in vivoで脳血流調節を研究するために、従来の薬理学的方法は侵襲的であり、しばしば頭蓋骨、硬膜、および軟髄膜を損傷します。本研究では、ナノインジェクターガイド下大脳内(ICM)注入とレーザースペックルコントラストイメージングを組み合わせた低侵襲技術を開発し、頭蓋骨と軟髄膜の完全性を維持しました。
方法論記事
In vivoでの脳血流調節を研究するためのCisterna Magnaナノインジェクションとレーザースペックルコントラストイメージングアッセイの組み合わせ
この記事について
サマリー
要約
脳血流(CBF)の調節は認知機能の維持に不可欠ですが、その根本的なメカニズムはよくわかっていません。この制御に関与する細胞および分子プロセスを調査するには、脳の血流ダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にしながら、脳脊髄液(CSF)への正確な薬物送達を可能にする薬理学的アプローチが必要です。本論文では、ナノインジェクターを用いた大槽内マグナ(ICM)注射とレーザースペックルコントラストイメージングを併用することで、 in vivo で脳血流調節を研究する方法を紹介します。
ナノリットルインジェクターベースのICM注入技術により、nL/minからμL/minまでのダイナミックレンジで正確な薬物送達が可能になります。私たちの実験では、このアプローチにより、注入量が従来の5〜10μLからわずか1.5μLに大幅に減少し、それによって正常な頭蓋内圧が維持されました。レーザースペックルコントラストイメージングと組み合わせることで、ICM注射前、注射中、注射後の脳血流(CBF)ダイナミクスをリアルタイムでモニタリングすることができました。
この方法を用いて、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)、アセチルコリン、アデノシンの3種類の血管拡張薬のICM注射に対するCBFの変化を評価しました。3つの血管拡張薬はすべて基礎CBFを増加させましたが、CBFダイナミクスには明確な影響を及ぼしました。例えば、アデノシンの影響は一過性であったのに対し、DHPGとアセチルコリンは長期的な効果をもたらしました。その独自の利点により、この方法は、 in vivoでのげっ歯類のCBF調節を研究するためのツールボックスへの貴重な追加を表しています。
概要
脳血流(CBF)は、正常な認知機能を維持するために不可欠な代謝老廃物を取り除きながら、脳への酸素と栄養素の継続的な供給を確保します1,2。恒常性条件下では、CBFは灌流圧力の変動にもかかわらず比較的安定したままです。このプロセスは、自己調節3,4,5として知られています。自己調節に加えて、局所CBFは、近くのニューロン活動に応じて動的に調整することができ、これは神経血管結合と呼ばれる現象である6,7。自己調節と神経血管結合は、内皮細胞、壁細胞、アストロサイト、線維芽細胞、ニューロンなどの細胞群によって調節されており、これらを総称して神経血管単位細胞として知られている4,7。しかし、これらの異なる細胞タイプがCBFを調節するために協調する細胞および分子メカニズムは、まだほとんどわかっていません。
CBF制御を調べる方法は、一般的にin vitroモデルとin vivoモデルに分けられます。インビトロ研究は、しばしば急性脳切片を使用し、通常、電気生理学的または薬理学的手法と組み合わせて、ニューロンおよびグリア細胞が個々の血管の拡張または収縮をどのように調節するかを調べる8,9,10。in vitroモデルの主な制限は、特に生理学的血圧が存在しないというin vivo条件を再現しないことです。CBF制御を研究するためのin vivoモデルは、マクロスケールからミクロスケールのアプローチまで多岐にわたります。陽電子放出断層撮影法(PET)や機能的磁気共鳴画像法(fMRI)などのマクロスケール技術は非侵襲的ですが、空間的および時間的分解能が低くなります11,12,13,14。
in vivoでCBFを研究するための主要なマイクロスケールの方法は、高い時空間分解能9,15,16,17,18を提供する2光子イメージングです。しかし、この技術は頭蓋骨と硬膜の除去を必要とし、薬理学的操作と組み合わせると、さらに侵襲的になり、出血を引き起こし、脳組織を損傷し、頭蓋内圧を変化させる可能性があります19。したがって、in vivoでCBFを操作およびモニタリングする方法は、非侵襲的(頭蓋骨、軟髄膜、血管の完全性を維持する)、高い時空間分解能を提供し、CBFの正確な薬理学的操作を可能にするという特定の基準を満たすことが重要です。この論文では、ナノリットルインジェクターベースの槽内マグナ(ICM)注入とレーザースペックルコントラストイメージングを組み合わせて、これらすべての要件を満たす新しい方法を紹介します。
CBFの制御を研究するための従来の薬理学的アプローチでは、頭蓋骨と髄膜を切除して脳組織を露出させ、局所的な薬物送達を行うことがよくあります。対照的に、ICM注射は、薬物を脳脊髄液(CSF)に直接投与することでこの損傷を回避し、脳脊髄液の自然な流れに従うことで、生理学的状態をよりよく模倣できるようにします。ICM注入の課題の1つは、通常、大量の液体(マウスでは5μL以上)が必要になることです20。成体マウスの総CSF量が約36μLであることを考えると、5μLを注入すると頭蓋内圧が上昇し、CBFダイナミクスが変化する可能性があります。ガラスピペットを使用したナノインジェクターシステムは、注入部位でCSFの漏れを引き起こすことなく、容量と速度を精密に制御して流体を供給します。
ウレタンとα-クロラロースは、脳血流のより安定した生理学的ベースラインを提供し、イソフルランやケタミン/キシラジン(KX)などの一般的に使用される代替品よりも神経血管結合(NVC)をよりよく維持するため、私たちの研究で使用されています。このシステムを用いて、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)、アセチルコリン、アデノシンの3種類の血管拡張薬を試験し、 in vivoでのCBF動態の精密な操作とモニタリングが可能であることを確認しました。
プロトコル
このプロトコルは、バージニア大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての実験は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠していました。実験には、10〜14週齢の6匹の雄C57BL/6マウスを使用しました。外科的処置の概要を 図1Aに示します。
1. 手術の準備
- 脳定位固定装置フレームに加熱パッドを置き、手術の20分前に37°C~20分に予熱します。麻酔のために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に新鮮なウレタン(750 mg / kg)とクロラロース(50 mg / kg)を準備します。
注:PBS中のα-クロラロース溶液の調製のために、溶液を40°Cの水浴で加熱し、完全に溶解するまで10〜15分ごとにボルテックスしました。ウレタン溶液とα-クロラロース溶液の両方を、使用前に0.22μmシリンジフィルターを使用してろ過しました。 - 手術の前に、はさみ、鉗子、マイクロニードルホルダー、止血剤、綿棒、ワイパー、縫合糸など、必要なすべての手術器具を集めてください。オートクレーブ(121°C、15psi、60分間)により、装置を滅菌します。
- ガラスキャピラリーチューブ(外径1.14mm、内径0.53mm、長さ88.9mm)を準備します。グラスプーラーを使用して、注入用のガラスピペットを作成します21。推奨されるピペット 抵抗 は約 80〜100MΩです。ガラスピペットを滅菌し、清潔な容器に保管します。
- 適切な注入量(25 nL - 4.5 μL)と速度(6 nL/s - 644 nL/s)のナノインジェクターを調製します。
- 人工脳脊髄液(aCSF)に次の血管拡張液を調製します:(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)を5 mM、アセチルコリンを0.5 mM、アデノシンを10 mMに調製します。
- 手術中の痛みを和らげるためにメロキシカム(4.0 mg / kg)を準備します。.手術の約30分前にマウスにメロキシカムを皮下投与し、適切な鎮痛を確保します。.
2.外科的処置
- 6匹のC57BL / 6雄マウス(10〜14週齢)の体重を量り、ウレタン(750 mg / kg)とクロラロース(50 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔をかけます。.マウスを1%イソフルランを含む麻酔チャンバーに入れて、麻酔を維持します。このプロセスには約40分から1時間かかります。
注:イソフルランは麻酔の導入をスピードアップすることができます。 - マウスを麻酔室から慎重に取り出し、つま先つま先つまみ反射がないことを確認して麻酔の深さを評価します。綿棒を使って、頭蓋骨の上部と首の後ろに脱毛クリームを塗り、毛皮を取り除きます。
- 乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗布し、手順全体で必要に応じて再塗布します。.実験中は定期的に監視し、必要に応じて追加の軟膏を投与します。
- マウスを脳定位固定装置フレーム内で腹臥位に置き、1〜2 L / minの流量で医療用空気で十分な換気を確保します。マウスをイヤーバーで固定して適切に固定し、頭をゆっくりと下に傾けて体と120°の角度を形成し、大槽を露出させます。
注:イソフルランは麻酔導入にのみ使用され、維持段階では使用されません。 - 70%アルコールと外科用スクラブ(クロルヘキシジンまたはポビドンヨードなど)を少なくとも3回交互に使用して、手術部位を消毒します。
- 手術用顕微鏡で後頭部の稜を見つけます。ピンセットで上にある皮膚を持ち上げ、正中線を1cm切開します。綿棒で出血をコントロールします。
- 首の筋肉を露出させ、鉗子を使用して正中線に沿って慎重に切開して分離します。両手に1つずつ、2つの湾曲した鉗子を使用して、筋肉を静かに引っ込め、大槽の外側の境界を形成する硬膜を露出させます。
- 頭の位置を下に傾けて体と150°の角度を形成し、大槽の最適な露出になるように調整します。
- 矢状縫合糸に沿って5mmの切開を行い、ラムダとブレグマの両方のポイントをカバーします。湾曲した2本の鉗子を使用して、皮膚をそっと脇に引っ張り、生理食塩水で頭蓋骨の表面をきれいにします。露出した頭蓋骨に髪の毛が残っていないことを確認してください。
- 洗浄後、綿棒を使用して露出した頭蓋骨に厚さ~1mmの超音波ジェルの層を塗布し、その領域の水分を維持します。超音波ゲルには気泡が含まれている可能性があるため、イメージングする前にすべての気泡が除去されていることを確認してください。
- マウスをレーザースペックルコントラストイメージングシステムのレンズの下に置きます。システムおよびそれに付随するソフトウェアの電源を入れます。マウスの脳がイメージングフィールドの中央にあることを確認してから、オートフォーカス機能を使用してイメージングに正しい焦点を合わせます。必要に応じて、ピンセットを使用してイメージングフィールドから残っている毛や気泡をそっと取り除きます。
3. ナノインジェクションのセットアップ
- ポンプを定位固定装置アームに固定し、ケーブルをコントローラーに接続します。コントローラーの電源を入れ、対象のポンプを選択します。コントロールパネルで、 DIRECTION を INFUSEに設定します。速度を毎分2μlに、容量を4.5μlに設定します。
注:ナノインジェクションシステムは、インジェクションポンプとコントローラーの2つの主要コンポーネントで構成されています。各コントローラは、2つのポンプを同時に操作できます。ICMインジェクションでは、ポンプを1台のみ使用します。 - INFUSEが完了したら、容器からガラスピペットを1本取り出し、34 GのMicroFilフレキシブルニードルまたは同様のタイプのニードルを使用して、無色無臭のミネラルオイルで満たします。ガラスピペット全体がオイルで満たされていることを確認してください。
- ポンプのコレットを緩め、ガラスピペットを挿入してから、コレットを締めます。ガラスピペットの内部に気泡が存在しないことを確認してください。
- WITHDRAWのコントロールパネルのDIRECTIONを変更します。速度を2 μ L / minに、ボリュームを4.5 μ Lに設定します。
- 脳定位固定アームを動かして、ピペットを調製した溶液に静かに導入し、目的の容量を引き出します。
4. 大槽への血管拡張薬の注射とCBFのモニタリング
- ポンプが定位固定装置アームにしっかりと固定されていることを確認してください。定位固定装置用マニピュレーターアームの角度を前後面で45°に調整します。
- 解剖顕微鏡下で湾曲したピンセットを使用して、大槽を慎重に露出させます。生理食塩水でその部分をきれいにして、血液を取り除きます。定位固定装置マイクロマニピュレーターを使用して、ガラスピペットを大槽の硬膜の近くに配置します。
- ガラスピペットが硬膜に触れたら、小脳や髄質への侵入を避けながら、大槽の中心を通過するように静かに操作します。ピンセットを放す前に、ガラスピペットの先端が1〜2mmの深さまで挿入されていることを確認してください。
注:デジタル定位固定装置フレームは、ガラスピペットが大槽に浸透する深さを監視するために不可欠です。 - コントロールパネルの DIRECTION を INFUSEに変更します。 注入速度を 300 nL/min に、 容量を 1.5 μL に設定します。
- レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)用のソフトウェアを起動し、フォーカスを調整して血管の最も鮮明な画像を実現します。フィールドに髪の毛や気泡がないことを確認してください view。
- LSCIコントロールパネルでイメージング間隔を5秒に設定します。ベースラインCBFを約10分間記録し、ベースラインが安定していることを確認します。ベースラインに変動がある場合は、安定性が得られるまで、より長い期間記録を続けます。
- 10分間の安定したベースライン記録の後、ナノインジェクションを開始し、LSCI記録システムでインジェクション開始時間を記録します。注入が完了したら、終了時間をマークし、さらに20分以上録音を続けます。実験終了後、マウスにPBSを経cardiac 灌流し、組織学的解析のために脳組織を採取します。
結果
手術終了後、マウスをデジタル読み出し付きの定位固定装置フレームに固定しました(図1A、B)。脳血流(CBF)測定では、切開後に頭蓋骨の上の皮膚を慎重に引き離し、透明な超音波ゲルを適用して頭蓋骨の表面の水分を維持しました(図1C)。大槽内注射(ICM)を促進するために、後頭頂部周辺の首の筋肉を解剖して大槽を露出させました。その後、ガラスピペットで目的溶液を採取し、マイクロマニピュレータを用いてガラスピペットを誘導し、大槽の膜を1〜2mmの深さまで浸透させます(図1D、E)。定位固定アームは、挿入を補助するために45° の角度で傾けられました。
次に、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)、アセチルコリン、アデノシン22,23,24,25の3種類の血管拡張薬に対するCBFの動的変化を調べました。最初に 10 分間のベースラインを記録してから、各血管拡張薬 1.5 μL を 300 nL/min の速度で 5 分間にわたって注入しました。注射後、さらに20分間のデータを記録しました。その結果、3種類の血管拡張薬すべてがCBFを増加させることが示されましたが、そのダイナミクスは異なります。DHPGはCBFの急激な増加を誘発し、その後、注射後に徐々に減少しました(図2A、B)。対照的に、アセチルコリンは記録期間を通じてCBFの緩やかな増加を誘発しました(図2C、D)。アデノシンはまた、CBFの一時的な増加を引き起こし、注射後約15〜20分でベースラインレベルに戻りました(図2E、F)。
図1:手術手順の概要(A)ナノインジェクション+LSCIモデルの主な手術手順を段階的に説明します。(B)ナノインジェクション+LSCIを組み合わせたシステムを示す模式図。ナノインジェクターは脳定位固定装置アームに安定して固定され、アームは45°傾けられて、大槽の環後頭膜の浸透を促進します。(C)LSCIシステム下のマウスの頭蓋骨の上から見た図。頭蓋骨は超音波ジェルで覆われています。(D)ガラスピペットが槽のマグナを貫通していることを示す背面図。ガラスピペットは、視覚化を容易にするためにエバンスブルーで満たされました。この実験では、デジタル定位固定装置フレームを使用して、侵入距離を正確に定量化できます。(E)大槽のガラスピペットチップの位置を示す概略図。マウスの頭を30°傾けて、大槽の注射を容易にしました。略語:LCSI =レーザースペックルコントラストイメージング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管拡張薬のナノ注射後の脳血流の増加(A)DHPG注射前後の脳血流の変化を示す代表的な画像。血速は色分けされています。青は低速、赤は高速を表します。(B)DHPG注射の時間枠を示す赤い線でマークされた領域のリアルタイムの血流。(C)ACh注射前後の脳血流変化を示す代表的な画像。血速は色分けされています。青と赤はそれぞれ低速と高速を示します。(D)赤い線でマークされた領域のリアルタイムの血流は、ACh注射の時間枠を示しています。(E)アデノシン注射前後の脳血流の変化を示す代表的な画像。血速は色分けされています。青と赤はそれぞれ低速と高速を示します。(F)アデノシン注射の時間枠を示す赤い線でマークされた領域のリアルタイムの血流。略語:DHPG =(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン;ACh =アセチルコリン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
私たちは、精密な槽マグナナノ注射とレーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)を組み合わせることにより、 in vivo で脳血流(CBF)制御を調査する新しい方法を提示します。このアプローチにより、脳脊髄液(CSF)への正確な薬物送達が可能になると同時に、CBFのリアルタイムモニタリングが可能になり、脳血管反応性の評価が容易になります。
薬理学的操作と薬物送達技術は、in vivo での CBF および脳血管反応性の研究に不可欠です。血管拡張薬や収縮薬の使用など、薬物適用のための伝統的な方法は、しばしば頭蓋骨の除去を必要とし、これにより軟髄膜や脳実質にさえ損傷を与える可能性がある9,10,18。これらの侵襲的な技術は、特に血管の損傷や出血を引き起こすことにより、脳の微小環境を混乱させ、それによって実際の生理学的条件を再現できなくなる可能性があります。それに対して、私たちの方法には4つの大きな利点があります。
まず、私たちの薬物適用アプローチは非侵襲的であり、生理学的状態を維持します。第二に、従来のICM注射法は通常、注射器またはカニューレに依存しており、チップのサイズが大きいため、薬物や微量、およびCSFの漏れにつながる可能性があります。これらの従来の方法では、多くの場合、大量の薬物または微量(通常は5μL以上)が必要であり、頭蓋内圧を変化させる可能性があります。これに対し、当社のナノインジェクターガイドICM注入は、1.5μL以下の少量で済みます。さらに、射出速度は1nL/sから100nL/sまでの広い範囲で正確に制御できます。通常、5 nL/s (300 nL/min) の速度を使用しますが、これはこの速度が頭蓋内圧に影響を与えないためです。第三に、ピペットガイドによる脳実質への薬物注射や皮質表面への薬物灌流とは異なり、大槽注射による薬物送達はCSFの自然な流れに従い、生理学的条件を密接に模倣しています。最後に、私たちの方法は頭蓋骨と髄膜の完全性を維持するため、同じマウスグループを異なる時点で測定することができ、他の薬物適用方法では実現不可能な縦断的な比較が可能になります。生存試験と縦断的比較のためには、適切な皮膚の準備、滅菌器具と材料の使用、施設の動物管理ガイドラインの遵守など、厳格な無菌技術に従う必要があります。創傷治癒のために2週間の回復期間を許容する必要があります。.
麻酔の方法は、CBFに大きな影響を与える可能性があります。例えば、ケタミン-キシラジン麻酔はCBFをベースラインレベルより50%以上上昇させることができ、イソフルランは基礎CBFレベルを2倍にすることができます。私たちの実験では、ウレタンとクロラロースを選択しました 心血管系への影響が最小限であり、この分野で一般的に使用されているCBFの生理学的レベルを維持するのに役立ちます26,27。さらに、非侵襲的であるために、反復血液ガス測定のための動脈内カニューレ挿入をスキップしましたが、そのような手順は私たちの方法と組み合わせることができます26。
私たちのアプローチは、ナノインジェクションベースのICMインジェクションシステム28 とレーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)システム29の2つのシステムを統合しています。実験者は、手順を正常に実行するために、両方のシステムでトレーニングを受ける必要があります。LSCIシステムはマウスの頭上のすべてのスペースを占めるため、アームを45° 傾けるとICM注入が容易になるだけでなく、2つのシステム間の互換性も確保されます。この設定は、実験を成功させるために重要です。
ナノインジェクターガイドICMインジェクションを使用する初心者は、片手でピンセットで筋肉を分離し、もう片方の手でマイクロマニピュレーターを操作してガラスピペットをガイドするコーディネーションを習得するには、広範な練習が必要です。優れたレーザー光線と関節式アーム実体顕微鏡は、手術中の最適な視覚化に不可欠です。
この方法を用いて、DHPG、アセチルコリン、アデノシンなどの古典的な血管拡張薬がCBFにどのような影響を与えるかを評価した。予想通り、3つの血管拡張薬すべてがCBFを増加させました。しかし、それらは異なるダイナミクスを誘発しました。DHPGはCBFの急激な増加を引き起こし、その後ゆっくりと崩壊しましたが、アセチルコリンは緩やかな増加を誘発しました。対照的に、アデノシンはCBFの一時的な上昇しかもたらさなかった。
この方法は、ラットモデルにも適用できるはずです。しかし、ラットの頭蓋骨の厚さが約0.5〜1mmであることを考えると、レーザースペックルコントラストイメージングのためには、頭蓋骨を薄くする必要があります。さらに、現在の方法は頭部固定覚醒マウスにも適応できますが、実験中の動物の動きを最小限に抑えるためには、広範な訓練が必要です。限られた数のマウスを使用して、私たちの方法をデモンストレーションしました。したがって、私たちの研究は統計的に制約されており、調査結果から幅広い結論を引き出す際には注意を払う必要があります。
一貫性と信頼性のあるCBF測定のためには、体温、血圧、CO2 レベルなどの他の生理学的パラメータが包括的な生理学的評価において重要な役割を果たしていることを実験者が認識することが重要です。また、今後の研究では慎重に検討する必要があります。要約すると、マウスのCBF制御を研究するための新しい in vivo 法を紹介します。このアプローチは正確で低侵襲であるため、薬物誘発性CBFダイナミクスの研究に適しています。
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、NIHの助成金(NS108763、NS127392、NS125788、NS125677)によって支援されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン | Tocris | Cat.No. 0342 | |
| 塩化アセチルコリン | シグマ | A6625-25G | |
| アデノシン | シグマ | A9251-25G | |
| アルコール綿棒 70% イソプロピルアルコール | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| AmScope SM-8T シリーズ 関節アームズーム実体顕微鏡 | AmScope | SM-8TZ-144S-10M | |
| アクアソニック クリア超音波透過ゲル | AquasonicGel | PLI 03-50 | |
| デジタルマウス定位固定装置 | Stoelting | 51730D | |
| エチルアルコール | シグマ | 459836-2L | |
| Fiber-Lite DC950 イルミネーター | Dolan-Jenner industries | DC950H | |
| ガラス交換用 1.14 MM | World Precision Instruments | 504949 | |
| Kimtech Science Precision Wisesティッシュワイパー | キンバリークラーク | 5511 | |
| レーザースペックルコントラストイメージャー | ムーアインスツルメント | MOORFLPI-2 | |
| レーシックアイスピア (ケースあたり 100 個) | hospeq | BV40815 | |
| MICROFIL FLEXIBLE NEEDLE | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| ミネラルオイル | シグマ | M5904 | |
| マウス加熱パッド | フィッシャーサイエンティフィック | 50-195-4000 | |
| ネア ココアバター 脱毛ローション | アマゾン | ASIN : B000GCW5CS | |
| NANOLITER 2020 インジェクター | ワールドプレシジョンインスツルメンツ | NANOLITER2020 | |
| P-2000 マイクロピペットプーラー | サッターインストゥルメント | P-2000 | |
| ピューリタン®綿棒、コットンヘッド、ウッドシャフト、 | ピューリタンメディカル | 806-WC | |
| 滅菌眼潤滑剤 | Medi-Vet | 11897 | |
| レタン | シグマ | U2500Vetbond | |
| 接着剤 | Precision Instruments | VETBOND | |
| &α;-クロラロース | グマ | 23120 |
参考文献
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再版と許可
