方法論記事

成体ゼブラフィッシュにおける静脈内注射の最適化

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DOI：

10.3791/67463

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2024年12月20日

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1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

この記事について

サマリー

ここでは、成体のゼブラフィッシュに細胞または薬理学的薬剤を静脈内注射することで、処理されたゼブラフィッシュの細胞生着を促進し、生存率を向上させるための最適化された効果的なプロトコールを紹介します。

要約

静脈内(IV)注射は、哺乳類の研究モデルにおいて物質の全身送達を達成するための最も効果的で一般的に利用されている方法として広く認識されています。しかし、成体のゼブラフィッシュの薬物送達、幹細胞移植、再生およびがん研究への応用は、その小さな体の大きさと複雑な血管による課題のために限られています。これらの制限を克服するために、成体ゼブラフィッシュの幹細胞移植では、心臓内注射や眼窩後(RO)注射などの代替注射技術が過去に研究されてきました。ただし、これらの技術には、細心の注意を払った注射技術の必要性や死亡リスクの増加など、欠点があります。

この研究では、成魚のゼブラフィッシュに特化した洗練された最適化されたIV注入手順を開発し、そのユニークな解剖学的構造に関連する課題に対処しました。この技術の有効性を実証するために、Tg(mpo:EGFP)魚の全腎髄細胞とFITC-デキストラン色素 の成魚 へのIV注射に成功しました。その後、注入された細胞と色素を蛍光顕微鏡で可視化したところ、ゼブラフィッシュへの送達と生着が成功したことが確認されました。さらに、心臓内注射やRO注射と比較して、IV注射により治療されたゼブラフィッシュの生存率と生着効率が向上することを示しました。このアプローチにより、物質の正確な送達と局在化が可能になり、成体のゼブラフィッシュを用いた大規模な薬物および化学スクリーニングに大きな可能性を秘めています。さらに、注入された細胞や色素を視覚的に追跡する能力は、それらの生着、遊走、宿主組織との相互作用に関する貴重な洞察を提供し、ゼブラフィッシュモデルの治療効果と生物学的プロセスのより包括的な評価を可能にします。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、主にヒトとの遺伝的類似性により、生物医学研究における貴重なモデル生物として浮上しており、ヒトの遺伝子の70%以上がゼブラフィッシュに対応するものを持っています1,2。この遺伝的類似性は、ゼブラフィッシュのコンパクトなサイズ、迅速な発生サイクル、広範な遺伝子操作能力と相まって、科学的探求のための強力なツールとなっています。これらの特性は、細胞移植、薬物送達、および細胞トレーシングを含む実験に特に有利です。さらに、透明な幼虫やキャスパーゼブラフィッシュなどの特異的な色素沈着変異体の光学的透明度により、移植された細胞や物質の正確な可視化が可能になり、従来の動物モデルに代わるより効率的で費用対効果の高い選択肢を提供します。

ゼブラフィッシュは、がん移植モデルの開発や、神経膠腫、黒色腫、膵臓腫瘍、白血病などの重篤な疾患の薬物スクリーニングに広く使用されています(3,4,5,6,7,8,9,10)。通常、これらのモデルは幼虫の段階で開始され、幼虫の未熟な免疫システムと固有の透明性を利用することで、注入プロセスを簡素化し、短期研究の実現可能性を高めます。しかし、幼虫を使用すると、生着と治療的介入を評価する期間が制限される7,11。これらの実験プロトコルを成魚のゼブラフィッシュに移行すると、より複雑な注射手順、生着効率の低下、死亡率の上昇、個々の反応のばらつきの増加などの課題が生じます。これらの課題は、特に長期間の観察を必要とする成魚のゼブラフィッシュを対象とした研究において、注射および物質送達技術の改善が重要であることを浮き彫りにしています。

歴史的に、心臓内注射12および眼窩後(RO)注射13は、成体ゼブラフィッシュにおける薬物送達および細胞移植の主要な方法であった。心臓内注射は、心臓に直接物質を注入することで、薬物の即時の全身循環を確保しますが、潜在的な心臓損傷や高い死亡率などの重大なリスクと関連しています。一方、眼の後ろの静脈洞に物質を送達するRO注射も、迅速な全身分布を促進するが、魚にとってはストレスとなり、高い精度の実行が求められる14。マウスおよびラットにおける全身性物質送達のために十分に確立されたIV注射は、薬物動態研究、薬効評価、およびこれらのモデルにおける治療的介入にとって重要である15,16,17,18。最近、ゼブラフィッシュの研究、特にゼブラフィッシュの幼生における自然免疫応答19,20および急性腎障害21の研究において、IV注射が注目を集めています。しかし、成体ゼブラフィッシュへの応用は依然として限られています。

本研究では、成魚のゼブラフィッシュに特化したIV注入手順を開発・最適化することで、生存率、精度、送達効率を大幅に向上させました。この方法を視覚的に示し、この洗練された手法を使用して詳細なプロトコルを提供します。Tg(mpo:EGFP)魚の全腎骨髄(WKM)細胞とFITC-デキストラン色素 の成魚 へのIV注射に成功し、送達と生着の確認は蛍光顕微鏡で評価されました。私たちの調査結果は、洗練されたIV注射技術が、従来の心臓内およびRO法と比較してより効率的で一貫していることを示しています。科学研究におけるゼブラフィッシュの使用が拡大し続ける中、この改良されたIV注射技術の採用により、疾患の病因に関する理解が深まり、新しい治療アプローチの開発が加速する可能性があります。

プロトコル

すべての動物実験手順は、香港大学(HKU)の実験動物および研究動物使用委員会(CULATR)によって承認されました。

1.注入材料の準備

  1. 細胞懸濁液培地を調製します:0.9x PBS + 5%ウシ胎児血清(FBS)+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)。.
  2. ハミルトンシリンジと付属の針(34 G、長さ10 mm、容量10 μL、 材料表を参照)を波長270〜280 nmのUV光で滅菌し、アイテムを2時間さらします。
  3. 滅菌した綿棒、発泡スチロールパッド、ティッシュペーパーを準備します。
  4. トリカインを滅菌した魚水で最終濃度0.2 mg / mLに希釈することにより、麻酔混合物を準備します。.
  5. キャスパー魚へのWKM細胞の移植については、移植の2日前に、25Gyの亜致死放射線量を、それぞれ12.5Gyの2つのセッションに分割し、同じ日に7〜8時間の間隔で投与します。照射プロセスでは、魚水が入った100mmのシャーレに5〜10匹の成魚を入れ、ガンマ線照射器に露光します。
    注:この線量は、 キャスパー フィッシュを最大35Gyまでのさまざまな照射レベルに曝露し、30日間にわたって監視した後の生存分析に基づいて亜致死的であると判断されました(図1A)。正確な露光時間は、照射器の設定に従って調整する必要があります。薬物送達のみの手技では、照射は必要ありません。
  6. 実験室用オートクレーブ蒸気滅菌器を使用して、処理された魚を収容することを目的とした魚水を滅菌します( 材料の表を参照)感染を防ぎ、注射後の魚の安全な回復環境を確保します。
    注:滅菌プロセスは、使用する特定のオートクレーブユニットに合わせて調整されており、魚の水を準備するための液体溶液のオートクレーブに関するメーカーのガイドラインを順守しています。
  7. 針洗浄バッファーを調製します:1.5 mL微量遠心チューブに75%エタノールと超純水を入れた数本のチューブ。
  8. FITC-デキストラン(分子量:10,000)を、あらかじめ調製した細胞懸濁液培地(0.9倍PBS、5%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌)に溶解して移植バッファーを調製します。濃度を100 μg/mLに調整します。
    注:このバッファーは注入に使用され、魚あたり2μLの計画容量です。

2. 移植のための全腎骨髄の調製

  1. 必要な数のTg(mpo:EGFP)魚を0.4 mg / mLトリカイン溶液に浸して安楽死させ、手術運動の停止後少なくとも10分間溶液に留まるようにします。.
  2. Tg(mpo:EGFP)魚を解剖して、腎臓骨髄(KM)を分離し、前述の22と同様に1.5mLの微量遠心チューブ内の細胞懸濁液に移します。
  3. KM細胞をピペッティングし、40μmのナイロンセルストレーナーで懸濁液をろ過して、KM細胞を解凝集します。
  4. 懸濁液を500 × g で8分間遠心分離します。
  5. 上清を捨て、ペレットを500 μLの細胞懸濁液培地に再懸濁します。
  6. 細胞懸濁液の10μLアリコートを備えた自動カウンターを使用して細胞をカウントします。
  7. 再度、500 × g で8分間遠心分離します。
  8. 移植バッファーを用いて細胞濃度を150,000細胞/μLに調整します。

3.注入手順

  1. 注入前にハミルトンシリンジ3-4xを75%エタノールで十分に洗浄します。シリンジを超純水で3〜4倍すすぎ、エタノール残留物を取り除きます。
  2. ゼブラフィッシュに麻酔を施し、ゼブラフィッシュが完全に麻酔されるまで麻酔混合物に浸し、運動の衰えと反射反応の喪失が証明されるようにします。魚が鎮静されたら、背側を上に向け、頭を左に向けて配置します(図1B)。魚を清潔で湿らせたティッシュペーパーの上に慎重に置き、注射のために魚を安定させるのに役立ちます。魚が乾燥するのを防ぐためにティッシュが十分に湿っていることを確認してくださいが、滑りを引き起こすほど濡れていないことを確認してください。
  3. ハミルトンシリンジをしっかりと握り、針を一次血管(尾静脈)に対して~45°の角度にして、周囲の組織への損傷を最小限に抑えながら効果的に標的を絞ります。 Capser ゼブラフィッシュの場合は、針を正確に配置するために、半透明の本体から見える容器のセクションを目指します(図1B)。皮膚が色素沈着した野生型ゼブラフィッシュ(Tubingen, TU)の場合は、一次血管の領域で体軸に沿って肛門の後方にある一次血管を目指します(図1B)。指定の血管に針を優しくスムーズに挿入し、ストレスを最小限に抑えるために注射液(2μL)をゆっくりと投与し、物質の最適な取り込みを確保し、綿棒で部位に10秒間穏やかな圧力をかけて注射後の出血を抑えます。
  4. 顕微鏡で観察してGFPシグナルの存在を確認し、注入の有効性を確認します。細胞または色素が容器内で緑色のシグナルとして現れることを確認します(図2A)。
  5. 魚が注射後10分間、滅菌したばかりの魚の水で回復し、静的タンクに移されるまで待ちます。
  6. 異なる試薬の注入の間に前述のように針を清掃します。
  7. 細胞凝集を防ぐため、細胞懸濁液を10分おきにフリックして細胞を再懸濁します。
  8. 治療期間中、静的水条件下で4Lタンクに最大15匹の移植魚を維持します。あるいは、移植した魚を1Lの静的タンクに個別に収容します。タンクに酸素ポンプを装備し、感染のリスクを最小限に抑えるために毎日水の交換を行います。
  9. 移植後約14日後に魚のフローサイトメトリーによるGFP発現をモニタリングおよび評価し、生着率を評価します。魚の毎日の死亡率を記録して、生存率を正確に計算します。生着分析のための一元配置ANOVAと生存分析のためのログランク検定を実行します。

結果

成魚の キャスパー 魚におけるさまざまな注入方法の有効性と精度を評価するために、心内、RO、およびIVの手法を使用して比較分析を実施しました(図2A)。Tg(mpo:EGFP)魚由来のさまざまな量のWKM細胞を注入し、それぞれを1 × 105 および3 × 105 細胞の濃度でFITC-デキストラン色素と混合しました。各分析法の成功は、注入後のGFPシグナルの存在を顕微鏡で即座に評価することで判断しました。その結果、方法間でデリバリーの成功に大きなばらつきがあることが明らかになりました。IV注入法は最も高い効果を示し、43匹中41匹でGFPシグナルが検出されました。対照的に、RO法は限られた成功を示し、成功した注入は37匹中3匹だけで観察されました。心臓内法では、40匹中11匹の魚で成功裏に送達されました(図2A)。移植された魚の生存も監視されました。RO法および心臓内法で注射された魚は、静脈内注射された魚と比較して生存率が有意に低かった(図2B)。特に、注入された細胞の数は、IV注射された魚の生存率に影響を与え、レシピエントは3個×10個の5 個の細胞を投与され、より良い生存を示しました。これらの知見は、成体のゼブラフィッシュに細胞や物質を送達する際のIV注射法の優れた有効性と信頼性を浮き彫りにしています。

レシピエント キャスパー 魚におけるWKM細胞の生着効率は、移植細胞からのGFPシグナルをモニタリングすることにより徹底的に評価されました。IV注射を受けた魚では、移植後3日目という早い時期にGFPシグナルが検出され(図2C)、迅速かつ効果的な生着プロセスが示されました。対照的に、RO注射と心臓内注射を受けた魚は、GFPシグナルの出現が遅れ、生着速度が遅いことを示しました。移植後17日目までに、移植された細胞は主に腎臓骨髄に再増殖し、IV注射された魚で最も顕著なGFPシグナルが観察されました(図2C)。レシピエントからのKMのフローサイトメトリー分析は、IV注射法の有効性をさらに強調しました。最初に3個×10個の5 細胞を静脈内注射したレシピエントでは、KMの細胞の約18%がGFP陽性であり、移植を受けていないドナーTg(mpo:EGFP)魚の腎臓骨髄に見られるものと同様の割合でした(図2D、E)。対照的に、心臓内注射では約5%のGFP陽性細胞が得られましたが、RO法ではレシピエントの腎臓骨髄で約2%のGFP陽性細胞しか得られませんでした。さらに、生着速度は注入された細胞の数と正の相関があり、細胞の投与量が多いほど生着が大きくなることを示しています。これらの結果は、細胞の生着とその後の腎髄の再増殖を促進するIV注射技術の堅牢性を裏付けています。

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図1:成魚ゼブラフィッシュにおける放射線照射および静脈内注射後の生存転 帰 (A) キャスパー フィッシュは、最大35Gyの放射線に曝露され、30日間にわたって生存を監視し、25Gyが亜致死量として確認された(すべてのグループでn = 10)。(B) キャスパー ゼブラフィッシュとTUゼブラフィッシュの両方の注入部位を示す概略図と、成功した注入魚の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:成体ゼブラフィッシュにおける眼窩後注射、心内注射、静脈内注射の比較 (A)成体ゼブラフィッシュにおけるRO、心内、およびIV注射法の概略図と代表的な結果。右下の数字は、各メソッドで試みられた総数に対する、成功した注入または誤って注入された魚の数を示しており、GFPシグナルは注入直後に蛍光顕微鏡で確認されました。(B)異なる注射方法により異なる数のドナー腎髄細胞を移植した後のレシピエントの全生存期間(IV-100K:n = 24;心内-100K:n = 10;RO-100K:n = 12;IV-300K:n = 20;心内-300K:n = 6;RO-300K:n=8)。(C)RO、心内、およびIV注射法による移植後のレシピエントの生着効率の観察 (D)移植後17日目のレシピエントのKM単位のGFP陽性細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。(E)移植後17日目のレシピエントのKMにおけるGFP +細胞の割合、および照射なしのドナーTg(mpo:EGFP)魚のKMにおけるGFP +細胞の割合(IV-100K:n = 30;心内-100K:n = 28;RO-100K:n = 22;IV-300K:n = 22;心内-300K:n = 26;RO-300K:n=18)。データは平均± s.e.m.Dに対して一元配置分散分析を実行しました。Bに対してLog-Rank検定を実施した。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。スケールバー = 1 mm (A, C)。略語:RO =後軌道;IV = 静脈内;GFP = 緑色蛍光タンパク質;KM =腎臓骨髄;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FITC-A = フルオレセインイソチオシアネート-ピーク面積。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究では、成体ゼブラフィッシュに合わせたIV注射プロトコルを開発し、細胞や薬物の送達の精度と一貫性を高めました。この方法の重要な要素は、物質の正確な投与に不可欠な一次静脈の位置を特定し、視覚化する能力です。最適な船舶の視認性を得るためには半透明の キャスパー ゼブラフィッシュ株が推奨されますが、当社のプロトコルは、視認性と精度のために適切な調整が行われていれば、さまざまな成魚のゼブラフィッシュ株での使用に適応できます。血管の損傷を最小限に抑え、効果的な物質輸送を確保するためには、適切な針ゲージの選択が不可欠でした。さらに、清潔で酸素の多い水を維持するなど、注射後の包括的なケアが優先されました。これらの方法により、注射プロセスが合理化されただけでなく、ゼブラフィッシュの健康と生存率が大幅に向上し、それにより、より信頼性と再現性のある実験結果が得られました。

さらに、成魚の心臓内注射法、RO注射法、静脈内注射法の比較解析を行い、生存率の向上と細胞生着の促進における静脈内注射法の明確な利点を実証しました。従来の使用にもかかわらず、心臓内注射は高い死亡率13に関連しており、効果的なRO注射に必要な精度を一貫して達成することは困難です14。IV技術の低侵襲性は、魚へのストレスと身体的外傷を大幅に軽減し、注射後の生存率と生着結果を大幅に改善します。さらに、IV注射された魚に移植後3日目までにGFPシグナルを迅速に検出できることは、効果的な細胞生着を促進するこの方法の効率性をさらに強調しています。対照的に、心内注射魚ではGFPシグナルの出現が遅く、RO注射魚ではシグナルがほとんどないことは、これらの代替方法の限界を強調しており、IVアプローチがより効果的なアプローチであることを示唆しています。

IV注入法には大きな利点がありますが、高精度を達成するための特殊な機器やトレーニングが必要であるなど、潜在的な制限があります。さらに、 Casper 株の半透明性は静脈の可視化を容易にしますが、この方法を半透明でない株に適応させるには、さらなる視認性と技術的な強化が必要になる場合があります。さらに、ゼブラフィッシュのIV注射の長期的な影響を評価し、ゼブラフィッシュの長期にわたる生着細胞の安定性を評価するためには、さらなる研究が必要であり、これはこの技術の持続的な成功と安全性を検証するために重要となるでしょう。

IV注射技術が物質を血流に送達し、成魚の生着レベルを高くする効果は、将来の研究にいくつかの意味を持ちます。この方法により、成魚の成魚を長期的な研究でより効果的に使用することができ、幼生モデルに関連するいくつかの制限に対処することができます。IV法の信頼性は、複雑な疾患の研究や薬物スクリーニングの実施のためのモデルの精度を向上させ、治療戦略の大幅な進歩につながる可能性があります。さらに、IV注射が強固な生着を達成したことは、遺伝性疾患や免疫応答の研究に不可欠な遺伝子操作や移植のさらなる探求のための強力な基盤を築くことになります。このIV注射プロトコルの進歩は、ゼブラフィッシュの研究に大きく貢献し、生物医学研究のためのツールを改良し、ヒトの疾患の理解と治療の進歩を加速させることになります。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

香港大学比較医学研究センター(CCMR)のゼブラフィッシュファシリティに感謝します。動物支援をしてくださったJo Yiu Ling Wongさんに感謝します。これらの研究は、テーマベースの研究スキーム(T12-702/20-N)、健康・医療研究基金プロジェクトNo.08192066およびNo.08193106、中国国家自然科学基金(NSFC)/研究助成評議会(RGC)共同研究スキーム2021/22 N_HKU745/21、中国の国家重点研究開発プログラム(2023YFA1800100)、イノベーション・テクノロジー委員会が資金提供するHealth@InnoHKイニシアチブに基づく腫瘍学・免疫学センターの支援を受けた。 中国香港特別行政区政府(A.Y.H.L.)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オートクレーブ蒸気滅菌器平山 HRG-140
遠心分離機 5424Eppendorf
Countess 3 自動セルカウンターサーモフィッシャー
Countess II FLInvitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 µm セルストレーナーコーニングブルー、滅菌済み、個別包装、50/ケース
FBS、認定Gibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
注射針ハミルトン HAMI20743434 G、長さ10 mm
のマイクロシリンジハミルトン 7635-01 10 µL 容量、モデル 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)Gibco10010023
ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)Gibco™15070063100x
ピペットチップEppendorf epTIPS
シングルチャンネルピペットエッペンドルフ 05-403-151
UltraPure 蒸留水Invitrogen10977015

参考文献

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