分子とHIV-1タンパク質との反応を調査および観察するための検証方法としてMDSにかけられました。

最近列挙された糖鎖の MDS を開始する前に、シミュレーションプロトコルが当社のシステムに適していることを確認することが不可欠でした。これを達成するための最初のステップは、遊離タンパク質1HQUのMDSを実行することでした。タンパク質の活性部位内にリガンドは存在しませんでした(図17A および 補足図S7)。~60 nsまでは、タンパク質構造にかなりの変動があり、最大4.5 ÅのCα RMSDシフトが生成されます。その後、タンパク質はRMSDの変動が最大200 nsまで~3.5 Åで安定しているようです。この安定化により、MDプロトコルがタンパク質-リガンド複合体に適していると確信しました。これについては、次のセクションで分析します。

エトラビリンおよび列挙されたエトラビリンの 200 ns MDS(図 17B、C)は、エトラビリンの二乗平均平方根偏差(RMSD)変動が 5.0 Å に近く、平衡化が 4.5 Å であることを示しました。列挙されたエトラビリンは、4.5 Å の RMSD 揺らぎと 3.5 Å の平衡を示しました。この安定化は、列挙されたエトラビリンがHIV / AIDSを治療するための潜在的なNNRTIリガンドになり得ることを示しています。.RMSDが5 Å未満の軌道は、活性部位のタンパク質とリガンドとの間の強力な結合効果を意味します。この観察結果は、列挙された化合物のうち、ネビラピンとドラビリンを除く前述のすべての化合物について保持されました(補足ファイル1:補足図S8、 補足図S9、 補足図S10、 および補足図S11)。

図18 および 図19 は、エトラビリン、列挙されたエトラビリン、およびタンパク質との間の結合をさらに解析する。解析されたデータには、相互作用、リガンド-タンパク質、およびタンパク質-リガンド接触のヒストグラムが含まれます。タンパク質に結合した各リガンドの相互作用接触ヒストグラムは、タンパク質のアミノ酸の残基とリガンドとの間の対応する相互作用力に直接関連しています。LYS101の存在量が多いことは、エトラビリンと列挙されたエトラビリンで非常に明確であり、目に見える濃いオレンジ色の帯が観察されました。列挙されたエトラビリンチャートの下端に位置するかすかに識別できる明るいオレンジ色の帯が、TYR181と相関して観察されました。この対応は、GLU138の間に2つの分子間引力が存在することを示しています。配位子とその列挙された形態に対するこの肯定的な観察結果を比較して、潜在的なNNRTI化合物としてより優れた配位子を分析しました。提供された結果に基づいて、列挙されたエトラビリンは、HIV / AIDSの治療に使用される可能性を持っています。

一般化ボルンおよび表面積(MM-GBSA)計算による分子力学

この研究では、結合自由エネルギーであるΔG_結合に対するエネルギー入力の主な源は、ファンデルワールス、ΔG_VdW、相互作用の寄与でした。列挙されたエトラビリンは、-64.669 kcal/molのΔG_VdWを持つ既知のNNRTI対応物よりも-66.146 kcal/molのΔG_VdWを持っています。列挙されたエトラビリンの-2.541 kcal/molという高いΔG_Hbond値は、リガンドとタンパク質との間の水素引力の有意な寄与を示しています。列挙されたエトラビリンに対するΔG_クーロンとΔG_{共有結合の}寄与(-17.976および2.807 kcal/mol)は、それぞれ-11.196および2.491であった既知のNNRTIの寄与よりもはるかに大きかった。

エトラビリンと列挙されたエトラビリンと1HQUタンパク質との結合中に観察された結果は、ある程度一貫しています。.列挙されたエトラビリンは、2つの追加の水素結合により、対応するエトラビリンよりも優れていることがわかりました。この研究では、列挙されたエトラビリンが同定されたポケットへの結合に好まれることも明らかになりました。.エトラビリン(-80.551 kcal/mol)と比較して、列挙されたエトラビリンのΔG_結合 (-89.684 kcal/mol)がより負であることは、列挙されたエトラビリンがHIV-1 RTの優れた阻害剤であることを示しています。

図1:ヒト免疫不全ウイルス-1に対する米国食品医薬品局(FDA)の承認済み6つの非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤の化学構造。 NVP =ネビラピン;DLV = デラビルディン;EFV = エファビレンツ;ETV = エトラビリン;RPV =リルピビリン;DOR = ドラビリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:WindowsのローカルコンピュータでMaestro Schrodingerアプリケーションを開いた状態(A) ローカルコンピュータでMaestro Schrodingerアプリケーションに移動する。(B)ローカルコンピューターでMaestro Schrodingerアプリケーションを開いて実行する方法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ローカルコンピュータからSchrödingerのプロジェクトウィンドウへのPDBファイル構造のインポート (A)Maestro Schrodingerの構造のインポート機能。(B)PDB IDテキストボックス。(C) PDB ファイルをローカル コンピューターにダウンロードしました。(D)挿入されたPDB IDファイルをインポートできるようにするためのインポートボタン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: Schrodinger プロジェクト ウィンドウにインポートされた PDB ファイルの構造。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:タンパク質調製ワークフロー (A)タンパク質調製ワークフローの検索インターフェース。(B)ジョブファイル名を保存し、タンパク質調製プロセスを開始する。(C) 実行中のジョブの監視ウィンドウ。(D)リガンドを個々の成分に分解する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:リガンド調製ワークフロー。 (A)ローカルコンピュータからタンパク質調製Schrodingerプロジェクトウィンドウに構造をインポートする。(B)リガンド調製プロセスの探索。(C)リガンド調製ワークフローウィンドウ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7: ジオメトリと最適化のワークフロー。 (A)ジオメトリ最適化のためのGaussViewメニューウィンドウ。(b) GaussView の [計算] タブで使用できるジョブの種類。(C) GaussView の Link0 タブで使用できるオプション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:グライドライド生成と分子ドッキングのワークフロー (A)受容体グリッド生成ワークフローインターフェース。(B)リガンド内の原子を選択するためのポップアップ通知。(C)受容体の詳細設定。(D) ジョブ完了通知。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:グライドリガンドのドッキング。 (A)グライドリガンドドッキングサーチのインターフェース。(b)リガンドドッキングインターフェース。(C)グライドドッキングの精密設定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:KNIME QSARの準備ワークフロー (A)KNIME Community HubのWebページでAutoQSARノードを検索。(B) AutoQSAR KNIME ノードを取得するためのダウンロードボタン。(C)ダウンロードしたAutoQSAR KNIMEワークフローをインポートします。(D)QSARモデルを構築する際のリガンドの設定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:Maestro SchrodingerのLigand Designerを使用したリガンドの列挙。 (A) SchrodingerでLigand Designerオプションを検索する。(B)列挙プロセスを実施するためのワークフローのリスト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図12:HOMO-LUMO生成ワークフロー (A)GaussViewのToolsタブにある分子エディターオプションにアクセスするには。(B)既存のChkまたはFChkファイルをロードして、フロンティア分子軌道を生成します。(C) GaussView での HOMO と LUMO のフロンティア軌道の図。(D) HOMOおよびLUMOフロンティア軌道を表示する可視化ウィンドウ。(E)HOMOとLUMOのフロンティア軌道を保存する。(f)GaussViewの表示形式インターフェース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図13:分子動力学の準備、セットアップ、準備、および実行ワークフロー(A)Desmond System Builder:硬質水モデルを決定するための溶媒和オプション。(B)ボックスの形状を決定するためのデズモンドシステムビルダー境界オプション。(C)Desmond System Builder:ボックスサイズの計算方法。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図14:1HQUと3つの上部ドッキングリガンド間のリガンド相互作用図。 タンパク質(1HQU)と(A)結晶配位子(HBY561)、(B)エファビレンツ、および(C)エトラビリンとの間の相互作用の力。これらの力はタンパク質とリガンドの相互作用に影響を及ぼし、HIV-1の抗菌薬耐性を低下させる医薬品の開発に不可欠です。結合親和性、特異性、および作用機序を強化する役割は、ウイルスを効果的に標的にして阻害できる薬剤の設計に役立ち、それによってHIV-1治療の文脈で高まる抗菌薬耐性の懸念に対処します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図15:散布図は、QSARモデルのクラス1の観測された活動と予測された活動を示しています。 グラフは、クラス1を学習セットとして、NNRTI化合物をテストセットとして、予測アクティビティ値を与えるための適合を表しています。略語:NNRTI =非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤;QSAR = 定量的な構造活性相関。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図16:リガンド相互作用図。 タンパク質と(A)列挙された結晶配位子HBY_561、(B)列挙されたネビラピン、(C)列挙されたドラビリン、(D)列挙されたエファビレンツ、および(E)列挙されたエトラビリンとの間の相互作用の力。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図17:遊離タンパク質エトラビリンと列挙型エトラビリンの分子動力学シミュレーション相互作用図。 (A)遊離タンパク質の分子動力学相互作用図。(B)エトラビリンの分子動力学相互作用図。(C)列挙エトラビリンの分子動力学相互作用図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図18:エトラビリンとタンパク質との間の相互作用接触ヒストグラム。 (A)エトラビリンのタンパク質-リガンド接触タイムライン。(B)H結合、疎水性、イオン性、および水橋の接触を含む、タンパク質-リガンド相互作用の経時的なタイムライン。(C)リガンド原子とタンパク質残基との間の詳細な相互作用を示す模式図。シミュレーション時間の30%(0.00〜200 ns)を超えて発生した相互作用のみが表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図19:列挙されたエトラビリンとタンパク質との間の相互作用接触ヒストグラム。 (A)列挙されたエトラビリンのタンパク質-リガンド接触タイムライン。(B)H結合、疎水性、イオン性、および水橋の接触を含む、タンパク質-リガンド相互作用の経時的なタイムライン。(C)リガンド原子とタンパク質残基との間の詳細な相互作用を示す模式図。シミュレーション時間の30%(0.00〜200 ns)を超えて発生した相互作用のみが表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

クラス	タンパク質ターゲット	コンパウンドレンジ	選択した化合物の総数
1	NL4-3 野生型HIV-1	(8a1-8e5 – EC50 (nM)a)	25
2	IIIB WT HIV-1	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
3	RES056 NNRTI耐性菌	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
4	ロッドHIV-2株	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
QSARモデリングに選択された化合物の合計			94

表1:QSARモデリングの複合分類基準の要約。 Kangら⁵⁰ は、NL4-3野生型HIV-1、IIIB WT HIV-1、RES056 NNRTI耐性株、およびROD HIV-2株など、さまざまなHIV株を標的とする94のジヒドロフロ[3,4-d]ピリミジン化合物のデータセットを合成した。これらのピリミジン誘導体は、QSARトレーニングを実施するための準備のために、標的タンパク質に応じて4つのクラスにグループ化されました。この表は、これらの分子が、薬物の最大効果の50%を発揮する濃度として運用される薬物の効力を表す実験EC₅₀ の値に従って、どのように4つのクラスにグループ化されたかをまとめたものです。略語:NNRTI =非ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤;QSAR = 定量的な構造活性相関。

タンパク質名	リガンド	ドッキングスコア
1HQUの	エファビレンツ	-10.432
	エトラビリン	-9.647
	HBY_561	-9.242
	ドラビリン	-9.04
	ネビラピン	-8.825
	リルピビリン	-7.722
	デラビルジン	-6.519

表2:最適化された6つのNNRTIとHIV-1タンパク質のドッキングスコア。 ドッキングスコアは、調査中の6つのNNRTIのものです。スコアが負の値が多いほど、リガンドとタンパク質との間の結合効果が良好であることを示します。エファビレンツとエトラビリンは、共結晶リガンドHBY561(-9.242)のドッキングスコアと比較して、-10.432 eVおよび-9.647 eVで最も有利なスコアを示しています。潜在的なリガンドは、ドッキングスコアがより負で、-9.242 eV未満のものでした。

薬物クラス	85パーセントのアクティビティフィッティング	コラム1	コラム2	コラム3	コラム4	コラム5
	スコア	SDの	R2の	RMSEの	質問2	Q2 MW (帰無仮説)
1	0.8223	0.3268	0.815	0.2479	0.8185	0.1462
2	0.5671	0.2996	0.5067	0.1996	0.2264	0.4736
3	0.8172	0.3692	0.8114	0.1536	0.9065	-1.1532
4	0.6673	0.367	0.6436	0.1709	0.8852	0.1445
* SD –標準偏差、
R2 – 実際のアクティビティ値と予測されたアクティビティ値の間のトレーニングセットの相関関係
Q2 – テスト セットの実際のアクティビティと予測されたアクティビティの相関関係。
RMSE - 二乗平均平方根誤差

表3:2D-QSARモデルの統計パラメータ。 この表は、各クラスの標準偏差、実際のアクティビティ値と予測されたアクティビティ値の間のトレーニング セットの相関関係 (R²)、およびテスト セットの実際のアクティビティと予測されたアクティビティの相関の高スコア (Q²) を示しています。高いスコア (R²) はクラスを表します。

リガンド	ホモ	ルモ	Eギャップ
エファビレンツ	-0.2242	-0.06943	0.15477
エトラビリン	-0.21408	-0.08141	0.13267
ネビラピン	-0.20602	-0.07759	0.12843
HBY_561	-0.19687	-0.0748	0.12207
デラビルジン	-0.19651	-0.07958	0.11693
ドラビリン	-0.22413	-0.10916	0.11497
リルピビリン	-0.21343	-0.11216	0.10127

表4:最適化されたNNRTIのHOMO-LUMOエネルギーギャップ。 この表は、6つのNNRTIの最適化後に得られたHOMO-LUMOエネルギーギャップの結果を示しています。

リガンド	最適化されたリガンド	列挙された配位子
ドラビリン	7.229	7.374
リルピビリン	7.302	7.279
エトラビリン	7.229	7.374
エファビレンツ	7.229	7.323
デラビルジン	7.302	7.302
ネビラピン	7.229	6.988
HBY_561	7.229	7.323

表5:最適化されたNNRTIと対応する列挙されたNNRTIの予測アクティビティスコア。 この表は、最適化されたリガンドと列挙されたリガンドの間の予測活性スコアを比較したものです。活性スコアが高いほど、化合物は潜在的な薬物リードとして優れています。

リガンド	最適化後のエネルギーギャップ	列挙後のエネルギーギャップ	最適化された化合物と列挙された化合物のギャップ差
ドラビリン	0.115	0.126	0.011
リルピビリン	0.101	0.127	0.030
エトラビリン	0.133	0.126	0.010
エファビレンツ	0.155	0.126	0.030
デラビルジン	0.117	0.126	0.010
ネビラピン	0.128	0.126	0.002
HBY_561	0.122	0.126	0.004

表6:列挙されたNNRTIの予測エネルギーギャップと最適化されたNNRTIの元のエネルギーギャップの比較。 この表は、最適化された配位子と列挙された配位子の間のHOMO-LUMOエネルギーギャップと、それらの間のエネルギーギャップ差の比較を示しています。

列挙されたリガンド	5つのプロパティのルール	コラム1	コラム2	コラム3	コラム4	コラム5	サイドグループを追加	ドッキングスコアの列挙	オリジナルドッキングスコア	Redocked 列挙リガンド
	アログP	PSAの	HBDの	HBAの	MWの	MPOの
ドラビリン	2.4	125.9	2	8	441.8	0.49	水酸基	-8.894	-9.04	-9.739
エトラビリン	4.4	140.9	3	8	451.3	0.37	水酸基	-10.258	-9.647	-10.517
エファビレンツ	3.7	64.3	2	3	330.7	0.75	アミン	-10.284	-10.432	-11.025
ネビラピン	2.6	58.1	1	4	284.3	0.73	フッ化物	-9.112	-8.825	-9.445
HBY_561	2.4	93.9	2	6	358.5	0.66	アミド	-9.596	-9.242	-10.1
AlogP - (オクタノール-水分配係数の計算された対数)。
PSA - (極地表面積)
HBD - (水素結合供与者)
HBA - (水素結合アクセプター)
MW - (分子量)
MPO - (マルチパラメータ最適化)

表7:元のNNRTIと列挙されたNNRTIのドッキングスコアの比較。 この表は、列挙されたドッキング スコア (列挙後のドッキング スコア) の比較を示しています。元のドッキング スコアは、最適化された NNRTI のドッキング スコアです。再ドッキングされた列挙スコアは、列挙されたリガンドのドッキングスコアです。列挙プロセスでは予測ドッキングスコアが得られるため、最適化されたリガンドと同じ方法でリガンドを再ドッキングする必要がありました。追加されるグループは、列挙プロセス中にリガンドに追加されたグループです。

リガンド	ΔG結合	ΔGクーロン	ΔG共有結合	ΔGHボンド	ΔGリポ	ΔGパック	ΔGソルブ	ΔGVdW
エトラビリン	-80.551	-11.196	2.491	-1.509	-27.447	-4.826	26.605	-64.669
列挙されたエトラビリン	-89.684	-17.976	2.807	-2.541	-27.652	-4.211	26.034	-66.146
HBY561	-79.664	-12.261	0.994	-0.521	-26.052	-1.278	18.624	-59.169
列挙型HBY561	-82.719	-13.443	1.534	-0.603	-27.053	-1.210	20.600	-62.544
エファビレンツ	-71.372	-12.984	1.151	-0.834	-25.353	-1.379	14.472	-46.44
列挙されたエファビレンツ	-79.125	-18.602	1.753	-2.159	-25.409	-1.198	16.619	-50.129

表8:1HQU上の選択されたリガンドのMMGBSA再Xts。 この表は、Molecular Mechanics with Generalized Bornおよび表面積の計算を表しており、タンパク質-リガンド複合体の平均結合自由エネルギー(ΔGbind)を示しています。この表は、結晶配位子と比較して良好なドッキングスコアを示す、最初に最適化された配位子と、それらの列挙された対応物との比較を示しています。ドッキングスコアが高く、分子動力学シミュレーションが良好な化合物である化合物は、平衡化時のRMSD変動が最も負の結合自由エネルギー(ΔG_結合)を示すため、MMGBSA計算も満たすはずです。この場合、列挙されたエトラビリンは両方の計算パラメータを満たします。

補足ファイル1:この研究で得られた他のrXts。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

DFT²⁶法は、さまざまなピリミジン誘導体の電子特性と安定性を分析するために使用されましたが、これは同様の研究では当てはまりません。DFTを使用すると、量子レベルでの分子相互作用をより深く理解することができ、NNRTIの設計プロセスが向上します。本研究では、活性値が不明なNNRTIを6つ選抜しました。PubChemデータベースからそれらの分子構造を取得し、Gaussian 16 revision C01³³量子力学ソフトウェアパッケージのMinnesota 15 Local (MN15-L)³² functionalおよび6-31++G (d,p)²基底セットを使用して幾何学的最適化を行いました。シミュレーション入力ファイルの設定には、GaussView 6.0²⁶を使用しました。次に、量子構造をHIV-1タンパク質の活性部位にドッキングしました。

この研究では、NNRTIの化学構造に基づいてNNRTIの生物学的活性を予測するように調整されたQSARアプローチ⁵¹を利用しました。このモデルは、94種類のジヒドロフロ[3,4-d]ピリミジン誘導体のデータセットを用いて生成され、抗ウイルス活性に影響を与える主要な官能基の同定を可能にします。堅牢なQSARモデルを組み込むことは、設計プロセスの早い段階で化合物をフィルタリングし、創薬の有効性を高めるのに役立つため、重要な進歩です。

新しい化合物の予測される活性を考慮し、ドッキングスコアを検証しました。高度な分子ドッキング技術により、NNRTIとHIV-1逆転写酵素との間の結合相互作用が探索されました。これは、長期間(200ナノ秒)にわたる分子動力学シミュレーションによって補完され、生理学的条件下での薬物-タンパク質複合体の安定性と挙動に関する洞察を提供しました。分子動力学⁵² は、ドッキング研究からの知見を検証した。薬物-酵素複合体の挙動を経時的にシミュレートすることにより、静的ドッキング研究⁵³では捕捉できない可能性のある動的安定性と相互作用を評価できる。このアプローチは、NNRTIが生物学的システムにおいてどのように機能するかについて、より現実的な評価を提供します。シミュレーションでは、エトラビリンは約4.5 ÅのRMSD揺らぎを引き起こし、列挙されたエトラビリンは約3.5 ÅのRMSD揺らぎを示したことが示されました。エトラビリンと列挙されたエトラビリンとの間にはさまざまな類似点があり、列挙された化合物はタンパク質の活性部位内で増強されたアミノ酸相互作用を持っていました。RMSDの低下、アミノ酸相互作用の改善、および結合自由エネルギーの高さはすべて、列挙されたエトラビリンがHIV/AIDS治療の実行可能な代替手段として機能する可能性があることを示唆しています。

立体異性体を生成し、アイソステアスキャンを実行するための列挙技術⁵⁴ の使用は、この研究の注目すべき側面である。この方法により、研究者は既存の構造を体系的に改変することにより、潜在的なNNRTIのより広い化学空間を探索でき、有効性が向上し、耐性が低下した化合物の発見につながる可能性があります。

本研究では、量子力学的計算から導出されたHOMO-LUMO解析を統合し、化合物の反応性と安定性を評価します。この側面は、同様の研究⁵⁵では見落とされがちですが、生物学的活動に影響を与える可能性のある電子特性に関する貴重な洞察を提供します

この研究で MMGBSA 法を使用して、列挙された NNRTI の結合自由エネルギーを潜在的な HIV-1 逆転写酵素 (RT) 阻害剤として推定すると、HIV 治療開発に対するこの研究の重要性と潜在的な影響を強化する新しい側面が提示されます。

この研究で MMGBSA を適用すると、列挙されたエトラビリンの結合自由エネルギーを、対応するものと比較してより正確に推定できます。結合自由エネルギー値を計算することにより、この研究では、列挙されたエトラビリンの結合親和性を定量的に評価します。これは、標準的なエトラビリンよりもかなり高かった(9.133 kcal / mol)。結合エネルギー計算におけるこのレベルの詳細により、構造修飾がNNRTIの有効性にどのように影響するかについて、より微妙な理解が可能になりますが、これは定性的評価のみに依存する可能性のある同様の研究ではしばしば欠けています。

報告されたΔG_共有結合 値1.477 kcal/molは、列挙された化合物の相互作用の強さをさらに示しています。この比較アプローチは、有望な候補を特定するだけでなく、既存の治療法のより広範な文脈に位置づけるため、革新的であり、将来のNNRTI開発のベンチマークを提供します。

表8に示す比較はまた、列挙されたエトラビリンが代替ARTとして使用される潜在的な化合物であり得ることを示しています(ΔG_結合)の結合自由エネルギーは、エトラビリン、HBY56、エトラビリン、およびそれらの列挙された対応物と比較して最も高いです。

私たちの研究の結果は、HIV感染の新規治療薬の開発に大きな影響を与える可能性があります。さらに、このアプローチにより、最も有望な抗HIV候補を特定できる可能性があります。これらの知見は、新規HIV-1 NNRTIsの合理的な設計への道を開く可能性があります。

MMGBSAを他の計算手法(分子ドッキング、QSARモデリング、分子動力学シミュレーションなど)と組み込むことで、知見の堅牢性が向上します。この統合的なアプローチにより、構造の最適化から生物学的な文脈での動的挙動まで、化合物の包括的な評価が可能になります。このような方法論は、NNRTIの研究では比較的斬新であり、研究はしばしば薬物設計プロセスの全体像を持たずに孤立した方法に焦点を当てています。今回の研究は、NNRTIと逆転写酵素との間の分子相互作用に関するいくつかの有望な結果と理解を深めていることを強調しており、今後の創薬設計の取り組みに役立つ可能性がある。

NNRTI開発分野の他の研究は、単一の計算方法や基本的なドッキング解析に焦点を当てることが多いですが、この研究は、量子化学計算と分子動力学およびQSARモデリングを組み合わせ、NNRTIの潜在的な化学空間を拡大する体系的な列挙アプローチを採用し、包括的な インシリコ を活用していることで際立っています。結合親和性を予測するだけでなく、薬物と酵素の相互作用の安定性とダイナミクスを評価するフレームワーク。

全体として、この研究の新規性は、HIV治療における薬剤耐性の課題に対処するために高度な計算技術を活用する多面的なアプローチにあり、それにより、より効果的なNNRTIの開発への道を開きます。この知見は、現在の治療法の限界を克服できる、より効果的なNNRTIを開発できる可能性を強調している。

このプロトコルで説明されているアプローチの将来のアプリケーションには、次のものがあります。

機械学習との統合

将来の研究では、MMGBSAを機械学習アルゴリズムと統合して、自由エネルギー推定を拘束する予測力を向上させる可能性があります。大規模なデータセットでモデルをトレーニングすることで、研究者は予測の精度と信頼性を高め、有望なNNRTI候補をより適切に特定できるようになりました。

フラグメントベースの薬物設計への応用

MMGBSAは、低分子フラグメントを最適化して結合親和性を向上させるフラグメントベースの薬物設計に効果的に活用できます。このアプローチは、HIV-1に対する効力と選択性が強化された新規NNRTIの同定につながる可能性があります。

薬剤耐性メカニズムの探索

この技術は、NNRTIとHIV-1の変異株との結合相互作用の研究に適用できる。NNRTIの結合自由エネルギーを野生型変異体と耐性変異体の両方と比較することで、研究者は薬剤耐性のメカニズムに関する洞察を得て、次世代阻害剤の設計に情報を提供することができます。

薬物動態特性の評価

MMGBSAは、溶解性や透過性などのNNRTIの薬物動態特性を評価するためにも使用できます。これらの特性が結合親和性とどのように相関しているかを理解することで、研究者はより良い治療プロファイルを得るために薬剤候補を最適化することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	ガウスView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrodinger Maestro V13.6	SCHRODINGER INC.		ライセンスリリース年:2023-2