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方法論記事

がん免疫療法のためのmRNAを用いた一過性キメラ抗原受容体T細胞を作製するための非ウイルス性アプローチ

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DOI:

10.3791/67548

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2025年2月21日

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1ProMab Biotechnologies

この記事について

サマリー

このプロトコルは、がん免疫療法のために非統合mRNAを使用して一過性キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を生成するための詳細な手順を概説し、CAR-T細胞とその細胞毒性機能を評価するための信頼性の高い方法を提供します。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、先駆的ながん治療法として登場し、リンパ腫や白血病などの特定の血液悪性腫瘍の治療において前例のない成功を収めています。しかし、CAR-T細胞療法を受けるがん患者が増えるにつれ、予期せぬCAR導入遺伝子の挿入もあって、治療に関連した二次性原発性悪性腫瘍の報告が増えており、安全性に対する深刻な懸念が生じています。この問題に対処するために、ここでは、mRNAを使用して一過性CAR-T細胞を作製するための非ウイルス性、非統合性のアプローチについて説明します。ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)特異的CARをコードする改変mRNAでT細胞をエレクトロポレーションし、一過性のHER2標的CAR-T細胞を作製しました。CARは、エレクトロポレーションの1日後にT細胞表面に効率的に発現し、2日目までに増加し、5日目までに劇的に減少しました。一過性CAR-T細胞は、HER2陽性SKOV-3卵巣癌細胞に対して強力な細胞毒性を示し、高レベルのIFN-Υを分泌しました。このプロトコールは、恒久的なCAR導入遺伝子の統合を伴わない小規模な一過性CAR-T細胞を開発するためのステップバイステップのガイドを提供し、CAR mRNAの調製、T細胞の活性化とトランスフェクション、CAR発現の評価、およびCAR-T細胞機能の in vitro 分析の詳細な手順を説明しています。この方法は、前臨床研究と臨床研究の両方で一過性のCAR-T細胞の作製に適しています。

概要

がんは人間の健康に対する脅威としてますます重要になっており、世界中で年間推定2,360万人が新たに診断され、1,000万人が死亡していると推定されています1。放射線療法および化学療法と組み合わせた外科的治療は、さまざまな種類の限局性非浸潤性および浸潤性がんに対する治療のゴールドスタンダードであり続けています2,3,4。従来の体系的な治療法は、早期がんの管理において大きな成功を収めていますが、非常に毒性が高く、転移性がんや血液がんへの影響は限られています5。これらのがんの患者は、疾患の安定化と進行の遅延を期待して、頻繁な治療を受け、重大な毒性に耐えます。キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、B細胞血液がんに対する強力な有効性を実証し、これらの絶望的な患者に希望を提供する革新的な標的療法として最近浮上しています6。

CAR-T細胞は、腫瘍関連抗原(TAA)を特異的に認識し、主要な組織適合遺伝子複合体タンパク質(MHC)からの抗原提示を必要とせずに細胞を活性化するCARを細胞表面に発現する遺伝子操作Tリンパ球です7。活性化すると、CAR-T細胞はサイトカインのパネルを分泌し、MHCとは無関係に腫瘍細胞を溶解するため、免疫抑制性腫瘍微小環境8,9によりMHCがダウンレギュレーションされたり失われたりしても、腫瘍の破壊を促進する。CARは、TAA特異的抗体の抗原認識可変領域を含む細胞外一本鎖フラグメントバリアント(scFv)、CARを細胞表面に固定する膜貫通ドメイン、およびアダプタータンパク質の動員と下流のシグナル伝達を媒介する細胞内ドメインの少なくとも3つの異なるドメインで構成されています10.細胞内ドメインの変動に基づいて、CAR構造はこれまでに5世代にわたって進化しており、最初の世代はCD3ζ活性化ドメインのみを含み、その後の世代は4-1BBやCD28などの分子からの1つ以上の追加の共刺激ドメインを持っています11。これらの細胞内ドメインは、CAR-T細胞のシグナル伝達メカニズム、増殖、生存、および毒性に影響を及ぼし、これらが一緒になって臨床的な抗腫瘍効果を決定します。CAR-T細胞療法の臨床的成功は、B細胞白血病およびリンパ腫を治療するために、B系統細胞に高発現するバイオマーカーであるCD19を特異的に標的とする第2世代CAR-T細胞から来ている12,13。現在までに、食品医薬品局(FDA)は、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫6などの再発または難治性の血液悪性腫瘍に対して、CD-19またはB細胞成熟抗原(BCMA)のいずれかを標的とする6つの第2世代CAR-T細胞療法を承認しています。新世代のCAR-T細胞は現在、集中的な前臨床および臨床研究を受けている14,15。

CAR-T細胞の臨床生産は、複雑で、費用がかかり、時間のかかるプロセスです。現在、CAR-T細胞の調製に使用される白血球は、同種異系反応を避けるために患者自身に由来していますが、ドナー由来のユニバーサル(または既製の)CAR-T細胞は活発な開発と臨床評価が行われています16。白血球交換による患者の末梢血からの白血球の単離に続いて、CARをコードする外来遺伝子断片が、ウイルス性または非ウイルス性のアプローチ17,18,19を用いて活性化T細胞に導入される。レトロウイルスおよびレンチウイルスは、CAR遺伝子送達の最も一般的なウイルスベクターであり、その結果、CARをコードするDNAがT細胞ゲノム20にランダムかつ恒久的に組み込まれる。mRNA-脂質ナノ粒子、トランスポゾンシステム、CRISPR/Cas9ゲノム編集などの非ウイルス性アプローチは、あまり一般的ではありません21。その後、CAR発現T細胞は、ex vivoで大規模に増殖し、次いで収集され、患者22,23に再注入される。厳格なGMP(Good Manufacturing Practice)基準を満たすウイルスベクターの製造は、非常に困難で複雑で、コストがかかるため、製造業者、規制当局、患者に大きな負担がかかり、広範な臨床応用が制限されています。

CAR-T療法のエキサイティングな成功にもかかわらず、その安全性に対する懸念が高まっています。ウイルスまたはトランスポゾン形質導入中のT細胞ゲノムへのCAR導入遺伝子の統合のランダムな性質を考えると、腫瘍抑制遺伝子の破壊または癌遺伝子の活性化が起こり、T細胞の悪性形質転換につながる可能性がある24,25。2017年にFDAが最初のCAR-T細胞治療製品を承認して以来、追跡調査では、治療を受けた患者の15%がT細胞リンパ腫(TCL)、非小細胞肺がん(NSCLC)、皮膚がんなどの二次性原発性悪性腫瘍(SPM)を発症していることが示されています26、27、28、29。驚くべきことに、CAR導入遺伝子は一部のSPMで高度に検出され30,31、TCLの一部の症例はCAR-T細胞の異常な増殖によって直接引き起こされ24,32,33、一部のSPMsを誘導するCAR-T生成物の直接的な役割を示している。他の研究では、SPM腫瘍細胞のTET234、JAK135、PBX236などの重要な遺伝子におけるCAR導入遺伝子の挿入がさらに同定されました。CAR-T細胞療法後のT細胞悪性腫瘍の蓄積された証拠に照らして、FDAは最近、現在承認されているすべてのCD19指向およびBCMA標的CAR-T細胞療法に対して、T細胞悪性腫瘍の深刻なリスクを強調する枠付き警告が必要であると結論付けた37。しかし、CAR-T治療の長期的効果を追跡した大規模コホート研究では、治療を受けた患者におけるSPMの発生率が3.8%から15%の範囲であると報告されている26,27,28,38,39。この発生率は、従来の系統的治療を受けている血液がん患者で観察されたものよりも有意に高くはなく、40,41、CAR-T細胞療法の比較的安全なプロファイルを示唆しています。それにもかかわらず、より費用対効果の高いアプローチを通じてSPMのリスクを最小限に抑える、安全で効果的なCAR-T細胞の開発が急務です。

ここでは、CAR-T細胞を作製するための非ウイルス性、非統合型アプローチの詳細なプロトコールについて説明します。その目標は、一過性のCAR発現を持つ小規模で効果的なCAR-T細胞を作製するための簡単なステップバイステップのガイドを提供することで、挿入突然変異誘発を回避し、SPMのリスクを最小限に抑えることです。我々は、TAA HER2に特異的なCARをコードする修飾mRNAを用いたT細胞のエレクトロポレーションが、T細胞表面における抗HER2 CARの堅牢かつ一過性の発現をもたらしたことを示す。CARを発現させている間、T細胞はHER2陽性腫瘍細胞を強力に殺傷し、高レベルのIFN-Υを分泌しました。このプロトコールは、CAR mRNAの調製、T細胞の活性化とエレクトロポレーション、CAR発現の評価、およびCAR-T細胞の機能の分析を含む4つの別々の連続的なセクションで説明されています。このアプローチは、学術研究と臨床細胞療法の両方のための一過性CAR-T細胞の開発と製造に適しています。

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プロトコル

ここで使用したPBMCは、以前に述べた42のFicoll-Paque密度勾配を使用して、Institutional Review Board(IRB)が承認したプロトコル(13942)に従って、スタンフォード病院血液センターの全血から以前に分離されました。PBMCの収集に使用した血液はスタンフォード病院血液センターから商業的に入手したため、参加者のインフォームドコンセントは適用されませんでした。

1. CAR.のmRNAの調製

  1. テンプレートの準備
    注:線形化プラスミドまたはPCRフラグメントは、適切な5' SP6またはT7プロモーター、5'非翻訳領域(UTR)、CAR導入遺伝子、および適切なポリ(A)テールを持つ3'UTRを含んでいれば、in vitroでCAR mRNAを合成するためのテンプレートとして役立つことができます。この研究では、SP6プロモーター、短いヒトβ-グロビン5'UTR、CAR導入遺伝子、および2つのタンデムβ-グロビン3'UTRと112bpポリ(A)テール43で構成される3'UTRを含むCARプラスミドDNAコンストラクトを使用しました。UTR、コード配列、およびポリ(A)テールはすべて、RNAの安定性と翻訳効率に影響を与えます43,44,45。120 bpのポリ(A)テールは、短いポリ(A)テールと比較して、細胞培養中のタンパク質収量を増加させることが示されている43。
    1. メーカーの指示に従って、プラスミド調製キットを使用してCARコンストラクトプラスミドDNAを調製します。高品質のプラスミドDNAは、CAR/CAR/mRNAを高収量で生成するために不可欠です。
    2. 制限酵素BglIIでCARプラスミドDNAを直鎖化します。ポリ(A)テールの後、ポリ(A)テールの末端に優先的に近い位置で切断する制限酵素を選択します。分光光度計で定量したプラスミド10 μg(または10,000 ng)を、10 Uの酵素、10 μLの消化バッファー、およびヌクレアーゼフリー水を含む100 μLの反応ミックスで、37 °Cで一晩消化します。
      注:制限酵素がCAR導入遺伝子とその隣接するプロモーター、UTR、およびポリ(A)テール配列内に切断されないことを確認してください。CARプラスミドの完全な直鎖化は、効率的なCAR mRNA転写に必要です。
    3. 200 μg/mL プロテアーゼ K と 0.5% w/v SDS を消化ミックスに加え、50 °C で 1 時間インキュベートします。
    4. 直鎖化されたCARプラスミドDNAを精製します。同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v / v)を消化反応に加えます。約15秒間激しく渦を巻きます。ベンチトップ遠心分離機でサンプルを室温(RT)で最高速度5分間回転させます。
    5. DNAを含む上部水層を新しい微量遠心チューブに移します。タンパク質やフェノール不純物を含む中間層と下層の移動は避けてください。クロロホルムで2回目の抽出を行い、不純物を減らします。
    6. 1/10容量 の 7.5 M 酢酸アンモニウムまたは 3 M 酢酸ナトリウムを加え、穏やかに混合します。2.5容量のエタノールを加えてDNAを沈殿させます。サンプルを-20°Cで少なくとも30分間保存します。
    7. サンプルを最高速度で4°Cで15分間回転させ、DNAをペレット化します。上清を慎重に取り除きます。500 μLの70%エタノールを加えてDNAペレットを洗浄します。
    8. サンプルを4°Cで2分間再度遠心します。 上清を慎重に取り除きます。チューブに少量の溶液を残します。
    9. 4°Cで2分間スピンを繰り返します。 残りの上清を慎重に取り除きます。DNAペレットをRTで滅菌フード内で約10分間、チューブの底にエタノール溶液が見えなくなるまで風乾します。
      注:DNAペレットは溶解しにくい場合がありますので、過度に乾燥させないでください。
    10. ヌクレアーゼフリーの水20μLを加え、ピペで軽く上下させてDNAを溶解します。サンプルを最高速度で短時間遠心分離します。分光光度計でDNA濃度を測定します。
    11. サンプルは、すぐに使用するために氷上に保存するか、将来の使用のために-20°Cで保管します。精製したDNA100 ngをアガロースゲルにロードし、サイズと完全性を確認します。DNAは、予想されるサイズの単一の異なるバンドとして表示されるはずです。余分なバンドや汚れたバンドは観察しないでください。
      注:テンプレートDNAの品質は、効率的なmRNA転写にとって重要です。不純なDNAや断片化されたDNA、劣化したDNAをmRNA転写のテンプレートとして使用することは避けてください。
  2. インビトロ 転写(IVT)
    1. CAR mRNAを in vitroで合成します。手順全体を通して、ヌクレアーゼフリーの試薬、チューブ、およびピペットチップを必ず使用してください。
    2. 表1に記載されている試薬をRTまで解凍しますが、SP6 RNAポリメラーゼミックスは使用まで-20°Cで保存する必要があります。表1に示す順序で転写反応をRTで調製し、穏やかに混合し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。
      注:反応は、必要なmRNAの量に基づいてスケールアップまたはスケールダウンできます。上記の反応では、高品質のテンプレートDNAを使用した場合、通常、少なくとも100 μg(または100,000 ng)のキャップ付きmRNAが得られます。インキュベーション時間が長い、つまり一晩でインキュベートすると、mRNAの収量が増加する可能性があります。
    3. 2 μL の RNase フリー DNase I を反応液に加え、穏やかに混合し、37 °C で 15 分間インキュベートしてテンプレート DNA を分解します。
    4. RNAクリーンアップキットを使用して、転写したCAR mRNAを精製します( 材料の表を参照)。精製については、キットの製造元の指示に従ってください。mRNAをヌクレアーゼフリー水で溶出します。
      注:mRNAは、上記のフェノール-クロロホルム抽出法(ステップ1.1.4)を使用して精製することもできます。
    5. 分光光度計でmRNA濃度を測定します。アガロースゲルに少なくとも200 ngのmRNAをロードし、そのサイズと完全性を確認します。mRNAは、追加のバンドや汚れたバンドがなく、予想されるサイズのドミナントバンドとして現れるはずです。mRNAは使用するまで-80°Cで保存してください。

2. T細胞の活性化とエレクトロポレーション

  1. 1 x 106 凍結保存されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を1 mLのCAR-T培地(10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン、および10 ng / mlのヒト組換えIL-2を補充したAIM-V培地)に懸濁します。同数のプレウォッシュ済みヒトT-Activator CD3/CD28ビーズでT細胞を活性化します( 材料の表を参照)。細胞を37°Cで培養し、加湿インキュベーターで5%CO2 を入れて数日間増殖します。
    注:PBMCの量は、その後の実験に必要なT細胞の量に基づいてスケールアップまたはスケールダウンできます。
  2. 調製したCAR mRNAを氷上で解凍します。1ウェルあたり1 mLのCAR-T培地を12ウェルプレートの2つのウェルに添加し、プレートをインキュベーターに37°Cで置いて培地を平衡化します。
  3. 5 x 106 T細胞を滅菌チューブに移し、チューブを磁気スタンドに置き、細胞懸濁液を新しいチューブに慎重にピペッティングしてビーズを取り除きます。
  4. チューブを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを滅菌PBS1 mLに再懸濁します。
  5. チューブを再度遠心分離します。上清を捨て、細胞を200 μLのネオンバッファーTに再懸濁します( 材料の表を参照)。
  6. 100μLの細胞を新しいチューブにピペットで移し、5μg(または5,000ng)のCAR mRNAを細胞46に加える。Neon buffer Tを合計125 μLまで添加し、ピペッティングで上下に混合します。
    注:エレクトロポレーションによってトランスフェクションされるCAR mRNAの量は、細胞生存率に悪影響を与えることなく、1 x 106 T細胞あたり最大8 μg(または8,000 ng)まで増加させることができ、mRNAの量が多いとCAR発現の増加につながる可能性があります46。
  7. 残りの100 μLのセルに25 μLのネオンバッファーTを加えます。これはネガティブコントロールとして機能します。
  8. T細胞をエレクトロポレーションします。ネオンピペットを使用して、T細胞/CAR/mRNA混合物またはネガティブコントロールT細胞をネオン100μLチップに吸引し、1800Vの10msパルスで細胞をエレクトロポレートします。
  9. エレクトロポレーション後、直ちに細胞を12ウェルプレート(ステップ2.2で調製)の平衡化した培養培地に移します。
  10. プレートをインキュベーターに戻し、使用する準備ができるまで細胞を拡張します。CAR-T細胞の健全で迅速な増殖を確実にするために、必要になるまで新鮮な培地で細胞密度を1-3 x 106 細胞/mLに維持します。

3. CAR発現の評価

  1. 各ウェルで数回穏やかにピペッティングしてCAR-T細胞を混合し、少なくとも1 x 105 細胞を5 mL FACSチューブに移します。
  2. 3 mLのコールドウォッシュバッファー(2 mM EDTAと0.5% w/v BSAを含むPBS)をチューブに加えます。チューブを500 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
  3. 細胞ペレットを100 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。CAR検出試薬のアロフィコシアニン(APC)結合ヤギ抗ヒトIgG F(ab')2抗体( 材料表を参照)2 μLと生存率色素7-AAD2 μLを懸濁細胞に加えます。
    注:CARは、適切に標識された標的抗原またはCARにタグ(FLAGなど)が含まれている場合は抗タグ抗体を使用して検出することもできます。非標識抗体をCAR検出に使用する場合は、ステップ3.4の後に適切な蛍光標識二次抗体とのインキュベーションが必要です。
  4. チューブを静かに振ってサンプルを混合し、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション中は光を避けてください。細胞を3 mLのコールドウォッシュバッファーで洗浄し、チューブを500 x g で室温で5分間遠心分離します。
  5. 上清を捨て、細胞を100 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。フローサイトメーターを使用して細胞をすぐに解析します。検出試薬の蛍光標識と生存率色素が、適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して適切に補償されていることを確認してください。
  6. 次のゲーティング戦略を使用してCAR発現を評価します:FSC-A対SSC-Aプロットを使用してセルをゲートします。FSC-A対FSC-Hプロットを使用して単一セルをゲートします。7-AAD染色を用いて生細胞をゲートします。
  7. 抗ヒトIgG F(ab')2抗体で染色された生T細胞の割合を計算します。CAR-T細胞をネガティブコントロールT細胞と比較します。ネガティブコントロールT細胞は、染色が最小限に抑えられているはずです。

4. CAR-T細胞機能の解析

  1. 細胞毒性分析
    1. 標的腫瘍細胞がCARによって認識できるコンフォメーションで抗原を発現していることを確認します。抗原の発現を確認するために、CARが由来する親抗体を用いたフローサイトメトリーにより腫瘍細胞を解析します。CARが腫瘍細胞を認識できない場合、CAR-T細胞は腫瘍細胞を殺すことができません。
    2. 細胞表面にCARの抗原を発現する標的腫瘍細胞を調製します。接着腫瘍細胞を0.05%トリプシン-EDTA溶液で37°Cで1分間トリプシン化し、適切な培地で1-4×105 細胞/mLのシングルセル懸濁液を調製します。
      注:腫瘍細胞は、その後のステップで正確な分析を確実にするために、しっかりと付着している必要があります。腫瘍細胞の接着が不十分な場合、容易に剥離する場合、または懸濁液で増殖する場合は、次のステップで使用するプレートのウェルを適切な抗体、ポリカチオン性ポリマー、またはフィブロネクチンやコラーゲンなどの生物学的材料でコーティングして、細胞の接着を促進します。
    3. Eプレートを準備します( 材料の表を参照)。実験のセットアップを設計します。予熱した腫瘍細胞培養培地50 μLを各ウェルに加え、E-PlateをReal-Time Cell Analysis(RTCA)装置に入れてバックグラウンドインピーダンスを測定します。3回のスイープで、測定(またはスイープ)ごとに1分でインピーダンスを測定します。
      注:バックグラウンドインピーダンスは、セルインデックスをゼロに設定するために使用されます。バックグラウンドインピーダンス測定を行わないと、ウェルを相互に比較することができず、結果を解釈できなくなります。
    4. RTCA装置からEプレートを取り外し、各ウェルに100μLの腫瘍細胞懸濁液を加えます。したがって、各ウェルには、総容量150μLに1−4×104 個の細胞が含まれています。
      注:各ウェルに播種する腫瘍細胞の数は、実験前に決定する必要があります。Eプレートにさまざまなセル番号をシードし、次の24〜48時間にわたってセルインデックスを監視します。所望の細胞数は、プラトー化することなく、少なくとも24時間にわたって細胞指数の着実な増加を維持します。過剰な細胞播種は、栄養素の枯渇と培地の酸性化を加速させ、細胞指数の早期プラトー化をもたらす可能性があります。さらに、潜在的な外れ値の測定値を特定するために、各グループにレプリケートウェルを含める必要があります。
    5. Eプレートを室温で30分間平衡化します。このステップにより、腫瘍細胞が沈殿し、ウェルの底に付着します。
      注:この手順は、正確な細胞インデックス測定に必要です。このステップを省略すると、通常、細胞指数の測定値にウェル間のばらつきが生じ、ウェル内での腫瘍細胞の接着が不均一になり、アッセイのノイズが増加します。
    6. EプレートをRTCA装置に戻し、セルインデックスを約24時間監視し、5〜15分ごとにスイープを行います。
    7. 翌日、CAR-T細胞懸濁液を調製します。ステップ 2.10 の CAR-T 細胞 (エフェクター細胞) を RPMI 1640 培地に 10% FBS を加えて、腫瘍細胞 (標的細胞) と目的のエフェクター:標的 (E:T) 細胞比で決定される濃度まで懸濁します。例えば、腫瘍細胞懸濁液の密度が2 x 105 細胞/mLで、E:T比が10:1であることが望ましい場合、CAR-T細胞は2 x 106 細胞/mLに懸濁する必要があります。腫瘍細胞のみ(エフェクター細胞なし)およびコントロールT細胞(mRNAなしでエレクトロポレーションしたT細胞またはコントロールmRNAを使用したT細胞)などの適切なコントロールを含めます。
      注:最適な結果を得るには、エレクトロポレーションの1〜2日後に、表面のCAR発現が高いときにCAR-T細胞を使用してください。最適なE:T比を調べるために、E:T比の範囲(たとえば、3:1から20:1)をテストできます。CAR-T頻度が非常に低い場合、つまり10%未満でない限り、通常、腫瘍細胞をほぼ完全に殺傷するには、E:T比が10:1または20:1で十分です。
    8. セルインデックスの記録を一時停止し、EプレートをRTCA装置から取り外します。
    9. プレートを少し傾け、腫瘍細胞に触れずに各ウェルから50 μLの培地を慎重に取り出し、各ウェルに100 μLのCAR-T細胞または制御T細胞を加えます。
    10. EプレートをRTCA装置に戻し、5〜15分ごとにスイープを行いながら、少なくとも24時間セルインデックスモニタリングを再開します。
      注:細胞インデックスモニタリングの長さは、CAR-T細胞が腫瘍細胞を標的とする速度によって異なります。通常、CAR-T細胞が最大の細胞傷害効果を発揮するには、24時間のインキュベーション期間で十分です。
    11. 細胞インデックスのモニタリングを停止し、E-PlateをRTCA装置から取り外して、細胞毒性結果を分析します。細胞毒性を、CAR-T細胞によって死滅した腫瘍細胞の割合として計算します。RTCAソフトウェアを使用して、CAR-T細胞の平均細胞毒性を計算し、T細胞を制御します。細胞毒性を手動で計算するには、次の式を使用します。
      細胞毒性=((腫瘍細胞の細胞指数)−(腫瘍細胞の細胞指数とエフェクター細胞))/(腫瘍細胞の細胞指数)×100%。
  2. サイトカイン分泌解析
    1. 細胞毒性解析中にCAR-T細胞から分泌されるIFN-Υなどのサイトカインを解析するには、上清をEプレートから丸底またはV字型の96ウェルプレートに移します。
      注:サイトカイン分泌の経時的分析が必要な場合は、ステップ4.1.10で細胞インデックスのモニタリングを一時停止し、各ウェルから上清の少量を採取し、EプレートをRTCA装置に戻し、モニタリングを再開します。
    2. 96ウェルプレートを300 x g でRTで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を新しい96ウェルプレートに慎重に移します。
    3. 市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを使用して、製造元の指示に従って、上清中のサイトカインレベルを測定します。上清は通常、測定前に希釈する必要があり、分析するサイトカインによっては100倍を超えることもあります。
    4. 段階希釈された標準から生成された標準曲線に対してサンプル吸光度値を補間することにより、データを分析します。適切なソフトウェアを使用して、平均±標準偏差(SD)を表すエラーバー付きのグラフを準備します。治療間の差を比較するために、スチューデント のt 検定を実行できます。通常、0.05未満のp値は統計的に有意であると見なされます。
      注:実験誤差による明らかな外れ値であるデータポイントは、分析から除外する必要があります。

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結果

ヒト化抗HER2マウスモノクローナル抗体(mAb)4D547に由来するscFv、膜貫通領域、および細胞内4-1BB共刺激ドメインとそれに続くCD3ζ活性化ドメインを含む第2世代のHER2標的CARを構築しました(図1A)。CARをコードするDNA配列には、 in vitro でCARのmRNAの転写を促進する5' SP6プロモーターが含まれていました(図1B)。CAR mRNAの長さは約2 kbで、これはゲル電気泳動によって検証されました(図1C)。

次に、CAR mRNAを、上記の手順に従ってエレクトロポレーションにより活性化T細胞にトランスフェクションしました。エレクトロポレーションの1日後、細胞の50%以上がCARを発現したのに対し、mRNAなしでエレクトロポレーションしたコントロールT細胞はCAR陰性でした(

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ディスカッション

この研究では、一過性CAR-T細胞を作製するための詳細な非ウイルス性、非統合的アプローチについて説明し、CAR-T細胞の機能を評価するための技術的手順を提供します。このアプローチでは、従来のレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターによる永久およびランダムCAR導入遺伝子の導入を避け、代わりにエレクトロポレーションを活用して、 in vitro で修飾されたCAR mRNAをT細胞に効率的に導入します。この方法により、T細胞表面上での高レベルの一過性CAR発現が可能になり、挿入突然変異誘発に関連するSPMのリスクが大幅に減少します。

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開示事項

著者のLiang Hu氏、Robert Berahovich氏、Yanwei Huang氏、Shiming Zhang氏、Jinying Sun氏、Xianghong Liu氏、Hua Zhou氏、Shirley氏、Xu氏、Haoqi Li氏、Vita Golubovskaya氏は、ProMab Biotechnologiesの従業員です。Lijun Wuは、ProMab Biotechnologiesの従業員であり、株主です。

謝辞

この研究は、ProMab Biotechnologiesの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7-AAD生存率色素 Biolegend420404
ACEA Novocyte Flow CytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNAキャップ構造アナログNEBS1411S
DMEM、高グルコースGibco11965092
Dynabeads ヒトT活性剤CD3 / CD28ビーズGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA 合成キットNew England BioLabs (NEB)E2070S
ヒト IL-2 組換えタンパク質Gibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
ネオントランスフェクション装置InvitrogenMPK5000
ネオントランスフェクションシステム 100-μL KitInvitrogenMPK10096
ペニシリン-ストレプトマイシン (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 中程度Gibco11875135
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UltraPure フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigenceリアルタイム細胞解析(RTCA)装置AgilentRTCA MP
ZymoPURE II プラスミド MidiprepキットZymo ResearchD4201

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